Приложение 2. Исследование рыбы на зараженность метацеркариями описторхиса (возбудителем описторхоза) и определение жизнеспособности личинок

Приложение 2

Исследование рыбы на зараженность метацеркариями описторхиса (возбудителем описторхоза) и определение жизнеспособности личинок

Диагностические признаки метацеркариев

В организме дополнительного хозяина описторхиса - рыб семейства карповых, развиваются личинки гельминта - метацеркарии, которые локализуются в подкожной клетчатке и мышцах рыбы, преимущественно вдоль ее средней линии на спинной стороне. Значительно реже метацеркарии паразита обнаруживаются в плавниках, жабрах, глазах, чешуе.

Зрелые метацеркарии описторхиса представляют собой цисту овальной формы, внутри которой находится в согнутом состоянии личинка гельминта. Оболочка цисты двойная: наружная - соединительно-тканная, образована за счет тканей хозяина, внутренняя - тонкая, образована секретом паразита.

Внутри цисты личинка описторхиса подвижна и периодически совершает маятникообразные или "переливающиеся" движения, хорошо заметные при наблюдении под бинокуляром или обычным световым микроскопом в течение 1-2 минут.

Личинка гельминта покрыта шипиками, снабжена ротовой и брюшной присосками. В задней части ее тела расположен экскреторный пузырь темного цвета, хорошо видимый под бинокуляром МБС при увеличении в 16 раз. Циста имеет размеры 0,23-0,37 х 0,18-0,28 мм; длина личинки (без цисты) - 0,44-0,63 мм, размеры присосок - 0,07-0,08 х 0,06-0,07 мм.

Перечисленные в инструкции (см. п. 3) виды рыб семейства карповых могут являться дополнительными хозяевами для других видов трематод, не имеющих эпидемиологического значения, метацеркарии которых следует отличать от метацеркариев описторхиса (см. методику определения возбудителей гельминтозоонозов в пресноводных рыбах, утв. главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 21.03.1983 г., N 115-6а).

Методы исследования рыбы

Для обнаружения метацеркариев в тканях рыбы используют компрессионный метод или метод переваривания. Более точные результаты будут получены при исследовании всей поверхностной мышечной ткани рыбы, которая тщательно отделяется вместе с подкожно-жировой клетчаткой от кожи и плавников.

Компрессионный метод. Для компрессионного исследования с целью экономии времени допустимо исследовать по 5 проб мышц с подкожной клетчаткой с обеих сторон рыбы: по 3 пробы из спинной и 2 из брюшной части мышц с каждой стороны. Каждая проба мышц берется с площади 1-2 на глубине 2-3 мм.

Мышечную ткань, подлежащую исследованию, измельчают и порциями по 1-1,5 г раскладывают либо в компрессории, либо между двумя стеклами размером 6-8 х 12-15 см. При исследовании вяленой, соленой, копченой рыбы рекомендуется ее предварительно сутки вымачивать в воде.

Готовые компрессионные препараты просматривают под бинокуляром при увеличении в 16 раз. Число найденных метацеркариев подсчитывают. При необходимости метацеркариев выделяют из окружающей ткани с помощью препаровальных игл.

Методы переваривания. Для метода переваривания вся поверхностная мышечная ткань (до 0,5 см) отделяется от кожи, тщательно измельчается ножом или в мясорубке.

Мышечную ткань рыбы заливают в соотношении 1:10 искусственным желудочным соком (11 мл концентрированной соляной кислоты, 7 г пепсина, 9 г поваренной соли на 1 л дистиллированной воды). Пробу помещают в термостат на 3 часа при температуре 36-37°С, после чего содержимое фильтруют в стеклянные цилиндры через металлический фильтр с размером ячеек 1х1 мм. Через 15-20 минут верхний слой желудочного сока с переваренной мышечной тканью сливают, а осадок переносят в чашку Петри или на часовое стекло, где метацеркариев подсчитывают.

Для лучшего отделения личинок в чашку Петри наливают физиологический раствор, делают несколько круговых движений, в результате которых метацеркарии концентрируются в центре чашки Петри, а излишки физраствора с остатками мышечной ткани удаляют пипеткой.

Метод выделения метацеркариев в искусственном желудочном соке применим в полевых условиях. При этом вместо термостата можно использовать стерилизатор для кипячения медицинских инструментов, в который помешают банки с пробами, наливают воду температурой 36-37°С и поддерживают такую температуру в течение 3-х часов. Для приготовления искусственного желудочного сока в полевых условиях реактивы разводят дождевой водой. При использовании речной воды ее сначала отстаивают, а затем фильтруют.

Эффективность метода переваривания (в сравнении с компрессионным) в 1,5 раза выше. Метацеркарии, выделенные методом переваривания из свежей рыбы, сохраняют свою структуру и жизнеспособность. Кроме рыбы промысловых размеров, в ряде случаев, с целью эпидемиологического изучения территории возникает необходимость исследования на пораженность метацеркариями описторхиса мальков (сеголетков) карповых рыб. При этом применяют компрессирование мальков целиком.

Учет результатов. Пораженность рыбы метацеркариями описторхисов (экстенсивность инвазии) вычисляют по формуле:

, где:

P - общая пораженность в процентах; n - число зараженных экземпляров рыб; N - число исследованных экземпляров рыб.

Интенсивность инвазии (среднее число метацеркариев в 1 экз.) определяют по формуле:

, где:

- средняя интенсивность инвазии на 1 инвазированную рыбу; m - общее число найденных метацеркариев; - число инвазированных экз. рыб.

Количество метацеркариев в весовой единице исследованных проб (J) определяют делением числа всех найденных в пробе личинок (m) на массу пробы (M), т.е. по формуле:

Для облегчения подсчета большого количества личинок можно использовать кювету из оргстекла размером 60х60х15 мм, дно которой разделено на 900 квадратов величиной 2х2 мм. Выделенных метацеркариев (с небольшим количеством физиологического раствора) переносят в кювету и равномерно распределяют по поверхности дна. После этого производят их подсчет, при этом метацеркарии учитываются только в квадратах, расположенных по диагонали, затем производится пересчет на общее число клеток кюветы. Ошибка этого способа не превышает 4%.

Определение жизнеспособности метацеркариев

Дня определения жизнеспособности метацеркариев описторхиса имеется ряд методов.

Морфологический метод. Выделенные из ткани рыбы метацеркарии переносятся в каплю физраствора на предметное стекло, осторожно накрывают покровным стеклом и исследуют сначала под малым, а затем под большим увеличением микроскопа. Признаком гибели личинок являются только грубые изменения структуры, явное нарушение целостности оболочек цисты, зернистый распад ее содержимого; разрушение экскреторного пузыря. Менее выраженные признаки деструкции (изменение формы цисты, изменение цвета и т.д.) не могут служить основанием для признания метацеркариев мертвыми.

Метод определения подвижности личинки. Метацеркарии описторхиса обладают способностью двигаться внутри цисты. Движения усиливаются при механическом (надавливание) или термическом (подогревание) раздражении личинки. Наличие даже самых слабых самостоятельных движений свидетельствует о жизнеспособности метацеркария, в то же время их отсутствие еще не говорит о гибели личинки.

Для провокации двигательной активности метацеркариев используют химические раздражители. На выделенных из окружающих тканей метацеркариев наслаивают несколько капель (так, чтобы полностью покрыть личинок) химического реагента. Для ускорения эксцистирования личинки можно подогреть над пламенем спиртовки или же подогреть до 36°С жидкость перед наслаиванием:

а) Воздействие желчью. Метод воздействия дуоденальным содержимым или желчью, полученной при зондировании человека, приводит к эксцистированию 87% всех личинок;

б) Воздействие трипсином. При воздействии 0,5-процентным раствором трипсина, приготовленного на физрастворе, уже через 10-15 секунд начинается выход личинок и их активное движение, которое сохраняется при температуре 36-37°С от нескольких минут до нескольких часов. При этом эксцистируется до 97% всех личинок.

Объективным критерием жизнеспособности личинок при применении химических раздражителей являются те или другие проявления двигательной активности личинок. Отсутствие в течение 10-15 минут всякой двигательной реакции и пожелтение метацеркариев свидетельствует о нежизнеспособности личинок.

Перечень необходимого оборудования

Лабораторные столы, табуреты, микроскоп световой, микроскоп стереоскопический (бинокуляр) МБС-1, 2 или 9, термостат, лабораторные весы с разновесами, скальпели, пинцеты, ножницы, иглы препаровальные, компрессории или стекла для компрессии (8-9 х 10-12 см), стекла предметные, стекла покровные, мерная посуда (мензурки, цилиндры, стаканы), пипетки химические, пипетки глазные, вата, марля, кюветы эмалированные, банки или ведра для отходов, дезинфицирующие средства, сетка металлическая, воронки, чашки Петри, часовые стекла, спиртовка, искусственный желудочный сок, 0,5%-ный раствор трипсина, физиологический раствор.

Учет результатов

При учете результатов исследования рыбы на зараженность метацеркариями описторхиса в лабораторном журнале должны быть отражены следующие данные и показатели: место, откуда доставлена рыба для исследования, дата поступления, организация, доставившая рыбу, вид рыбы, возраст, длина, общая масса, масса мышечной ткани, вес средней пробы, число обнаруженных метацеркариев описторхиса, их жизнеспособность.