Методические указания МУК 4.1.2204-07 "Обнаружение, идентификация и количественное определение охратоксина А в продовольственном сырье и пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 20 мая 2007 г.)

Методические указания МУК 4.1.2204-07
"Обнаружение, идентификация и количественное определение охратоксина А в продовольственном сырье и пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 20 мая 2007 г.)

Дата введения: 1 августа 2007 г.
Введены впервые

1. Назначение и область применения

Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определения охратоксина А в продовольственном сырье и пищевых продуктах и предназначены для проведения лабораторных исследований учреждениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в организациях, осуществляющих контроль безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов.

2. Общие положения

Охратоксин А - микотоксин, продуцируемый микроскопическими грибами родов Aspergillus и Penicillium. Основными продуцентами охратоксина А являются A. ochraceus и P. verrucosum.

Охратоксин А ( молекулярная масса 403,8), представляющий собой по химической структуре 5-хлоризокумарин, связанный пептидной связью с L-фенилаланином, хорошо растворим в полярных органических растворителях и водном растворе гидрокарбоната натрия, малорастворим в воде. При фотометрировании раствора охратоксина А в толуол-уксусной кислоте (99:1) максимум поглощения наблюдается при длине волны, равной 333 нм, при этом относительный молярный коэффициент поглощения равен 544 

В экспериментах in vivo показано нефротоксическое, канцерогенное, тератогенное, эмбриотоксическое, нейротоксическое и иммунотоксическое действие охратоксина А. Международное агентство по изучению рака классифицирует охратоксин А как соединение, потенциально канцерогенное для человека (Группа 2В). Комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам и контаминантам установлена величина условно переносимого недельного поступления охратоксина А с пищей - 100 нг/кг массы тела.

Охратоксин А выявляется повсеместно в качестве природного загрязнителя продовольственного и кормового зерна, кофе и какао-бобов, винограда и специй.

3. Принцип метода

Метод включает следующие этапы:

- экстракция охратоксина А из пробы смесью ацетонитрил-вода (60:40% об.);

- очистка экстракта на иммуноаффинной колонке;

- определение охратоксина А с помощью ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием при длине волны возбуждения 333 нм и длине волны эмиссии 466 нм.

Диапазон определяемых концентраций: 0,0001-0,016 мг/кг.

Предел количественного определения: 0,0005 мг/кг.

Таблица

Метрологические характеристики метода, установленные для разных концентраций охратоксина А в пробе

Метрологические характеристики	Концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг
	0,0001-0,001	>0,001
Границы относительной погрешности (показатель точности) ,%, Р = 0,95
Стандартное отклонение повторяемости , %	24,56	8,78
Предел повторяемости (r), %	68,77	24,58
Полнота извлечения веществ, %	88,80	86,28

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, реактивы и материалы

4.1. Средства измерений

Система ВЭЖХ, состоящая из насоса высокого давления, инжектора типа Rheodyne-7125 с объемом петли-дозатора 50 мкл, спектрофлуориметрического детектора, обеспечивающего возбуждение флуоресценции в спектральной области 330-340 нм и регистрацию эмиссии флуоресценции при длине волны 466 нм и системы для сбора и обработки данных типа Мультихром (Амперсенд, Россия) или аналогичной, хроматографической колонки (250х4,6 мм), заполненной силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом с размером частиц 5 мкм (например, Kromasil С18 (MetaChem Texnologies, США)
Весы аналитические
Микрошприц на 100 мкл для ВЭЖХ
Дозатор пипеточный, 1-5
Дозатор пипеточный, 100-1 000 мкл
Дозатор пипеточный, 10-100 мкл
Цилиндры мерные с притертой пробкой вместимостью 100 тип 2-100 и 2-250
	ГОСТ 1770-74

4.2. Вспомогательное оборудование

Спектрофотометр
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С или аналогичный	ТУ 64-1-2451
Ротационный испаритель ИР-1М с ловушкой или аналогичный	ТУ 25-11917
Электрошкаф сушильный лабораторный с погрешностью поддержания температуры в интервале от 50 до 350°С	ТУ 16-531.639
Холодильник бытовой	ГОСТ 16317
Мельница лабораторная электрическая ЭМ-3А или аналогичная	ТУ 46-22-236-79
рН-метр
Магнитная мешалка типа ММ 5 с перемешивающим стержнем	ТУ 25-11.834-80
Колбы плоскодонные конические на 250 с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32	ГОСТ 10394-74
Флаконы стеклянные завинчивающиеся из темного стекла (вайл), объемом 7
Колбы мерные, вместимостью 100, 500, 1 000 тип 2-100-2, 2-500-2	ГОСТ 1770-74
Воронки лабораторные	ГОСТ 25336
Колбы грушевидные на 10 с НШ 14,5, тип ГрКШ-10-14/23	ГОСТ 10394-72

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 10394-72 постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670 с 1 января 1984 г. введен в действие ГОСТ 25336-82

4.3. Реактивы и материалы

Стандарт охратоксина А, фирма "Sigma", кат. N О-1877
Фильтры обеззоленные "синяя лента"	ТУ 6-09-1678
Натрий фосфорно-кислый двузамещенный, 12-водный, чда	ГОСТ 4172-76
Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, 2-водный, чда	ГОСТ 245-76
Натрий хлорид, хч	ГОСТ 4233-77
Ацетонитрил, осч, сорт 0
Метанол, осч	ГОСТ 6995-77
Кислота фосфорная, осч	ТУ 2612-014-00203677-97
Кислота уксусная ледяная, хч	ГОСТ 61-75
Толуол, чда	ГОСТ 5789-78
Иммуноаффинные колонки Ochraprep
(R-Biopharm, Великобритания)

5. Подготовка к выполнению измерений

5.1. Приготовление стандартных растворов охратоксина А

Для приготовления стандартного раствора хранения (концентрация охратоксина А - 10 нг/мкл) навеску кристаллического охратоксина А массой 5 мг помещают в мерную колбу объемом 500 , приливают 50 смеси толуол-уксусная кислота (98:2% об.), тщательно перемешивают до полного растворения вещества и доводят той же смесью растворителей до метки. Для установления точной концентрации раствора хранения измеряют его оптическую плотность при длине волны 333 нм . Концентрацию раствора вычисляют по формуле:

, нг/мкл

Далее 5 стандартного раствора охратоксина А с концентрацией 10 нг/мкл разбавляют смесью толуол - уксусная кислота (98:2% об.) до объема 100 , получая рабочий раствор с концентрацией 0,5 нг/мкл.

Для приготовления рабочих растворов охратоксина А с концентрацией 0,005; 0,05 и 0,1 нг/мкл отбирают соответственно 50, 500 и 1 000 мкл раствора с концентрацией 0,5 нг/мкл, упаривают досуха и растворяют в 5 подвижной фазы.

Раствор хранения охратоксина А содержат в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном прохладном месте (при температуре около 0°С) до одного года и используют для приготовления рабочих стандартных растворов. Рабочие стандартные растворы хранят в вайлах из темного стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0°С) в течение 1 месяца.

Перед использованием рабочих стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только после этого следует открывать пробки.

5.2. Приготовление фосфатного буферного раствора, pH = 7,4

Навеску натрия фосфорно-кислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 , добавляют 10-20 дистиллированной воды. Перемешивают и доводят объем раствора в колбе до метки. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.

5.3. Приготовление смесей растворителей

Толуол-уксусная кислота (98:2% об.).

В мерную колбу на 1 000 вносят 20 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят толуолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил-вода (60:40% об.).

В мерную колбу на 1 000 вносят 600 ацетонитрила и, перемешивая, доводят водой до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил-вода (60:40% об.; pH = 3,0).

В мерную колбу на 1 000 вносят 600 ацетонитрила и, перемешивая, доводят бидистиллированной водой до метки. Внесением фосфорной кислоты подводят pH смеси до величины, равной 3,0. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Метанол - уксусная кислота (98:2% об.).

В мерную колбу на 1 000 вносят 20 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят метанолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

6. Отбор и подготовка проб для анализа

6.1. Отбор проб

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией:

- "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб" ГОСТ 13586.3-83;

- "Крупа. Правила приемки и методы отбора проб" ГОСТ 26312.1-84;

- "Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб" ГОСТ 27668-88;

- "Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию" ГОСТ 8756.0-70.

Пробы для анализа, представительные по концентрации микотоксинов для всей партии, следует отбирать из предварительно гомогенизированного среднего (исходного) образца массой 2 кг.

6.2. Подготовка проб для анализа

Отобранные пробы измельчают в течение 1-2 мин в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы.

6.2.1. Экстракция

Навеску 25 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 , добавляют 100 смеси ацетонитрил-вода (60:40% об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр "синяя лента". Отбирают 10 фильтрата и добавляют 90 фосфатного буферного раствора, pH = 7,4.

6.2.2. Очистка экстракта

На иммуноаффинную колонку наносят 100 мл полученной смеси со скоростью 1-2 капли в секунду, промывают 20 фосфатного буферного раствора, pH = 7,4. Охратоксин А элюируют 3 смеси метанол-уксусная кислота (98:2% об.).

7. Выполнение измерений

7.1. Приготовление тестового образца

Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 400 мкл подвижной фазы (раствор А).

7.2. Условия хроматографирования

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза - ацетонитрил-вода (60:40% об.; pH = 3,0); скорость подвижной фазы - 1,5 .

Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 333 нм, на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 466 нм.

Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 50 мкл тестового образца (раствора А). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с охратоксином А, рассчитывают массу охратоксина А во вколе с помощью градуировочного графика.

8. Обработка результатов измерения

8.1. Построение градуировочной зависимости

Для построения градуировочного графика проводят хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В инжектор с помощью микрошприца вводят 50 мкл рабочего раствора стандарта с концентрацией 0,005 нг/мкл, что соответствует 0,25 нг охратоксина А. Подобное делается для других стандартных растворов с концентрациями 0,05 и 0,10 нг/мкл, что в свою очередь соответствует 2,5 и 5,0 нг охратоксина А во вколе. В указанных условиях время удерживания находится для охратоксина А в диапазоне от 4 до 5 мин. На основании полученных данных строят градуировочный график (зависимость площади хроматографического пика от массы охратоксина А во вколе).

8.2. Оформление результатов

Расчет концентрации охратоксина А в пробе проводится по формуле:

, где

- концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг;

М - масса навески для анализа, г (25,0);

m - масса охратоксина А, соответствующая введенному в хроматограф объему раствора А, нг;

- объём раствора для экстракции, (100);

- объём экстракта, нанесенный на ИАК, (10);

- общий объём раствора А, (0,4);

- объём раствора А, введенный в хроматограф, (0,05).

При высоких уровнях загрязнения охратоксином А пробы необходимо увеличить объем раствора A () с внесением соответствующих изменений в формулу.

За окончательный результат испытаний принимается среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений:

, мг/кг

Результат анализа представляют в виде (при вероятности Р = 0,95):

, мг/кг, где

- граница абсолютной погрешности:

, мг/кг

- граница относительной погрешности методики (показатель точности), % (табл. 1).

Если содержание охратоксина А в пробе менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание охратоксина А в пробе зерна менее 0,0001 мг/кг"*

8.3. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

Допустимое расхождение между параллельными измерениями (R) определяют на основании предела повторяемости (r) (табл. 1):

, мг/кг

Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого:

,

то среднее арифметическое принимают за результат анализа.

При превышении норматива R следует повторить измерения, используя резервные пробы.

9. Контроль качества результатов измерений

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами контроля являются рабочие пробы продовольственного сырья и пищевых продуктов. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют такое количество раствора стандарта охратоксина А, чтобы его массовая доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50-100%. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.

Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы и пробы с добавкой . Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ проводит один аналитик, с использованием одного набора мерной посуды, реактивов, растворов и т.д.

Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой , пробы без добавки и величиной добавки c нормативом оперативного контроля (K). Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении следующего условия (при Р = 0,95):

Норматив оперативного контроля погрешности рассчитывают по формуле (Р = 0,90):

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы.

10. Требования техники безопасности

При выполнении анализов необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.2.007.0 и ГОСТ 4658. Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционными системами по ГОСТ 12.4.021.

11. Требования к квалификации исполнителя

К выполнению анализа охратоксина А в зерне и зернопродуктах допускаются лица со специальным высшим образованием или средним специальным образованием, владеющие техникой ВЭЖХ-анализа, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие опыт работы в химической лаборатории.

12. Условия выполнения измерений

Температура окружающего воздуха от 15 до 25°С.

Относительная влажность воздуха не более 80% при 25°С.

Атмосферное давление 730-760 мм рт. ст.

Напряжение электропитания: 210-220 В. Частота переменного тока: 45-50 Гц.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

______________________________

* 0,0001 мг/кг - предел обнаружения.