Инструкция по лабораторной диагностике натуральной оспы (утв. Министерством здравоохранения СССР 25 февраля 1958 г.)

Методы лабораторной диагностики используют для дифференциации натуральной оспы от ветряной оспы, вакцины и некоторых кожных заболеваний.

I. Взятие материала для выделения вируса и серологических исследований

1. В качестве материала для исследования служат:

а) содержимое высыпаний на коже и слизистых - папул, везикул, пустул, а также корки и чешуйки;

б) отделяемое слизистой носоглотки;

в) кровь.

2. Для взятия материала* из пузырьков или папул их поверхность слегка смазывают 96° спиртом, после чего прокалывают у основания тонко оттянутым (тут же у горелки) капилляром пастеровской пипетки. Конец пипетки несколько наклоняют вниз, что облегчает сбор жидкости.

Если жидкость из узелка не выступает, скальпелем или пером осторожно соскабливают мягкую пульпу узелка. Может быть также собран соскоб со дна поврежденного или лопнувшего пузырька.

Собранный материал (везикулярная или пустулезная жидкость, корки, чешуйки, соскоб узелка) помещают в ампулы (емкостью 3 - 5 мл, которые тут же запаивают) или пробирки. Пробирки закрывают простерилизованными резиновыми пробками и заливают парафином либо запаивают (не перегревая!).

3. Отделяемое слизистой носоглотки собирают с помощью стерильных ватных тампонов. Тампоны опускают в пробирку, которую закрывают резиновой пробкой и заливают парафином, либо запаивают.

4. Для выделения вируса кровь берут из вены в пробирку с соблюдением правил асептики в количестве 1-2 мл. Собранную кровь, по возможности, немедленно разводят пополам дистиллированной водой.

5. Одновременно берут 3 - 5 мл крови для получения сыворотки, необходимой при серологических исследованиях.

Для серологического исследования можно пользоваться также разведенной сывороткой. В этом случае кровь берут с помощью иглы Франка и микропипетки из пальца в объеме 0,2 мл или 0,4 мл и помещают ее в пробирку, содержащую соответственно 1,8 мл или 1,6 мл физиологического раствора. Для освобождения от форменных элементов разведенную кровь центрифугируют 5 мин. при 1000 об/мин. или оставляют на ночь в рефрижераторе. Надосадочную жидкость - разведенную 1:20 или 1:10 сыворотку, переливают в ампулы, которые тут же запаивают.

II. Взятие материала для вирусоскопического исследования

Одновременно со сбором материала для выделения вируса и серологических реакций делают тонкие мазки везикулярной, пустулезной жидкости, содержимого папул и отделяемого слизистой носоглотки на 2-х обезжиренных предметных стеклах для вирусоскопического исследования. Мазки высушивают на воздухе. Стекла складывают так, чтобы они не соприкасались между собой стороной, на которую нанесен мазок. Во избежание этого между стеклами прокладывают узкие полоски бумаги.

Сложенные таким образом стекла завертывают в целлофан. При необходимости провести вирусоскопическое исследование у больных в стадии образования корок, мазок делают после того, как в лаборатории будет приготовлена суспензия последних.

III. Пересылка материала для исследования

Запаянные или закрытые пробирки и ампулы с материалом, а также завернутые в целлофан стекла с мазками помещают, перекладывая ватой, в металлическую коробку или пенал, шов между крышкой и корпусом коробки тщательно заклеивают липким пластырем и плотно упаковывают коробку в вату и целлофан. При необходимости пересылки материала коробку, завернутую в вату и целлофан, помещают в крепкий деревянный ящик. Ящик пересылают с нарочным. К посылке прилагают карточку с указанием фамилии и возраста больного, даты начала заболевания и даты взятия материала, а также характера материала для исследования. До момента исследования материал, собранный для выделения вируса и серологических исследований, желательно сохранять на холоду (при температуре +2° - +4°).

IV. Обработка материала и лабораторное исследование

1. Вирусоскопия - обнаружение элементарных телец Пашена окраской серебрением по Морозову.

Высушенный на воздухе возможно более тонкий мазок покрывают жидкостью Руге (реактив N 1), через 1 минуту жидкость сливают, препарат промывают дистиллированной водой и протравливают реактивом N 2 при подогревании до появления паров (1-2 минуты). После тщательной промывки водой мазок обрабатывают в течение 1-2 минут реактивом N 3 при легком подогревании, пока препарат не приобретет темно-коричневой окраски. Затем препарат вновь тщательно промывают дистиллированной водой, сушат на воздухе и рассматривают под микроскопом с помощью иммерсионной системы.

Тельца Пашена представляются в виде мелких (200 - 300 м) округлых образований темно-коричневого или черного цвета, расположенных поодиночке, парами, короткими цепочками и в виде скоплений. Результат считается положительным только при обнаружении характерных телец в массовом количестве.

Элементарные тельца возбудителя ветряной оспы (тельца Арагао) имеют вид очень мелких кокковидных образований, расположенных поодиночке, парами или в виде коротких цепочек. Очень характерны цепочки из трех звеньев. По величине (160 - 200 м в среднем 180 м) они заметно уступают тельцам Пашена, слегка полиморфны, встречаются почти только вне клеток и окрашиваются с большим трудом. Легче всего вирус ветряной оспы обнаруживается в прозрачном содержимом только что появившихся пузырьков.

В случае отрицательного результата исследование повторяют с материалом, собранным на другой день.

Окрашенные серебрением препараты можно исследовать и в темном поле. При этом способе вирусные элементарные тельца резко выделяются среди банальных гранул тканей своим белым цветом на насыщенно черном фоне.

Примечание. Импрегнированный серебром препарат под влиянием кедрового масла или других иммерсионных жидкостей на свету быстро выцветает. Поэтому препараты, предназначенные для длительного хранения, следует заключать в капельку теплого канадского бальзама (без ксилола) под тонким покровным стеклом.

Приготовление реактивов для окраски серебрением по Морозову

1. Реактив N 1 (жидкость Руге): 1 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл 40% формальдегида (продажный формалин) и 100 мл дистиллированной воды.

2. Реактив N 2: 5 г таннина, 100 мл дистиллированной воды и 1 мл жидкой карболовой кислоты.

Примечание: Следует применять только хорошие сорта таннина. Для испытания препарата на чистоту приготовляют раствор из 1 г таннина и 5 мл поды. Раствор не должен становиться мутным в течение 1 часа при прибавлении 10 мл 90° спирта (декстрин, камель), а также при последующем добавлении 5 мл эфира (сахар, соль).

3. Реактив N 3 (раствор аммиачного серебра). Растворяют 5 г кристаллического азотнокислого серебра в 100 мл дистиллированной воды. Из смеси в отдельный сосуд отмеривают 20 мл. К 80 мл раствора серебра по каплям добавляют крепкий (25%) раствор аммиака, пока образующийся желто-коричневый, а затем буро-черный осадок растворится и останется лишь легкая опалесценция. Если добавление аммиака вовремя не прекращено, то берут раствор азотнокислого серебра из оставшихся 20 мл и приливают его по каплям до появления легкой опалесценции. Для окраски реактив разбавляют дистиллированной водой 1:10. Раствор очень стоек, но его необходимо защищать от пыли и хранить в склянке с притертой пробкой.

Примечание: Реактив N 3 (раствор аммиачного серебра) при обработке им препарата не должен желтеть (выпадение осадка). Если это произошло, что может наблюдаться при недостаточной промывке после таннина, то раствор серебра сливают, препарат вновь прополаскивают дистиллированной водой и снова серебрят. Вообще во избежание осадков при изготовлении реактивов для окраски серебрением, а также при промывке препаратов следует пользоваться только дистиллированной водой или бидистиллированной водой.

2. Выделение вируса. Корки, чешуйки или соскоб тщательно растирают в стерильной фарфоровой ступке и добавляют стерильный физиологический раствор или дистиллированную воду в количестве, необходимом для получения суспензий в разведении 1:2 - 1:10.

Везикулярную или пустулезную жидкость используют для заражения куриных эмбрионов неразведенной или, в зависимости от количества материала, разведенной 1:2 - 1:10.

Разбавленная в момент взятия дистиллированной водой кровь не подвергается предварительной обработке. Если же кровь не была своевременно разбавлена дистиллированной водой, то образовавшийся сгусток тщательно растирают и разводят вдвое дистиллированной водой.

Тампоны с носоглоточным отделяемым смывают в пробирке 3 - 5 мл физиологического раствора или дистиллированной воды и полученный смыв исследуют на выделение вируса. Для этого куриные эмбрионы 11-12-дневного возраста просматривают на овоскопе в затемненной комнате и отбирают яйца с живым подвижным зародышем и хорошо развитой сетью кровеносных сосудов. На скорлупе каждого яйца простым карандашом отмечают границу воздушного мешка и местоположение эмбриона.

Заражение производят в специальном боксе со строгим соблюдением правил асептики. За 15 - 25 мин. до заражения эмбрионов в исследуемые материалы прибавляют пенициллин и стрептомицин. В везикулярную жидкость или кровь достаточно прибавить пенициллина из расчета 100 - 150 ед на 1 мл. В пустулезную жидкость, суспензию корок или смыв носоглоточного отделяемого следует добавить 200 - 400 ед пенициллина и 50 - 100 ед стрептомицина на 1 мл. На каждый материал используют 3 - 5 эмбрионов. Заражение куриных эмбрионов производится на хориоаллантоисную оболочку. Для этого скорлупа со стороны воздушного мешка смазывается 96° спиртом, слегка обжигается, затем протирается 2 - 2,5% раствором йода, и снова обжигается. Простерилизованными глазными ножницами срезается кружок скорлупы на 3 мм выше границы воздушного мешка. Очень осторожно (во избежание кровоизлияний) зубным пинцетом снимается часть подскорлупной оболочки и на хориоаллантоисную мембрану наносится 0,2 мл исследуемого материала. Отверстие в скорлупе закрывают стеклянным колпачком и края его заливают стерильной расплавленной смесью воска с парафином.

Инкубацию зараженных эмбрионов проводят при температуре 34,5° - 35° в течение 72 - 120 часов. Ежедневно зараженные эмбрионы просматривают на овоскопе, погибшие эмбрионы вскрывают. При вскрытии отмечают состояние эмбриона, наличие и характер поражений хориоаллантоисной оболочки (после ее промывания физиологическим раствором). Положительный результат выделения считают в том случае, когда на хориоаллантоисной оболочке обнаруживаются белые, резко отграниченные возвышающиеся точечные поражения, характерные для вируса натуральной оспы. При отсутствии поражений на хориоаллантоисной оболочке у эмбрионов в первом пассаже делается второй пассаж. Для этого извлеченные хориоаллантоисные оболочки измельчают в ступке и приготовляют их взвесь в физиологическом растворе из расчета 1:3 - 1:5. Суспензию центрифугируют 10 мин. при 2000 об/мин, надосадочную жидкость используют для следующего пассажа и исследования в реакции гемаглютинации.

При отсутствии специфических поражений в третьем пассаже, результат выделения признается отрицательным.

Как правило, выделение вируса на куриных эмбрионах удается осуществлять при различной тяжести заболевания (тяжелое, среднетяжелое, легкое и вариолоид). Наиболее четкие результаты отмечаются при исследовании, когда материалом служит везикулярная жидкость. В этом случае уже в 1-м пассаже поражения оболочки ярко выражены. Контрольные посевы жидкостей эмбрионов, зараженных этим материалом, на питательные среды в большинстве случаев являются стерильными. Несколько менее интенсивные поражения оболочки наблюдаются при использовании содержимого пустул и корок. В этом случае поражения, как правило, концентрируются лишь в месте инокуляции. При введении в эмбрионы суспензии корок довольно часто в первом пассаже отмечается бактериальное загрязнение. Для второго пассажа суспензию таких оболочек обрабатывают антибиотиками. При отсутствии бактериального загрязнения зараженные вирусом оспы эмбрионы в первых пассажах остаются живыми.

Как правило, выделение вируса на куриных эмбрионах из материала кожных поражений дает положительные результаты в 90 - 100% случаев. Выделение вируса из крови удается значительно реже, причем лишь в первые дни болезни и наиболее часто при тяжелых формах заболевания. Этот метод представляет, однако, ценность, поскольку позволяет поставить диагноз до момента появления кожных высыпаний.

Особенности и характер поражений, вызываемых вирусом натуральной оспы на хориоаллантоисной оболочке куриных эмбрионов (точечные, белые, резко отграниченные образования), отсутствие патогенности для эмбриона позволяет использовать этот метод для дифференциальной диагностики между оспой, генерализованной вакциной и ветряной оспой. Вакцина дает на эмбрионах расплывчатые беловатые, плоские фокусы поражений и вызывает гибель эмбрионов к 72 - 120 часам после заражения, а вирус ветряной оспы не вызывает поражений на хориоаллантоисной оболочке. В отличие от вируса вакцины, дающего уже при первичном заражении интенсивную гемаглютинацию (титр 80 и выше), гемаглютинирующая активность суспензий оболочек эмбрионов, зараженных вирусом натуральной оспы, выражена очень слабо или отсутствует в первых пассажах. В связи с этим реакцию гемагглютинации используют как дополнительный тест для дифференциации вируса натуральной оспы и вакцины.

Для исследования суспензий хориоаллантоисных оболочек в реакции гемагглютинации последняя ставится с высокочувствительными к агглютинирующему действию вируса вакцины эритроцитами петухов и кур. Постановка реакции осуществляется в объеме 1 мл. При этом двукратно падающие разведения испытуемых суспензий на физиологическом растворе (начиная с 1:5, 1:10) в объеме 0,5 мл соединяют с 0,5 мл 1% взвеси отмытых куриных эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют на 30 мин. при комнатной температуре. За гемагглютинирующий титр (1 агглютинирующую единицу) принимают конечное разведение суспензии, дающее отчетливо видимую глазом агглютинацию эритроцитов, при отсутствии склеивания эритроцитов в контроле (0,5 мл физиологического раствора и 0,5 мл взвеси эритроцитов).

При выделении вируса на куриных эмбрионах в сомнительных случаях для подтверждения его принадлежности к группе осповакициы применяют реакцию связывания комплемента. При этом в качестве антигена используют хориоаллантоисные оболочки первого или второго пассажа (см. дополнительные методы).

При отсутствии возможностей для выделения вируса на куриных эмбрионах для диагностики оспы используют пробу Пауля на кроликах (см. дополнительные методы).

3. Серологическое исследование - исследование сыворотки в реакции торможения гемаглютинации.

Определение тигра антигемаглютининов, начиная с 5-6 дня болезни, является ценным лабораторно-диагностическим методом распознавания натуральной оспы, в первую очередь, при заболевании невакцинированных или вакцинированных много лет тому назад, поскольку у этих лиц антигемаглютинины в сыворотке либо отсутствуют, либо титр их очень мал. Наличие даже относительно невысоких титров антигемаглютининов (80 - 160) в таких случаях указывает на заболевание оспой. Для уточнения диагноза проводят исследование сыворотки, взятой повторно через несколько дней после первой. При этом нарастание титра антигемаглютининов подтверждает диагноз. При взятии сыворотки для исследования следует учитывать, что максимальное нарастание антигемаглютининов отмечается у больных оспой в период между 12 - 15 днями болезни.

Перед постановкой реакции сыворотки прогревают в водяной бане при 56° в течение 30 мин. Реакцию торможения гемагглютинации ставят в объеме 1 мл с 4 агглютинирующими единицами вируса вакцины, культивированного на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона и 1% взвесью отмытых эритроцитов кур. Для этого разведения сыворотки, начиная с 1:10 или 1:20 в объеме 0,25 мл соединяют с рабочим разведением вируса в том же объеме. Смесь вируса с сывороткой выдерживают 40 мин. при комнатной температуре, после чего добавляют по 0,5 мл взвеси эритроцитов. Реакцию учитывают через 30 мин. после добавления эритроцитов. За титр сыворотки принимают ее конечное разведение, вызывающее полное подавленно агглютинации эритроцитов вирусом.

Дополнительные методы

В качестве дополнительных для лабораторной диагностики натуральной оспы могут быть использованы следующие методы:

1. Метод Пауля.

Производят по 3 поверхностных надреза длиной 0.5 см на обоих роговицах кролика, каждый параллельно глазной щели, и на каждую роговицу наносят по одной капле испытуемого материала (везикулярная или пустулезная жидкость, концентрированная взвесь корок или чешуек).

При наличии в материале жизнеспособного оспенного вируса на роговице вдоль линии надреза через 36 - 48 часов появляются специфические для оспы изменения: мелкие округлые прозрачные узелки высотой до 1 мм. Позднее, примерно еще через 36 - 48 часов, в центре узелков происходит слущивание эпителия, вследствие чего иногда возникают кратерообразные углубления.

При погружении удаленного глазного яблока в сублимат-алкоголь (4 г сулемы, 30 мл 96° этилового спирта, 90 мл дистиллированной воды) на месте прививочных надрезов через 1-2 минуты становятся видимыми круглые изолированные узелки, резко отличающиеся своим белым (как мел) цветом от окружающей здоровой прозрачной ткани (положительная реакция Пауля).

Прививка содержимым пузырьков при ветряной оспе не сопровождается описанными явлениями.

Отсутствие характерных изменений через 48 часов после прививки при тщательном исследовании роговицы с помощью лупы рассматривается как отрицательный результат пробы Пауля.

Отрицательный результат реакции не исключает заболевания оспой.

В случае недостаточно четкой реакции подвергают вирусоскопии секрет конъюнктивы и соскоб с патологически измененных участков роговицы.

2. Реакция связывания комплемента.

Для реакции связывания комплемента используют гипериммунную антивакцинальную сыворотку. Такую сыворотку получают путем иммунизации кроликов вирусом вакцины (внутрикожно, а затем внутрибрюшинно). Для контроля используют нормальную кроличью сыворотку. В качестве антигена служат жидкость из везикул и пустул, а также экстракт из корок. Помимо этого в качестве антигена может исследоваться отцентрифугированная 10% суспензия хориоаллантоисных оболочек эмбрионов от 1-3 пассажей.

В реакции употребляют обычную гемолитическую систему и комплемент.

Реакцию связывания комплемента проводят при +4° в течение 14 - 16 часов. При этом берут постоянное разведение антисыворотки (дающее заведомо положительный результат с наименьшей концентрацией известного вакцинального антигена) и исследуемый материал в различных разведениях. Постановку реакции сопровождают контролями на антикомплементарность антигена и антисыворотки.

Заместитель Министра здравоохранения СССР

В. Жданов

_____________________________

* Используемая для сбора материала посуда и инструментарий должны быть стерильны.