Приложение 1. Исследование рыбы на зараженность плероцеркоидами дифиллоботриид (возбудителями дифиллоботриозов) и определение жизнеспособности личинок

Приложение 1

Исследование рыбы на зараженность плероцеркоидами дифиллоботриид (возбудителями дифиллоботриозов) и определение жизнеспособности личинок

Диагностические признаки плероцеркоидов

Плероцеркоиды лентеца широкого (D. latum) локализуются в полости тела, икре, внутренних органах, мышцах обычно без капсул (в основном у щуки, налима, окуня, ерша). Длина живых плероцеркоидов от 1 мм до 2,5 см и более. Личинки беловато-молочного цвета. Характерно наличие на теле личинок глубоких складок (ложная сегментация), которые сохраняются даже после расслабления в воде. Сколекс у плероцеркоидов, только что извлеченных из рыбы, обычно втянут (инвагинирован), и личинка имеет булавовидную форму, но при помещении ее в теплую воду сколекс вскоре вытягивается (при этом становятся хорошо заметны и присасывательные щели) и перистальтически сокращается. Личинка активно движется, то сокращаясь, то сильно вытягиваясь. Сколекс при этом приобретает вид удлиненного, заостренного на конце конуса.

Установить наличие сколекса у личинок очень важно, так как иногда за плероцеркоидов могут быть приняты фрагменты их или других цестод. Исследование живых плероцеркоидов проводят с помощью лупы и микроскопа.

Плероцеркоида помещают на предметное стекло в каплю воды или физиологического раствора, накрывают покровным стеклом и исследуют вначале под малым, а затем под большим увеличением микроскопа.

Для личинок лентеца широкого характерна толстая (до 22 мкм) кутикула, лишенная ворсинок на теле и сколексе. Субкутикулярная "светлая" зона (пространство между кутикулой и зоной сплошного расположения известковых телец) у личинок лентеца широкого узкая, не шире толщины кутикулы. Характерно также наличие желез проникновения не только в сколексе, но и в теле личинки; субкутикулярная мускулатура однослойная (что хорошо выявляется на поперечных срезах).

При установлении видовой принадлежности плероцеркоидов используют также способность личинок к осморегуляции. Для этого извлеченного из физиологического раствора плероцеркоида быстро промывают в воде и помещают в чашку Петри с водой. Плероцеркоиды лентеца широкого выживают в воде около суток. Продолжительность жизни плероцеркоидов других видов короче (см. ниже).

Плероцеркоиды лентеца чаечного (D. dendriticum) обычно располагаются в капсулах диаметром 3-10 мм на стенках и в толще стенок пищевода и желудка, иногда на других органах и в мышечной ткани (в основном, у сиговых и лососевых рыб). Не образуется анатомически выраженных капсул при локализации личинок в икре, а у рыб некоторых видов (например, у сибирской ряпушки) наряду с плероцеркоидами в капсулах встречаются личинки, свободно залегающие в полости тела. Личинки кремового или желтоватого цвета. Развитые плероцеркоиды длиной 1-10 см, а отдельные особи - до 25 см. Тело имеет глубокие складки, которые при расслаблении личинок исчезают. У живых сокращенных плероцеркоидов сколекс втянут, выступающие вперед участки тела образуют у головного конца подобие "плечей". В теплом физиологическом растворе личинки столь же активны, как и плероцеркоиды лентеца широкого. По краям ботридиальных листков заметны характерные втяжения, то есть, эти края приобретают фестончатый вид. При микроскопировании живых личинок на кутикуле видны редкие короткие ворсинки, которые на сколексе едва заметны.

Субкутикулярная зона широкая, в 1,5-3 раза шире кутикулы. Из гистологических признаков характерны: а) субкутикулярная мускулатура представлена 1-2 (редко 3) слоями; б) железы проникновения не распространяются за пределы сколекса. В воде личинки лентеца чаечного выживают до 2,5 часов, молодые плероцеркоиды - не более 1 часа. У расслабленных личинок тело лишается складок, сколекс приобретает миндалевидную форму, ботридиальные щели широко раскрываются, тело становится полупрозрачным.

Кроме описанных плероцеркоидов, у рыб встречаются личинки других видов лентецов, не имеющих эпидемиологического значения, но похожих на первых. Из них наиболее распространены плероцеркоиды D. ditremum. Они встречаются преимущественно у лососевых (ряпушка и др.) и корюшковых рыб, в мелких (1-3 мм диаметром) капсулах на пищеводе и желудке. В воде выживают не более 5-7 минут.

Методика исследования рыбы

Санитарно-гельминтологической экспертизе подлежат виды рыб, являющиеся дополнительными хозяевами дифиллоботриид.

На зараженность исследуют щук, налимов, окуней, ершей, также лососевых, хариусовых, корюшковых рыб (лосось, озерная форель, омуль, пелядь, чир, сиг, муксун, тугун, нельма, кета, нерка, кумжа, таймень, голец, хариус, корюшка).

Рыбу исследуют свежевыловленную. Перед вскрытием рыбу отмывают от слизи, протирают, взвешивают и измеряют ее длину. Для определения возраста берут: у щук - чешую впереди от спинного плавника выше боковой линии; у окуней, кроме того, - жаберные крышки, у налимов - только отолиты. Очищенную чешую помещают в чешуйную книжку из бумаги - от каждой рыбы на отдельный лист, на котором отмечают номер рыбы, вид, время, место отлова и число найденных плероцеркоидов.

Рыбу можно вскрывать в большой эмалированной кювете, но лучше это делать на широкой гладкой доске. При вскрытии рыбы рекомендуется придерживаться определенной последовательности. Сначала делают короткий надрез вперед от анального отверстия, в надрез вводят тупой конец ножниц и разрезают рыбу вдоль по средней линии брюшка. Разрез продолжают до угла нижней челюсти. Затем делают дугообразный разрез, вырезают левую брюшную стенку, отделяют ее, после чего полость тела и внутренние органы внимательно осматривают, извлекая свободно лежащих плероцеркоидов.

Накладывают лигатуры на кишечник близ анального отверстия и на пищевод в его начальном отделе, чтобы не повредить пищеварительный тракт. Извлекают затем внутренние органы. Вырезают яичники и семенники, помещая их в отдельные чашки Петри. Так же поступают и с другими исследуемыми органами. Кровь из полости тела собирают в чашку Петри и просматривают. Плавательный пузырь осматривают снаружи, затем изнутри. Почки, лежащие вдоль позвоночника, соскабливают тупым инструментом, собирают в чашку Петри и исследуют компрессорным методом. Вырезают и осматривают сердце, делая при необходимости разрезы. Осматривают также сердечную полость. Содержимое, оставшееся в полости тела, собирают и исследуют компрессионно. Полость тела протирают марлевой салфеткой, одновременно соскабливают париетальную брюшину.

Затем приступают к исследованию извлеченных внутренних органов. Сначала отделяют печень и исследуют ее. Особое внимание уделяют осмотру жировой ткани, окружающей желудочно-кишечный тракт и другие органы. Жировую ткань отделяют от органов, одновременно осматривая ее и удаляя плероцеркоидов. Освобожденный от жировой ткани пищеварительный тракт осматривают, отыскивая плероцеркоидов, просвечивающих через серозные покровы.

Пилорические придатки (развитые у лососевых, налима и др.) расслаивают и осматривают снаружи. Стенку желудка и пищевода после наружного осмотра исследуют послойно. Мелких плероцеркоидов обычно находят под бинокуляром (МБС-1, 2, 9).

Жировую ткань исследуют компрессионно между двумя стеклами на темном фоне или в полупроходящем свете. Поджелудочную железу сначала разрезают на тонкие пластинки. Селезенку режут на тонкие пласты и исследуют компрессионным методом. Также исследуют сердце.

Печень осматривают снаружи, затем делают косые разрезы. Исследовать печень следует особенно внимательно у налима, так как молочно-белый цвет печени затрудняет обнаружение личинок.

Яичник разрезают, содержимое соскабливают и компрессируют. При исследовании крупных икринок применять компрессию необязательно, достаточно их разъединить.

После просмотра внутренних органов приступают к исследованию мускулатуры. С рыбы снимают кожу и осматривают ее внутреннюю сторону, а часть мышц, отделившихся с кожей, разрезают на пластинки или соскабливают и компрессируют. Мышцы исследуют полностью, разрезая их в косом направлении на пластинки толщиной не более 3-5 мм.

Определение жизнеспособности плероцеркоидов

Определение жизнеспособности плероцеркоидов проводят при оценке эффективности обеззараживания рыбы. Извлеченные из органов и тканей рыбы плероцеркоиды могут быть неподвижными. Их помещают в подогретый физиологический раствор или желудочный сок, осторожно раздражая личинку препаровальной иглой. Даже слабые движения плероцеркоидов свидетельствуют о жизнеспособности личинок. Изменение цвета плероцеркоидов, отслоение кутикулы, деструктивные изменения тела указывают на нежизнеспособность личинок.

При проверке эффективности обеззараживания рыбы можно применять метод окрашивания живых плероцеркоидов водным раствором нейтральрота в разведении 1:20 000 - 1:50 000 в течение 30-40 минут. Затем рыбу с плероцеркоидами обеззараживают одним из указанных в инструкции методов, проверяя через определенное время жизнеспособность личинок. Обесцвечивание личинок, ранее окрашенных нейтральротом в розовый цвет, является одним из показателей их гибели.

Оборудование, необходимое для вскрытия рыбы и определения жизнеспособности плероцеркоидов

Столы лабораторные, табуреты, лампа настольная, шнур-удлинитель, клеенка простая, клеенка полиэтиленовая, весы с гирями и разновесами, доски разделочные, стекло толстое, кюветы и лотки эмалированные, линейка или лента сантиметровая, микроскопы МБИ, бинокулярные лупы (МБС-1, 2 или 9), лупа ручная, микрометр, ножи, брусок для заточки ножей, ножницы большие и малые, скальпели, пинцеты анатомические, чашки Петри, стекла предметные и покровные, стекла для компрессии 9х12 и 6х9 см, пипетки глазные, воронки, мерная посуда (мензурки, стаканы), банки большие с притертыми пробками, пробирки и пенициллиновые флаконы с корковыми или резиновыми пробками, соль поваренная, формалин, физиологический раствор, желудочный сок, нейтральрот, бумага черная, вата, марля, фартуки клеенчатые, перчатки резиновые, полотенца для рук и посуды, мыло туалетное и хозяйственное, порошок стиральный, тазы, ведра, дезинфицирующие растворы.

Учет результатов

При учете результатов исследований рыбы на зараженность плероцеркоидами лентецов в лабораторном журнале должны быть отражены следующие данные и показатели: административная территория (АССР, край, область, район, населенный пункт), водоем, какой организацией доставлена рыба для исследований, дата, вид рыбы, длина, масса, возраст, число обнаруженных плероцеркоидов (в полости тела и внутренних органах, кроме яичников; в яичниках, в мускулатуре, всего), вид плероцеркоидов (в необходимых случаях - описание личинок).