Инструкция по определению тиамина (витамина B1) в пищевых продуктах (утв. Главным санитарно-эпидемиологического управлением Минздрава СССР 10 июля 1987 г. N 4399-87)

Для определения тиамина в пищевых продуктах, обогащенных и не обогащенных этим витамином, используют флюорометрический метод. Он прошел широкую апробацию в различных лабораториях научных и практических учреждений, принимавших участие в подготовке справочных "Таблиц химического состава продуктов", рекомендован Междуведомственной комиссией по составлению этих таблиц и одобрен Минздравом СССР.

Принцип метода

Тиамин в щелочной среде под действием железосинеродистого калия количественно окисляется в тиохром, который в ультрафиолетовом свете обладает сине-голубой флюоресценцией (максимум возбуждения при 365 нм и максимум флюоресценции при 436 нм.). Интенсивность флюоресценции тиохрома прямо пропорциональна содержанию тиамина. Освобождение связанных форм тиамина достигают с помощью кислотного гидролиза и при воздействии протеолитических и фосфатазных ферментов. Мешающие флюорометрическому определению соединения удаляют обработкой изобутиловым спиртом или на колонках с ионообменными смолами.

Оборудование

Флюориметр ЭФ-3М или ФМ-Ц-2; потенциометр; термостат водяной на 37°С ; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г, поверочной ценой деления не более 0,5 мг; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 500 г, поверочной ценой деления не более 50 мг; водяная баня.

Посуда

Ступка с пестиком; воронки фильтровальные диаметром 5-7,5 см; колбы мерные вместимостью 100, 250 и 1000 ; колбы конические вместимостью 100 и 250 ; цилиндры мерные вместимостью 250 ; пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 . Бюретка с краном на 100 . Пробирки, цилиндры с притертыми пробками или делительные воронки вместимостью 25 .

Адсорбционные колонки, состоящие из спаянных между собой концами трубок различного диаметра и длины. Верхняя часть колонки имеет длину 9-10 см и диаметр 2,5 - 3,0 см, нижняя - длину 15 см и диаметр 0,7 см и заканчивается краном.

Реактивы

1. Тиамина хлорид гидрохлорид (Гос. фармакопея СССР, X изд., стр. 674).

2. Калий железосинеродистый х.ч.

3. Натрий гидроокись х.ч.

4. Спирт изобутиловый ч.д.а. с температурой кипения 108°С или спирт бутиловый ч.д.а. с температурой кипения 117°С. Проверяют спирты на отсутствие флюоресценции (измеряют флюоресценцию спирта в сравнении с дистиллированной водой). Если спирты обладают сильной флюоресценцией, то перед употреблением их очищают активированным углем или перегонкой на глицериновой бане.

5. Натрий уксуснокислый 3-х водный х.ч.

6. Кислота соляная х.ч.

7. Калий хлористый х.ч.

8. Аммиак водный ч.д.а.

9. Спирт этиловый, ректификат.

10. Ферментные препараты амилоризин П10х или пектаваморин П10х.

11. Катеониты КРС ЗпТ-40 размер частиц 0,5-1,0 мм или СДВ-ЗТ-40.

Приготовление реактивов

1. Стандартные растворы тиамина. Растворяют 0,1000 г тиамина хлорида, высушенного в эксикаторе над серной кислотой, в мерной колбе вместимостью 1000 и доводят до метки дистиллированной водой (раствор с массовой концентрацией 0,1 ). Раствор сохраняют на холоду в темном месте под слоем толуола. Срок хранения до 2-х месяцев. Помещают 1 мл этого раствора в мерную колбу вместимостью 500 , доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают (раствор с массовой концентрацией тиамина 0,2 ). Раствор готовят в день применения.

2. Раствор калия железосинеродистого 1%. Хранить в темном месте не более 2-х дней.

3. Раствор натрия гидроокиси 30%.

4. Окислительная смесь. К 2 мл 1% раствора калия железосинеродистого прибавляют 10 см 30% раствора гидроокиси натрия. Смесь пригодна к употреблению в течение 2-3 часов.

5. Раствор соляной кислоты 0,1 н.

6. Раствор уксусной кислоты 3%.

7. Насыщенный раствор уксуснокислого натрия.

8. Раствор калия хлористого 25% в 0,1 н растворе соляной кислоты.

9. Спиртовой раствор аммиака: 12 25% водного аммиака доводят до 100 70% этиловым спиртом.

Ход определения

Интервал определяемых концентраций тиамина составляет 0,1 - 0,4 раствора, поступающего на измерение флюоресценции. Величину навески продукта и последующие разведения рассчитывают исходя из интервала указанных концентраций.

Навеску мелкоизмельченной средней пробы продукта помещают в коническую колбу вместимостью 250 , приливают около 150 см 0,1 н раствора соляной кислоты и кипятят на водяной бане 40 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры, доводят рН гидролизата до 4,5 (потенциометрически) с помощью насыщенного раствора уксуснокислого натрия, добавляют 100 мг амилоризина, 0,5 толуола и помещают в термостат на 14 - 16 часов при 37°С. На следующий день гидролизат охлаждают, доводят объем в мерном цилиндре до 250 см дистиллированной водой и фильтруют. Если исследуемый объект содержит много жира, то навеску перед гидролизом обрабатывают серным эфиром; возможно, также обработать эфиром уже готовый гидролизат.

При анализе объектов, содержащих много пектиновых веществ (яблоки, крыжовник, смородина, тыква, кабачки и продукты их переработки) вместо амилоризина используют пектаваморин. При необходимости прервать анализ на 1-2 дня перед доведением объема до 250 гидролизат кипятят 5 мин., охлаждают, доводят объем до 250 и фильтруют. До проведения анализа фильтрат хранят в холодильнике в хорошо закрытой склянке. Очистку гидролизатов от соединений, мешающих флюориметрическому определению, проводят одним из двух способов. В случае исследования молочных продуктов, мяса, картофеля от флюоресцирующих примесей освобождаются путем встряхивания фильтратов с бутиловым или изобутиловым спиртом. Для этого в две делительные воронки вместимостью 100 наливают по 30 фильтрата от каждой навески, добавляют равный объем изобутилового спирта, встряхивают в течение 3 минут и дают слоям разделиться. После разделения нижний водный слой используют для определения.

При анализе круп, муки, бобовых, жареного мяса и печени, многих овощей, плодов и ягод очистку фильтратов проводят на адсорбционных колонках следующим образом. В нижнюю часть адсорбционной колонки помещают комочек стеклянной ваты и над ним - адсорбент. Набухший катионит переносят в колонку, в которую предварительно на 1/3 ее объема заливают воду, чтобы исключить попадание пузырьков воздуха в пространство между частицами катеонита. Высота столбика катеонита должна быть 10 - 12 см. Необходимо помнить, что над слоем адсорбента все время должна находиться жидкость. Для перевода катеонита в Н-форму перед пропусканием фильтрата через колонку с адсорбентом пропускают 20 3% уксусной кислоты, нагретой до 60-70°С. Затем в две адсорбционные колонки вносят по 20 фильтрата от каждой навески и в две колонки по 20 стандартного раствора тиамина с массовой концентрацией 0,2 . После того, как весь фильтрат пройдет через колонку (скорость пропускания 15 капель в минуту), адсорбент промывают 2 - 3 раза дистиллированной водой, порциями по 10 . Элюцию тиамина с адсорбента проводят горячим 25% раствором хлористого калия в 0.1 н растворе соляной кислоты. Для этого в колбу отмеривают 20 элюирующего раствора, подогревают его до 60 - 80°С и пропускают через колонку порциями по 5-6 (элюирующий раствор необходимо подогревать несколько раз). Элюат собирают в мерные цилиндры и, если объем будет несколько меньше, его доводят водой до 20 . Катеонит после регенерации может быть использован повторно.

Регенерацию катеонита проводят 30 доведенного до кипения спиртового раствора аммиака, после чего пропускают дистиллированную воду и перед повторным употреблением 3% уксусную кислоту. Такой обработки катионита бывает недостаточно после пропускания фильтратов, содержащих много естественных пигментов (при анализе ягод и фруктов). Поэтому для удаления из катионита органических примесей в колонку приливают 10% NaOH, оставляют его в контакте с катеонитом на 20 - 25 минут. После этого раствор удаляют из колонки, к катеониту приливают новую порцию раствора щелочи. Такую обработку проводят до исчезновения окраски щелочи. Затем катеонит промывают водой до нейтральной реакции. Перед адсорбцией тиамина катеонит переводят в Н-форму, как указано выше.

Окисление тиамина в тиохром

В три пробирки с притертыми пробками отмеривают по 5 элюата, полученного после пропускания через колонку испытуемого раствора. Затем в два стаканчика с элюатами добавляют по 1,2 окислительной смеси и в третий - 1,2 30% раствора гидроокиси натрия (контроль). Все пробирки энергично встряхивают, прибавляют по 10 см 3 изобутилового спирта и снова энергично встряхивают в течение 3-х минут для извлечения тиохрома. Водный и спиртовой слои разделяют центрифугированием или отстаиванием в темном месте. Таким же образом поступают с полученным после пропускания через колонку элюатом рабочего стандартного раствора тиамина. После разделения спиртового и водного слоев сливают верхний спиртовой слой в кюветы для измерения интенсивности флюоресценции. Интенсивность флюоресценции тиохрома измеряют на флюориметре со светофильтрами для витамина , начиная с проб стандартного раствора тиамина. Содержание тиамина (мг на 100 г продукта) вычисляют по формуле:

, где

А - Среднее из показаний флюориметра для испытуемого образца; - Показания флюориметра для контрольного опыта к испытуемому образцу; V - Общий объем гидролизата (в ); К-концентрация тиамина в стандартном растворе, взятом для измерения интенсивности флюоресценции; - среднее из показаний флюориметра для стандартного раствора тиамина; - среднее из показаний флюориметра для контроля на реактивы; - объем испытуемого раствора (), взятый для окисления тиамина в тиохром; а - навеска (г); 10 - коэффициент пересчета из мкг/г в мг/100 г продукта.

Зам. начальника Главного Санитарно-эпидемиологического Управления Минздрава СССР

А.И. Заиченко