Приложение 8. Реагенты, растворы и методы их приготовления

Приложение 8

Реагенты, растворы и методы их приготовления

I. Химические консерванты, применяемые для консервации и хранения половозрелых гельминтов или их фрагментов, яиц и личинок гельминтов

Раствор формалина 10%-й.

Этиловый спирт 70%-й.

Раствор глицерина 50%-й.

Жидкость Барбагалло.

Консервант Турдыева.

Концентрированный раствор хлористого натрия (NaCl): на 100 мл воды 40-50 г NaCl (используется для консервации мышц с личинками трихинелл).

1.1. Приготовление 10%-го раствор формалина:

- формалин аптечный - 10,0 мл;

- дистиллированная вода - 90,0 мл.

1.2. Приготовление 50%-го раствора глицерина (глицерин просветляет мазок):

- глицерин - 50,0 мл;

- дистиллированная вода - 50,0 мл.

1.3. Пропись жидкости Барбагалло - раствор формалина в физиологическом растворе:

- концентрированный формалин - 3,0 мл;

- физиологический раствор - 97,0 мл.

1.4. Пропись консерванта Турдыева:

- (натрий азотнокислый) - 1,6 г;

- раствор Люголя 2%-й - 80,0 мл;

- глицерин - 20,0 мл;

- концентрированный формалин - 100,0 мл;

- дистиллированная вода до 1000,0 мл.

При сборе проб кала в консервант необходимо соблюдать соотношение: 1 часть кала и 3 части консерванта. Хранить кал в растворах консервантов можно до 2-3 недель, при более длительном хранении возможно разрушение яиц гельминтов.

II. Обесцвечивающий раствор спиртовой уксусной кислоты (N 1):

- этиловый спирт 95%-й - 600,0 мл;

- ледяная уксусная кислота - 4,0 мл;

- дистиллированная вода - 350,0 мл.

Наливают 95%-й этиловый спирт в градуированный цилиндр емкостью 1000 мл. Добавляют дистиллированную воду в таком количестве, чтобы общее количество раствора достигло отметки 950 мл, переливают в бутыль емкостью 1000 мл, прибавляют ледяную уксусную кислоту.

III. Раствор буферного метиленового синего (N 2)

3.1. Раствор A (раствор уксусной кислоты):

- ледяная уксусная кислота - 1,2 мл;

- дистиллированная вода - 98,8 мл.

Перемешать, хранить в чистой бутылке.

3.2. Раствор B (раствор уксусно-кислого натрия):

- уксусно-кислый натрий - 1,6 г,

если используют кристаллический уксусно-кислый натрий ;

- кристаллический уксусно-кислый натрий - 2,6 г;

- дистиллированная вода - 100,0 мл.

Перемешать, хранить в чистой бутылке.

3.3. Рабочий раствор (для окраски):

- раствор A (раствор уксусной кислоты) - 46,3 мл;

- раствор B (раствор уксусно-кислого натрия) - 3,7 мл;

- краситель метиленовый синий - 0,5 г;

- дистиллированная вода - 50,0 мл.

IV. Буферный раствор для окраски по Романовскому-Гимза

4.1. Буферный раствор:

- дистиллированная вода - 1 л;

- фосфат калия однозамещенный безводный - 0,27 г;

- фосфат натрия двузамещенный безводный - 0,67 г.

Техника приготовления

1) Соли растворить в дистиллированной воде (1/3 объема) комнатной температуры, после полного растворения довести до метки 1000 мл и размешать.

2) Приготовленный раствор должен иметь pH (7,0 +/- 0,2). Точное соблюдение требуемой реакции буфера важно для правильной окраски. Если pH < 6,8, то следует добавить если pH > 7,2, то добавляется . Количество реактивов, необходимых для доведения pH, подбирается опытным путем.

Буферный раствор следует хранить в хорошо закупоренной посуде в холодильнике (до 1 месяца). Для приготовления краски используется буферный раствор комнатной температуры. Нельзя использовать буферный раствор с осадком, который после окраски затрудняет просмотр препарата и даже может привести к диагностическим ошибкам. Периодически следует проверять pH буферного раствора, особенно при искажении цвета окрашенных элементов крови.

4.2. Раствор краски Романовского-Гимза:

4.2.1. Приготовление маточного раствора из сухой краски Романовского-Гимза:

- азур-эозин - 10,0 г;

- глицерин - 100,0 мл;

- спирт этиловый 96%-й - 900,0 мл.

Техника приготовления краски предусматривает следующие этапы:

1) Азур-эозин тщательно растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством спирта и глицерина до получения кашицеобразной массы и сливают в колбу или бутыль из темного стекла. Затем постепенно добавляют остальной спирт и глицерин.

2) Полученную взвесь тщательно встряхивают в течение 10 мин 2-3 раза.

3) Емкость с краской помещают в термостат при температуре 37°C на 3-5 дней для созревания краски с ежедневным встряхиванием этой емкости вручную не менее 10 мин. При наличии магнитной мешалки встряхивание можно продолжать несколько часов. При наличии подогревателя в мешалке взвесь можно подогревать, при этом подогрев не должен превышать 40-50°C, периодически подогреватель следует выключать с тем, чтобы температура не повышалась выше указанного уровня. Встряхивание и подогрев улучшают качество краски.

После каждого встряхивания раствор снова помещают в термостат.

4) Через 3-5 дней готовый раствор краски фильтруют через бумажный фильтр.

Маточный раствор краски Романовского-Гимза (промышленный или приготовленный из сухой субстанции) представляет собой густую темно-фиолетовую жидкость, которую можно хранить длительное время в хорошо закупоренных бутылях из темного стекла в сухом защищенном от света прохладном месте (но не в холодильнике).

Для текущей работы перед приготовлением рабочего раствора краски Романовского-Гимза необходимое количество маточного раствора краски отливают в небольшой флакон, обязательно фильтруя, так как при хранении маточного раствора может выпасть осадок. Краску следует набирать сухой пипеткой или отливать через горлышко. Для определения качества краски рабочим раствором каждой новой серии производят пробное окрашивание мазков крови.

4.3. Краска Гимзы:

- порошок гимзы - 3,8 г;

- метиловый спирт - 250,0 мл;

- глицерин - 250,0 мл.

Желательно иметь примерно 50 твердых стеклянных бусинок диаметром около 5 мм.

Техника приготовления краски предусматривает следующие этапы:

1) Помещают стеклянные бусинки в бутылку; наливают туда отмеренное количество метилового спирта и прибавляют порошок.

2) Плотно закрывают бутылку пробкой. Порошку дают постепенно опуститься сквозь метиловый спирт, пока он полностью не осядет на дне. Бутылку встряхивают круговыми движениями в течение 2-3 мин.

3) Прибавляют отмеренное количество глицерина и повторяют процедуру встряхивания.

4) Оставляют бутылку на 2-3 дня, встряхивая ее 3-4 раза в день до тех пор пока краска полностью не перемешается.

V. Раствор глицерина с малахитовым зеленым или раствор глицерина с метиленовым синим:

- глицерин - 100,0 мл;

- водный раствор малахитового зеленого 3%-й или раствор метиленового синего 3%-й - 1,0 мл;

- дистиллированная вода - 100,0 мл.

Техника приготовления краски

Некоторое количество порошка малахитового зеленого или метиленового синего растирают пестиком в чистой сухой ступке. Отвешивают 3 г порошка краски, насыпают его в бутылку и прибавляют дистиллированную воду, чтобы получилось 100 мл раствора.

Для приготовления рабочего раствора наливают 1 мл одного из полученных выше 3%-х водных растворов краски в бутылочку емкостью 250 мл. Прибавляют 100 мл глицерина и 100 мл дистиллированной воды; перед использованием раствор тщательно перемешивают.

VI. Спиртовый раствор йода:

- этиловый спирт 70%-й - 40,0 мл;

- кристалл йода - несколько кристаллов.

Техника приготовления раствора

В небольшую колбу наливают 70%-й этиловый спирт. С помощью двух палочек-аппликаторов берут несколько кристаллов йода и помещают в этиловый спирт. Полученную смесь встряхивают и при необходимости добавляют еще некоторое количество кристаллов йода с тем, чтобы раствор имел цвет крепко заваренного чая.

VII. Раствор Люголя

7.1. Основной раствор Люголя 5%-й:

- йод - 5,0 г;

- калий йодистый KI - 10,0 г;

- дистиллированная вода - до 100 мл.

Техника приготовления раствора

Йодистый калий растворяют примерно в 30 мл воды. Добавляют йод и перемешивают до тех пор, пока он не растворится. Прибавляют оставшиеся 70 мл воды и тщательно перемешивают.

Основной раствор Люголя имеет большую концентрацию для окраски препаратов кала. Он может вызвать образование комков, поэтому основной раствор Люголя используется в разведениях.

7.2. Раствор Люголя 1%-й:

- раствор Люголя (основной) - 5,0 мл;

- физиологический раствор натрия хлорида - 20,0 мл.

7.3. Раствор Люголя 2%-й:

- раствор Люголя (основной) - 10,0 мл;

- физиологический раствор натрия хлорида - 20,0 мл.

Наливают необходимое количество физиологического раствора в рабочую бутылочку; прибавляют 5%-й основной раствор Люголя. Тщательно перемешивают. В результате получается 1%-й или 2%-й раствор Люголя, который будет хорошо окрашивать цисты простейших.

VIII. Фосфатный раствор метиленового синего:

- порошок метиленового синего - 1,0 г;

- натрия фосфат двухосновной - 3,0 г;

- калия фосфат одноосновной - 1,0 г;

- дистиллированная вода - 30,0 мл.

Отвешивают необходимое количество метиленового синего и помещают его в чистую сухую ступку. Прибавляют натрия фосфат двухосновной и калия фосфат одноосновной. Пестиком растирают в одной ступке порошки, краски, фосфаты и тщательно перемешивают. Отвешивают 1,0 г указанной смеси и помещают ее в плотно закрывающийс