Раздел 1. Лабораторная диагностика

Раздел 1. Лабораторная диагностика

1.1. Лабораторная диагностика кишечных гельминтозов

Гельминты человека относятся преимущественно к двум типам червей: типу плоских червей Plathelminthes и типу круглых червей Nemathelminthes. Тип плоских червей, поражающих человека, включает два класса: ленточные черви - Cestoda и сосальщики - Trematoda. Тип круглых червей включает в себя один класс, имеющий медицинское значение, собственно класс Nematoda.

Большинство гельминтозов можно диагностировать прямыми методами, то есть по обнаружению в биологическом материале (кал, моча, мокрота, дуоденальное содержимое и пр.) гельминтов на разных стадиях развития (взрослых особей, яиц или личинок). Для этого используют макроскопические и микроскопические методы диагностики.

Отбор проб и условия доставки биологического материала в лабораторию для паразитологического исследования

Материалом для лабораторных паразитологических исследований на гельминтозы служит различный биологический материал: кал, кровь, моча, мокрота, лаважная жидкость, дуоденальное содержимое, содержимое кист, биопсионный или постоперационный материал, гистологические препараты внутренних органов и тканей и другой.

Отбор проб кала

Кал после дефекации отбирают из разных участков в количестве не менее 50 г.

Пробу помещают в чистую сухую стеклянную или пластмассовую посуду с крышками.

Проба кала доставляется в лабораторию и исследуется в день дефекации.

При невозможности исследования пробы кала сразу после дефекации или в день поступления материала в лабораторию пробу кала хранят при температуре от 0 до 4°C не более суток или собирают в консервант (Прилож. 8).

Отбор дуоденального содержимого (желчь)

Материал доставляется в лабораторию в чистых химических или центрифужных пробирках сразу после зондирования пациента натощак.

Доставляют все три фракции (порции "A", "B", "C") и исследуют сразу после поступления в лабораторию.

Порцию "A" доставляют для исследования на наличие возбудителей стронгилоидоза, трихостронгилоидоза, анкилостомидоза.

Порции "B" и "C" доставляют для исследования на яйца гельминтов, паразитирующих в протоках печени и желчном пузыре.

Отбор проб мокроты и лаважной жидкости

В лабораторию доставляется мокрота, выделенная при откашливании (не слюна и не слизь с носоглотки), в стерильной посуде с крышками. Проба мокроты исследуется сразу после поступления в лабораторию.

Лаважная жидкость в лабораторию доставляется в стерильной посуде и исследуется в день доставки.

Отбор проб мочи

В лабораторию доставляется моча, собранная между 10 ч утра и 14 ч дня, или все порции суточной мочи; желательно собрать мочу после физической нагрузки (например, 20-30 приседаний).

1.1.1. Методы исследования кала на яйца гельминтов

1.1.1.1. Макроскопические методы

Макроскопические методы служат для обнаружения в кале целых половозрелых гельминтов или их фрагментов невооруженным глазом или с помощью ручной лупы и/или стереоскопа.

На поверхности кала после дефекации можно видеть активно ползающих остриц; иногда выделяются с калом аскариды; у больных дифиллоботриозом могут выделяться обрывки стробилы лентеца (в виде "лапши"), а у инвазированных тениидами (свиной или бычий цепень) с калом часто отходят членики гельминтов.

Необходимые реактивы и оборудование

Чашки Петри

Черная бумага

Пинцеты

Препаровальные иглы

Предметные стекла большие (6x10; 8x12 см)

Лупа, микроскоп и бинокулярный стереоскопический микроскоп типа МБС

Подготовка к исследованию

1) Извлекать пинцетом или препаровальной иглой все подозрительные частицы и крупные образования на отдельное предметное стекло или чашку Петри.

2) Образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, рассматривать под микроскопом МБС или под лупой между двумя предметными стеклами.

3) Мелких гельминтов рассматривать в капле глицерина или физиологического раствора под микроскопом при увеличении: окуляр x7 или x10, объектив x8 или x10.

4) Членики ленточных гельминтов поместить на предметное стекло, подсушить, закрыть другим предметным стеклом, слегка сдавить и рассмотреть строение матки.

5) Микроскопия всех визуально обнаруженных в кале паразитов или фрагментов обязательна для уточнения морфологических особенностей и идентификации паразита.

Применение. Метод применяется при идентификации зрелых паразитов или их фрагментов, например для дифференциальной диагностики члеников цестод (бычьего, свиного цепня и широкого, чаечного лентеца).

1.1.1.2. Микроскопические методы

1.1.1.2.1. Метод толстого мазка под целлофаном по Като и Миура

Толстый мазок представляет собой тонкий слой пробы кала на предметном стекле под гигроскопическим целлофаном, пропитанным смесью глицерина, фенола и малахитового зеленого.

Примечание. Гидрофильный целлофан горит в отличие от полиэтиленовой пленки, которая плавится и непригодна для исследования.

Необходимые реактивы и оборудование

Глицерин

Раствор фенола 6%-й (100 мл дистиллированной воды + 6 г фенола)

Раствор малахитового зеленого 3%-й (2,5 г малахитовой зелени + 75 мл дистиллированной воды)

Целлофан (гигроскопический)

Обезжиренные предметные стекла

Палочки стеклянные или деревянные

Валик или резиновая пробка

Микроскоп

Подготовка к исследованию

Приготовление рабочего раствора Като: 100 мл 6%-го раствора фенола + 100 мл глицерина +1,2 мл 3%-го раствора малахитового зеленого (раствор можно хранить длительное время в склянке из темного стекла с притертой крышкой).

При отсутствии фенола и малахитовой зелени можно использовать раствор глицерина (50 мл глицерина +50 мл дистиллированной воды).

Подготовка целлофановых полосок. Нарезать полоски из гидрофильного целлофана, чтобы их размер соответствовал размеру предметного стекла.

1) Полоски поместить в рабочий раствор Като не менее чем за 24 ч до проведения анализа. В 200 мл рабочего раствора можно обрабатывать до 5 тыс. новых целлофановых полосок.

2) На предметное стекло нанести пробу кала размером с горошину. Весь объем пробы кала растереть индивидуальной стеклянной палочкой по стеклу.

3) Мазок кала накрыть целлофановой полоской, обработанной в растворе.

4) Целлофан сверху притереть резиновой пробкой или специальным валиком, ширина которого соответствует или немного больше ширины предметного стекла, до получения тонкого равномерного прозрачного слоя.

5) Препарат просветляется при комнатной температуре в течение 20-30 мин

6) Микроскопировать при увеличении: объектив x8 или x10, окуляр x7 или x10 (для уточнения морфологического строения яиц гельминтов - объектив x40).

Эффективность метода

1) Позволяет просмотреть в 20-30 раз больше препаратов кала, чем в нативном мазке, без применения гигроскопических целлофановых полосок.

2) Выявляет яйца гельминтов желудочно-кишечного тракта при высокой и средней интенсивности инвазии.

Применение метода

1) Рекомендуется при массовых обследованиях населения на кишечные гельминтозы.

2) При обследованиях населения на анкилостомидозы, трихостронгилоидоз и гименолепидоз необходимо учитывать, что применение данного метода имеет ограничения во времени, а именно возбудители указанных инвазий разрушаются в течение 1-2 ч.

1.1.1.2.2. Методы седиментации

Метод формалин-эфирной или уксусной седиментации

В основе методов седиментации (осаждения) лежит разность удельного веса используемых химических реактивов и яиц гельминтов: удельный вес яиц высокий, и они концентрируются в осадке.

Необходимые реактивы и оборудование

Контейнеры (полистироловые) объемом 30 мл с ложечкой для сбора кала

Центрифужные пробирки: пластиковые полипропиленовые или стеклянные объемом 12-15 мл (полипропилен устойчив к воздействию эфира и обладает водоотталкивающими свойствами: легко отделяет детритовую пробку)

Пробки для центрифужных пробирок

Воронки пластиковые или стеклянные диаметром 4 или 5 см

Стеклянные палочки или шпатели

Стаканчики пластиковые или стеклянные мерные на 50 и 100 мл

Обезжиренные предметные стекла, покровные стекла размером 24х24 мм

Пипетки или варипипетки с наконечниками

Штативы для центрифужных пробирок

Центрифуга с горизонтальным ротором на 10-12 пробирок

Марля, бинты или мелкоячеистые ситечки металлические или пластиковые

Микроскоп

Формалин концентрированный

Раствор формалина 5-10%-й

Эфир этиловый

Физиологический раствор

Фиксирующий раствор Турдыева

Раствор Люголя 2%-й

Порядок сбора проб кала в консервант

В полистироловые контейнеры с вмонтированной ложечкой наливают 8-10 мл фиксирующего раствора Турдыева (пропись в Прилож. 8). Ежедневно или с интервалом в 1-2 дня в контейнер добавляют небольшую (объемом с горошину) порцию кала. Объем усредненной пробы кала, помещенной в раствор, не должен превышать 2-3 мл. Материал при каждом добавлении тщательно перемешивают с консервантом и хранят в темном прохладном месте (хранить можно до 2-3 недель). Пациенту рекомендуется не употреблять в пищу грибы, печень, большое количество грубой клетчатки, принимать сорбенты. После масляных клизм и приема бария должно пройти несколько суток. В случае лечения антибиотиками широкого спектра действия или антибактериальными препаратами кал для исследования следует начать собирать спустя 7-10 дней после окончания приема препаратов. Жидкий стул следует собрать однократно в количестве не менее 5 мл в консервант и одновременно доставить в лабораторию пробы кала без консерванта, собранные в этот день в чистую сухую посуду. Особенно это касается случаев "диареи путешественников", вернувшихся из стран тропического и субтропического пояса. Рекомендации по сбору и подготовке материала к исследованию следует вручать пациентам вместе с контейнером.

Подготовка к исследованию препаратов кала, собранного в консервант

1) Тщательно перемешать содержимое контейнера, содержащего трехкратную пробу кала в консерванте, встряхиванием или стеклянной палочкой.

2) В центрифужную пробирку поместить воронку, на нее - 2 слоя марли (можно также использовать металлические или пластмассовые ситечки).

3) Профильтровать не менее 8 мл суспензии из контейнера (если объем фильтрата будет меньше, добавить 10%-й раствор формалина до 8 мл).

4) Долить в пробирку 2 мл эфира и закрыть пробкой.

5) Энергично встряхивать пробирку не менее 30 с.

6) Центрифугировать при 1500 об./мин в течение 2 мин или при 2000 об./мин в течение 1 мин

7) После центрифугирования образуются 4 слоя: осадок, раствор формалина, коагулированный белок, фекальный детрит - "пробка", а сверху эфир с растворенными в нем жирами.

8) Верхние 3 слоя удалить резким опрокидыванием пробирки (полипропилен легко отделяет "пробку").

9) Препараты микроскопировать при увеличении: объектив x8 или x10, окуляр x7 или x10, для уточнения морфологического строения яиц гельминтов - объектив x40.

10) Просмотр препарата производить без добавления раствора Люголя.

Для продолжения подготовки к исследованию на наличие возбудителей протозойных инфекций необходимо:

1) Осадок суспендировать: одну каплю поместить на предметное стекло, а рядом на вторую каплю нанести 2%-й раствор Люголя. Препараты накрыть покровными стеклами.

2) Микроскопировать сначала при малом увеличении (окуляр x10, объектив x10) - обзорная микроскопия; а затем при увеличении окуляр x10, объектив x40.

3) Метод седиментации для исследования нефиксированного кала (пробы кала без консерванта) на наличие возбудителей протозойных инфекций излагается в разделе 2.

Примечание. В методе формалин-эфирной седиментации формалин можно заменить 5%-м водным раствором уксусной кислоты. Ход исследования остается без изменений.

1.1.1.2.3. Модификация метода седиментации с применением одноразовых концентраторов "PARASEP"

Необходимые реактивы и оборудование

Комплект концентраторов (разборные пластиковые пробирки) 40 шт., содержащие необходимые для работы готовые реактивы

Центрифуга

Микроскоп

Пипетки

Обезжиренные предметные и покровные стекла

Подготовка к исследованию

1) В смесительной камере пробирки-концентратора содержится 2,4 мл 10%-го буферного раствора формалина с 1 каплей тритона-Х-100.

2) Перед взятием пробы добавляют в пробирку 0,9 мл раствора этилацетата (флакон с реактивом прилагается в упаковке с модулями "PARASEP").

3) Пробу кала массой 1,0 г лопаткой-фильтром опускают в полученный раствор.

4) Камеру с образцом присоединяют к пробирке, закрыв замок (закрутить до щелчка). Тщательно встряхивают систему в течение 30 с до получения однородной взвеси.

5) В таком состоянии образец может храниться в течение 24 ч при комнатной температуре (18-24°C) и до 30 суток в холодильнике (4°C).

6) После получения взвеси систему переворачивают и конической стороной помещают в центрифугу и центрифугируют при скорости 2500-3000 об./мин в течение 1-3 мин, при скорости 1500 об./мин - 5 мин

7) В конической части пробирки остается жидкая часть пробы с выделившимися в нее яйцами гельминтов, цистами простейших.

8) Отсоединяют модуль с фильтром (держать строго вертикально!), избегая перемешивания жидкости с осадком. Фильтровальный модуль утилизируется после обеззараживания (кипячением, автоклавированием). Коническая часть пробирки остается для микроскопирования.

9) При образовании "пробки" из этилацетата и жировых частиц необходимое удалить, обведя стеклянной палочкой.

10) Для микроскопирования с помощью пипетки из нижней части пробирки на предметное стекло переносят 2 капли пробы осадка.

11) Осадок суспендировать: одна капля осадка помещается на предметное стекло, а во вторую каплю наносится 2%-й раствор Люголя. Препараты накрываются покровными стеклами.

12) Микроскопируют при увеличении: окуляр x10, объективы x10, x40.

13) При использовании для микроскопии рабочей станции FE-5 из процесса исследования можно исключить предметные и покровные стекла.

Примечание. Если пробы кала доставлены в консерванте (например, Турдыева), то их центрифугируют при 1000-1500 об./мин, надосадочную часть сливают. Осадок исследуется согласно пунктам 1-12.

Применение. Метод модификации облегчает визуализацию искомых патогенов, обеспечивает их качественное и количественное определение в субстрате; исключает необходимость приобретения дополнительных реактивов.

1.1.1.2.4. Модификация метода седиментации с применением минисистемы "Real"

Необходимые реактивы и оборудование

Комплект "концентратор-минисистема "Real", содержащий готовые реактивы "Экосаф"

Обезжиренные предметные и покровные стекла

Пипетки

Раствор Люголя 2%-й

Центрифуга

Микроскоп

Подготовка к исследованию

1) Минисистема "Real" состоит из двух герметически соединенных пробирок. Верхняя пробирка содержит 4,0 мл консервирующей смеси "Экосаф", стеклянные бусы и фильтр, в крышку вмонтирована ложечка для сбора кала.

2) В смеси "Экосаф" минисистемы "Real" содержится: ацетат натрия - 0,9%; ледяная уксусная кислота - 2,0%; формальдегид 34-38% - 1,6%; метанол - 0,4%; неионный детергент Тритон Х-100 - 0,16%; дистиллированная вода.

3) Пробу кала объемом одной ложечки минисистемы "Real" помещают в верхнюю пробирку со смесью "Экосаф". Крышка пробирки плотно закручивается.

4) Пробирка минисистемы "Real" с пробой кала энергично встряхивается в течение 30 с до получения однородной взвеси.

5) После получения взвеси пробирка переворачивается вверх дном, отвинчивается нижняя крышка и к ней плотно закручивается коническая центрифужная пробирка.

6) Герметически соединенные верхняя и нижняя пробирки помещают в центрифугу и центрифугируют в течение 3 мин при скорости 2000 об./мин

7) В процессе центрифугирования происходит фильтрация суспензии.

8) В конической части нижней пробирки остается жидкая часть пробы с выделившимися в нее возбудителями кишечных паразитозов.

9) Отсоединяют верхнюю пробирку с фильтром, которая помещается в дезинфекционный раствор для обеззараживания.

10) Для микроскопирования с помощью пипетки из нижней пробирки на предметное стекло переносят 2 капли пробы осадка.

11) Осадок суспендируется: одна капля осадка помещается на предметное стекло, а во вторую каплю наносится 2%-й раствор Люголя. Препараты накрываются покровными стеклами.

12) Микроскопируют при увеличении: окуляр x10, объективы x10, x40.

Примечание. Если пробы кала доставлены в консерванте (например, Турдыева), то отобранную пробу кала центрифугируют при 1000-1500 об./мин, надосадочную часть жидкости сливают. Осадок исследуется согласно пп. 3-11.

Применение. Модифицированный метод седиментации с применением минисистемы "Real" имеет все преимущества методов седиментации. Дополнительным преимуществом метода является отсутствие летучих ингредиентов в составе реактива "Экосаф".

1.1.1.2.5. Методы исследования кала с применением флотационных растворов

В основе методов флотации (всплывания) лежит разность удельного веса флотационного раствора и яиц гельминтов, удельный вес флотационного раствора выше, в результате яйца гельминтов всплывают на поверхность жидкости и обнаруживаются в поверхностной пленке.

Необходимые реактивы и оборудование

Один из флотационных растворов

Ареометр

Предметные стекла (обезжиренные)

Пипетки стеклянные

Химические стаканчики емкостью 30-50 мл

Кюветы эмалированные

Стеклянные или деревянные палочки

Подготовка к исследованию

1) Приготовление флотационного раствора по одной из двух прописей:

а) раствор N 1. Раствор нитрата натрия или азотнокислого натрия (предложенный Калантарян) с плотностью 1,38-1,40 готовят из расчета 1000 г вещества на 1 л горячей воды;

б) раствор N 2. Насыщенный раствор хлорида натрия (NaCl) с плотностью 1,18-1,20 (предложенный Фюллеборном) готовят из расчета 400-420 г соли на 1 л кипящей воды.

2) Одну из солей растворяют в горячей воде в эмалированной посуде, причем кладут соль в емкость с горячей водой порциями при подогревании на плите и постоянном перемешивании до полного растворения.

3) Удельный вес флотационных растворов измеряется ареометром только после остывания раствора при комнатной температуре.

4) Измерение удельного веса флотационного раствора ареометром строго обязательно, так как приготовление раствора по прописи не гарантирует получение нужного удельного веса (например, когда используемая соль недостаточно химически чистая).

5) Фильтровать приготовленные растворы необязательно. Если раствор приготовлен в большом количестве, то в последующие дни перед исследованием его подогревают с размешиванием осадка и после остывания раствора снова измеряют ареометром удельный вес.

Подготовка предметных стекол: предметные стекла обязательно обезжирить, например в смеси Никифорова (равные части этилового спирта и эфира).

Подготовка к исследованию

1) В химический стаканчик объемом 30-50 мл налить небольшое количество одного из двух флотационных растворов.

2) Поместить в стаканчик 2,5 г кала.

3) Тщательно размешать палочкой (индивидуальной для каждого обследуемого).

4) Удалить сразу же после размешивания всплывшие крупные частицы палочкой (или ложечкой с дырочками).

5) Добавлять постепенно солевой раствор до образования выпуклого мениска.

6) Накрыть стаканчик обезжиренным стеклом.

7) Оставить взвесь на 30 мин при использовании растворов N 1 и 2.

8) Микроскопировать при увеличении: объективы x8, x10, окуляры x7, x10, уточнение морфологического строения - окуляр x40.

9) При невозможности микроскопирования сразу после снятия стекла необходимо добавить несколько капель глицерина и прикрыть покровным стеклом.

10) При использовании раствора N 2 необходимо просматривать не только стекло, но и осадок для выявления тяжелых яиц трематод.

1.1.1.3. Методы исследования кала на личинки гельминтов

Метод Бермана

Применяется как специальный метод для диагностики стронгилоидоза и основан на положительном гидротаксисе личинок.

Необходимое оборудование

Штатив

Стеклянная воронка (диаметром 10 см)

Металлическое сито или сетка "мельничный газ"

Резиновая трубка с зажимом

Предметные стекла

Стеклянные или деревянные палочки

Чашки Петри

Центрифуга

Микроскоп

Подготовка к исследованию

1) Собрать аппарат Бермана, для чего закрепить в штативе стеклянную воронку с металлическим ситом. На нижний конец воронки надеть резиновую трубку с зажимом.

2) Пробу кала объемом 20-50 г поместить на металлическое сито, или мелкоячеистую металлическую сетку, или сетку "мельничный газ".

3) Сетку с пробой кала приподнять и в воронку налить воду таким образом, чтобы нижняя часть сетки с калом была погружена в воду.

4) Через 24 ч зажим на резиновой трубке быстро открыть и жидкость спустить в центрифужную пробирку.

5) Полученную жидкость центрифугировать 1-2 мин.

6) Надосадочную жидкость быстро слить.

7) Осадок нанести на предметное стекло или в чашку Петри.

8) Можно спустить жидкость в чашку Петри и исследовать без центрифугирования с использованием МБС. При обнаружении личинок для их обездвиживания внести одну каплю раствора Люголя, личинку перенести на предметное стекло и прикрыть покровным.

9) Микроскопировать при увеличении: объектив x8 или x10, окуляр x7 или x10, уточнение морфологического строения при увеличении: объектив x40, окуляр x10.

Метод Бермана в модификации Супряги

Необходимые реактивы и оборудование

Дистиллированная вода

Химические стаканчики

Стеклянные палочки

Чашки Петри

Пробирки центрифужные

Микроскоп бинокулярный стереоскопический (МБС)

Подготовка к исследованию

1) В химический стаканчик положить пробу кала объемом 10-15 г.

2) Залить теплой (40°C) дистиллированной водой, чтобы проба кала была полностью покрыта.

3) Через 20-30 мин слить жидкость в центрифужные пробирки.

4) Отстаивают 10-15 мин или центрифугируют 1 мин при 1500 об./мин.

5) Слить осторожно надосадочную жидкость, осадок поместить в чашку Петри.

6) Исследовать осадок в чашке Петри под МБС (с нижней подсветкой): объектив x2, окуляры x12, x14, обращая внимание на подвижные, слабоподвижные и неподвижные личинки.

7) Неподвижные личинки микроскопируют с увеличением: объективы x8, x10 и x40; окуляр x10.

Эффективность метода. Эффективен при высокой и средней интенсивности инвазии.

Метод Харада-Мори в модификации Маруашвили
(метод культивирования личинок на фильтровальной бумаге)

Применяется для диагностики анкилостомидозов.

Необходимые реактивы и оборудование

Фильтровальная бумага (размером 16x3,5 см)

Стеклянная банка (0,7-0,8 л)

Полиэтиленовая пленка

Термостат

Центрифуга

Водяная баня

Подготовка к исследованию

1) На фильтровальную бумагу нанести свежевыделенные фекалии в виде мазка, оставляя края фильтровальной бумаги свободными.

2) Смочить стенки банки водой, опустить в банку фильтровальную бумагу и поверхностью без фекалий зафиксировать ее на стенках банки.

3) Налить в банку воды так, чтобы в нее был погружен нижний конец бумаги без фекалий.

4) Верх банки закрыть полиэтиленовой пленкой или чашкой Петри.

5) Банку поставить в термостат при температуре 28°C на 5-6 дней (в теплое время года банку можно оставлять при комнатной температуре, увеличив экспозицию до 8-10 дней).

6) Часть личинок может подняться вверх по фильтровальной бумаге, поэтому работа должна проводиться с соблюдением техники безопасности.

7) Для безопасности можно предварительно убить личинки, поместив пробирку в водяную баню при температуре 50°C на 15 мин.

Эффективность метода. Эффективен для обнаружения и идентификации личинок анкилостомид.

1.1.1.4. Методы исследования перианальных отпечатков

Применяются для выявления яиц остриц и онкосферы тениид при индивидуальных и массовых обследованиях.

Необходимые реактивы и оборудование

Кроме микроскопа, необходимое оборудование зависит от способа получения отпечатка: предметные стекла, полоски прозрачной липкой ленты (скотч), глазные палочки со специальным клеевым слоем.

Подготовка к исследованию

При массовых обследованиях населения (в основном детского) заранее подготовить предметные стекла с липкой лентой, флаконы или специальные штативы с глазными палочками, покрытыми клеевым слоем. Промаркировать предметные стекла, флаконы либо маркировать во время забора материала у обследуемых согласно номеру по списку.

Ход исследования зависит от способа отбора материала.

Метод исследования перианального отпечатка с применением липкой ленты по Грэхэму

Подготовка к исследованию

1) Подготовить отрезок липкой ленты длиной 8-10 см, предварительно наклеить его на предметное стекло.

2) Перед взятием анализа отклеить полоску липкой ленты от предметного стекла, держа полоску за концы, плотно прижать всей липкой поверхностью к перианальным складкам, стараясь пальцами рук не касаться перианальной области.

3) Отклеить полоску липкой ленты от кожи перианальной области и липким слоем вниз ленту перенести на предметное стекло, приклеить к стеклу равномерно для предотвращения образования воздушных пузырей, мешающих микроскопии.

4) Концы ленты, выходящие за края стекла, отрезать.

5) Микроскопировать при увеличении: объектив x8 или x10, окуляр x7 или x10.

Примечание. Для постановки метода пригодна полиэтиленовая прозрачная пленка с липким слоем для детского технического творчества (скотч).

Метод исследования перианального отпечатка с применением стеклянных глазных палочек с клеевым слоем по Рабиновичу

Пропись клея: клеол - 10 мл, касторовое масло - 2,5 мл, этиловый эфир - 5 мл, этиловый спирт 96,5%-й - 2,5 мл (хранение во флаконе по 20,0 мл с плотно притертой пробкой).

Подготовка к исследованию

1) Подготовить стеклянные глазные палочки (лучше с широкими лопаточками): промыть, обезжирить и простерилизовать (кипячением или автоклавированием), высушить; сухую лопаточку глазной палочки обмакнуть в клей; просушить не менее 2-4 ч (глазная палочка при этом должна находиться лопаточкой вверх для стекания избытка клея и образования равномерной пленки).

2) Клей, обтекая лопаточку, образует прозрачную клейкую пленку, сохраняющуюся после высыхания не менее недели (что позволяет готовить палочки заранее).

3) Установить глазные палочки в специальный штатив, где каждая ячейка имеет свой номер, или использовать пронумерованные пенициллиновые флаконы, предварительно закрепив ручку глазной палочки в резиновой пробке от этого пузырька.

4) Взять отпечаток путем плотного прижатия плоских частей глазной лопаточки к коже перианальных складок.

5) Снова укрепить палочку в штативе или пенициллиновых пузырьках (промаркированных соответственно номеру, присвоенному обследуемому по списку, или регистрационному номеру в журнале) для доставки в лабораторию.

6) Укрепить глазную палочку в специальном держателе для просмотра под микроскопом.

7) Микроскопировать непосредственно плоскую поверхность лопаточки поочередно с обеих сторон при увеличении: окуляр x7 или x10, объектив x8 или x10.

8) Использованные палочки дезинфицировать кипячением в мыльном растворе, тщательно промыть, прополоскать, обезжирить в смеси Никифорова, просушить в сухожаровом шкафу. Штатив и кассеты обработать 70%-м спиртом и промыть мыльно-содовым раствором. Пенициллиновые пузырьки и резиновые пробки дезинфицировать кипячением или автоклавированием.

ГАРАНТ:

Нумерация разделов приводится в соответствии с источником

1.1.1.6. Методы исследования желчи дуоденального содержимого
(желчи, мокроты, лаважной жидкости и мочи)

Применяются для выявления яиц трематод (возбудителей описторхоза, клонорхоза, фасциолеза, дикроцелиоза), а также возбудителей стронгилоидоза, трихостронгилоидоза и анкилостомидозов.

Необходимые реактивы и оборудование

Этиловый эфир

Обезжиренные предметные и покровные стекла

Палочки стеклянные или деревянные

Пипетки

Чашки Петри

Центрифужные пробирки

Центрифуга

Микроскоп

Методы исследования дуоденального содержимого (желчи)

Подготовка к исследованию

1) Выбрать сгустки слизи, волокон, патологические примеси.

2) Палочкой стеклянной или деревянной (можно пипеткой) нанести тонким слоем желчь на предметное стекло (мазок не должен стекать с предметного стекла), прикрыть покровным стеклом.

3) Микроскопировать при увеличении: объектив x8 или x10, окуляр x10; для уточнения морфологии яиц гельминтов - объектив x40.

4) При исследовании в чашке Петри налить желчь тонким слоем на дно чашки.

5) Для обнаружения подвижных личинок стронгилид можно микроскопировать в чашках Петри под стереомикроскопом МБС (окуляр x8; объектив x4-7).

Методы исследования желчи с центрифугированием

Подготовка к исследованию

1) При наличии в желчи большого количества слизи или гноя взболтать все порции с равным количеством эфира.

2) Центрифугировать в центрифужных пробирках все порции дуоденального содержимого 10 мин при 1500-2000 об./мин.

3) Надосадочную часть желчи слить в отдельную емкость.

4) Осадок перенести пипеткой или прямо из пробирки на предметное стекло.

5) Микроскопировать при увеличении: объектив x8 или x10, окуляр x10, для уточнения морфологии яиц гельминтов - объектив x40.

Методы исследования мокроты и лаважной жидкости

Применяются для выявления возбудителей легочных гельминтозов (парагонимоза, томинксоза). Иногда, при поражении легких и прорыве пузырей в бронх, можно обнаружить личиночные стадии эхинококков (сколексы эхинококка, альвеококка).

Необходимые реактивы и оборудование

Раствор едкой щелочи (NaOH или KOH) 0,5%-й

Центрифужные пробирки

Предметные и покровные стекла, большие предметные стекла

Центрифуга

Микроскоп

Методы исследования нативного мазка мокроты

Подготовка к исследованию

1) При слизисто-гнойной мокроте для лучшего растворения слизи, гноя необходимо: мокроту смешать с равным объемом 0,5%-го раствора едкой щелочи; слегка подогреть пробирку на водяной бане; пробирку энергично встряхивать в течение 5 мин

2) Мокроту из пробирки пипеткой переносят на предметное стекло (лучше использовать широкое предметное стекло).

3) Приготовить мазок путем равномерного растирания между двумя предметными стеклами или нанесения и равномерного растирания палочкой на большом предметном стекле.

4) Микроскопировать при увеличении: объектив x8 или x10, окуляр x10.

Методы исследования нативного мазка мокроты и лаважной жидкости с центрифугированием

Подготовка к исследованию

1) Перелить мокроту (лаважную жидкость) в центрифужные пробирки.

2) Центрифугировать в течение 3-5 мин при 1500 об./мин.

3) Перенести осадок пипеткой на предметное стекло, прикрыть покровным.

4) Микроскопировать при увеличении: объектив x8 или x10, окуляр x10, для уточнения морфологических особенностей - окуляр x40.

Методы исследования мочи

Применяются для выявления возбудителя мочеполового шистосомоза при любой стадии инвазии. Возможно обнаружение яиц диоктофимы (Dioctophyma renale) - редко встречаемого гельминта - паразита почечной лоханки.

Необходимое оборудование

Центрифужные пробирки

Пипетки

Предметные и покровные стекла

Центрифуга

Микроскоп

Метод концентрации мочи

Подготовка к исследованию

1) Всю разовую порцию мочи отстаивать в высоких банках или цилиндрах в течение 30-45 мин.

2) Слить верхнюю часть, оставив 10-15 мл осадка, который перелить в центрифужные пробирки.

3) Оставшуюся часть центрифугировать в течение 5 мин при 1500 об./мин или 1-2 мин при 3000 об./мин.

4) Слить надосадочную жидкость.

5) Осадок перенести пипеткой на предметное стекло, прикрыть покровным.

6) Микроскопировать с объективом x8 или x10, окуляр x10, для уточнения морфологических особенностей - окуляр x40.

Метод фильтрации мочи

Подготовка к исследованию

1) 5-10 мл мочи от порции, собранной с 11 ч утра до 15 ч дня, или все порции суточной мочи смешивают с равным количеством детергента-типола.

2) Фильтруют под вакуумом через фильтровальную бумагу (или фильтры N 1).

3) На увлажненных фильтрах обнаруживают яйца и личинки гельминтов при микроскопии.

4) Микроскопируют при увеличении: объектив x8 или x10, окуляр x10.

1.1.2. Диагностические признаки возбудителей гельминтозов

Для видовой идентификации яиц гельминтов при микроскопии препаратов используются следующие морфологические признаки:

1) Размеры: измеряют длину и ширину обнаруженных яиц. Для каждого вида гельминта характерна определенная величина яиц, которая варьирует от среднего значения (рис. 1 - здесь и далее рисунки не приводятся).

2) Форма: яйца гельминтов в основном имеют эллипсоидную форму, вытянутую в разной степени, часто асимметричны.

3) Толщина оболочки яиц разных видов гельминтов сильно различается: от очень тонкой (как у анкилостоматид) до толстой многослойной с наружной крупнобугристой белковой оболочкой, характерной для яиц аскарид.

4) Цвет: яйца некоторых видов гельминтов окрашены в желто-коричневый цвет уже в матке самок (у большинства трематод), у других - изначально бесцветны, но прокрашиваются пигментами испражнений в темно-желтый или коричнево-бурый цвет по мере прохождения по кишечнику (яйца аскарид, власоглава), встречаются и неокрашенные яйца, например у анкилостоматид, остриц, карликового цепня.

5) Наличие морфологических особенностей, таких как крышечки, шипы, пробки, крючки или фестончатая наружная оболочка.

6) Внутреннее содержимое: яйца выделяются из матки гельминтов на разных стадиях развития: они могут содержать практически неразличимый зародыш, окруженный желточными клетками, один или несколько хорошо заметных бластомеров или сформированную личинку. Если пробы кала исследуют через несколько часов или спустя 1-2 дня после дефекации, яйца некоторых нематод могут развиваться до более взрослых стадий, что следует учитывать при диагностике.

При обнаружении яйца гельминта или похожего на него объекта следует тщательно оценить все перечисленные признаки, чтобы установить видовой диагноз.

Иллюстрация возбудителей глистных инвазий (не приводятся) приведена в Прилож. 2, 3, 4.

Видовая диагностика трематодозов

Представители класса Trematoda, паразитирующие у человека, локализуются в разных органах, в связи с чем условно разделены на 4 группы: I - трематоды, паразитирующие в гепатобилиарной системе (сем. Opisthorchidae, Fasciolidae, Dicrocoeliidae); II - кишечные трематоды (сем. Heterophyidae, Nanophyetidae и др.); III - легочные трематоды (сем. Paragonimidae) и IV - трематоды кровеносной системы (сем. Schistosomatidae). В соответствии с этим, яйца I группы трематод могут быть выявлены в дуоденальном содержимом и кале; II группы - только в кале (в связи с тем, что продолжительность жизни кишечных трематод невелика, в кале можно обнаружить и самих взрослых паразитов); III группы - в мокроте и кале, так как мокрота часто заглатывается; IV - в кале или моче в зависимости от вида паразита и его локализации в организме хозяина.

Яйца разных видов трематод существенно отличаются по размеру: от самых мелких, присущих кишечным трематодам, до самых крупных, таких как яйца фасциол. Оболочки яиц чаще всего тонкие и ровные, за исключением таковых у D. lanceatum, Sch. japonicum и видов Paragonimus.

Цвет оболочек яиц разных видов трематод варьирует от желтовато-золотистого до буро-коричневого.

Наиболее характерным признаком практически всех яиц трематод - паразитов человека является наличие крышечки, которая открывается для выхода созревшей личинки - мирацидия во внешнюю среду. Крышечка может быть разной высоты, примыкает к скорлупе яйца плотно, так что становится практически неразличимой. Край крышечки может быть в виде ровной тонкой или волнистой линии. Часто оболочка перед крышечкой образует валик, выраженный в разной степени. При рассматривании яйца под микроскопом этот валик виден в виде выступов с его боков, так называемых "плечиков". Размер их, высота крышечки и способ ее прилегания являются важными систематическими признаками. Яйца шистосом крышечки не имеют, при выходе мирацидия оболочка яйца разрывается.

На противоположном полюсе от крышечки находится в разной степени развитый бугорок: от небольшого утолщения оболочки до выраженного выроста - "шишечки", иногда широкой. Яйца шистосом снабжены шипами, место их расположения и размер является видовым признаком.

Яйца возбудителей описторхоза, шистосомозов и некоторых кишечных трематод выделяются из матки самок полностью зрелыми, со сформированной личинкой - мирацидием внутри, которая хорошо видна при микроскопировании. Яйца возбудителей фасциолеза, парагонимоза, нанофиетоза содержат плохо различимый зародыш в центре, окруженный желточными клетками. Развитие этих яиц происходит во внешней среде.

Сравнительная характеристика морфологических признаков яиц трематод представлена в Прилож. 2.

При обнаружении в кале яиц D. lanceatum и F. hepatica следует помнить, что они могут быть транзитными. При употреблении в пищу печени крупного и мелкого рогатого скота, зараженного возбудителями фасциолеза или дикроцелиоза, их яйца при недостаточной термической обработке могут сохраняться и транзитом проходить через желудочно-кишечный тракт человека, обнаруживаясь затем в кале. Необходимо повторное исследование после исключения из пищи указанных продуктов.

Видовая диагностика цестодозов

Класс ленточных гельминтов относится к типу плоских червей и делится на два отряда - лентецов и цепней.

К отряду лентецов относятся 3 вида возбудителей дифиллоботриоза, встречающихся на территории Российской Федерации (Diphyllobothrium latum, D. dendriticum, D. luxi). В связи с тем, что матка хвостовых члеников Diphyllobothriidae имеет выводное отверстие, в кале обнаруживаются яйца, имеющие характерное строение: они сероватого цвета, овальной формы, с тонкой двуконтурной оболочкой. На одном полюсе имеются крышечки, на другом - утолщение оболочки в виде бугорка. Последний виден не всегда, особенно при работе методом Като. В центре яйца находится зародышевая клетка. По яйцам Diphyllobothriidae невозможно определить видовую принадлежность лентеца, в связи с чем при записи результатов анализа указывают "обнаружены яйца Diphyllobothriidae sp.".

Дифференциальная диагностика лентецов и цепней приведена в Прилож. 3.

К отряду цепней относятся Taenia solium, Taeniarhynchus saginatus, Hymenolepis nana, Hymenolepis diminuta, Dipylidium caninum.

Taeniarhynchus saginatus - возбудитель бычьего цепня и Taenia solium - возбудитель свиного цепня локализуются в тонком кишечнике. Строение яиц этих двух видов возбудителей одинаковое. Яйцо имеет тонкую прозрачную оболочку с двумя нитевидными придатками. Внутри яйца находится зародыш (онкосфера) почти правильной круглой формы, окруженной толстой оболочкой желтовато-коричневого цвета и снабженной тремя парами крючьев. Оболочка яйца, как правило, быстро разрушается и при исследовании кала видна только онкосфера. Онкосферы бычьего цепня обнаруживаются при исследованиях перианальных отпечатков, возможно их обнаружить и в кале. При записи результатов исследований указывают "обнаружены онкосферы Taeniidae g. sp.".

Дифференциальная диагностика T. solium и T. saginatus проводится по концевым членикам (Прилож. 3).

Во внешнюю среду самостоятельно или вместе с калом могут выделяться членики T. saginatus, T. solium, Diphyllobothriidae sp. и D. caninum. Диагностика проводится по форме членика (соотношение ширины и длины) и особенностям строения матки:

- концевой членик T. saginatus имеет ширину меньшую, чем длину. Матка замкнутая, имеет центральный ствол с большим числом боковых ответвлений - до 30 и более;

- концевой членик T. solium также имеет ширину меньшую, чем длину. Матка замкнутая, имеет центральный ствол с небольшим числом боковых ответвлений - до 10-12;

- концевой членик Diphyllobothriidae sp. имеет ширину большую, чем длину. Матка имеет выводной приток, расположена в середине членика в виде розетки, боковые ответвления отсутствуют;

- концевые членики D. caninum имеют формы семечек тыквы.

Hymenolepis nana - возбудитель гименолепидоза (карликовый цепень) паразитирует в нижнем отделе тонкого кишечника. Яйца имеют эллипсоидную форму, не окрашены, слегка ополесцируют. Между оболочкой и зародышем находятся нити (филаменты). Зародыш (онкосфера) имеет три пары крючьев. Яйца H. nana выявляются и при использовании метода Като сразу после просветления препарата. В дальнейшем они разрушаются. Определить строение матки невозможно, так как членик разрушается в кишечнике человека.

Hymenolepis diminuta - крысиный цепень, крайне редко паразитирует у человека. Облигатным хозяином являются грызуны. У человека гельминт находится в тонком кишечнике. Яйца - округлые, желтоватого цвета. Наружная оболочка - толстая, двухконтурная, радиально исчерченная. Внутри яйца расположена круглая онкосфера с тремя парами крючьев.

Dipylidium caninum - цепень тыквовидный вызывает дипилидоз. Облигатным хозяином являются кошки, собаки, лисы и другие животные. У человека встречается крайне редко. Паразит локализуется в тонком кишечнике. В выделившемся членике находятся коконы с несколькими яйцами. Форма яйца круглая, оболочка толстая, цвет сероватый или желтоватый. Внутри яйца 6 крючьев.

Видовая диагностика нематодозов

Идентификация возбудителей нематодозов в кале.

Ascaris lumbricoides - возбудитель аскаридоза паразитирует в тонком кишечнике. Половозрелая самка в сутки выделяет более 200 тыс. яиц. Яйца могут быть оплодотворенные и неоплодотворенные. Морфологическое строение их различно.

Взрослые особи имеют веретенообразную форму. Живые или свежевыделившиеся из кишечника аскариды красновато-желтые, после гибели становятся беловатыми. Самец заметно меньше самки, длина его 15-25 см, толщина 2-4 мм, задний конец тела загнут крючком. Самка имеет прямое тело длиной 25-40 см и 3-6 мм в толщину.

Оплодотворенное яйцо имеет овальную, реже шаровидную форму. Яйца покрыты толстой многослойной оболочкой. Наружная белковая оболочка фестончатая, окрашена в коричневый цвет. Внутренние толстые липоидные оболочки гладкие, бесцветные. Внутри яйца располагается шаровидный бластомер. Если исследуется кал через несколько дней после дефекации, внутри яйца можно обнаружить 2, 4, 8 и так далее бластомеров, вплоть до личинки. Иногда можно выявить оплодотворенные яйца без белковой оболочки, что затрудняет диагностику.

Неоплодотворенные яйца могут иметь разнообразную форму - вытянутую треугольную и так далее - яйца покрыты грубой белковой оболочкой с неравномерными зубцами. Все содержимое яйца заполнено крупными желточными клетками (от полюса до полюса). Неоплодотворенные яйца без белковой оболочки практически не диагностируются.

При заполнении результатов исследования обязательно указать вид яиц аскарид: оплодотворенные или неоплодотворенные.

Trichocephalus trichiurus - возбудитель трихоцефалеза паразитирует в слепой кишке и выделяет в сутки 1-3 тыс. яиц. Яйца имеют лимонообразную или бочонковидную форму с "пробочками" на обоих полюсах (рис. Прилож. 2). Яйца покрыты многослойной оболочкой. Наружная оболочка гладкая, темно-коричневая, прерывается на полюсах и сквозь этот разрыв выпячивается бесцветная внутренняя оболочка. Внутреннее содержимое яйца - мелкозернистое. В дальнейшем можно обнаружить 2, 4, 8 и так далее бластомеров, вплоть до личинки.

Ancylostoma duodenale, Necator americanus - возбудители анкилостомидозов паразитируют в 12-перстной кишке и верхних отделах тонкого кишечника. В сутки A. duodenale выделяет 25 тыс. яиц, N. americanus - 10 тыс. яиц. Определить видовую принадлежность анкилостомид по яйцам практически невозможно. В связи с этим, при выдаче результатов исследования указывается "обнаружены яйца Ancylostomatidae sp.". Яйца анкилостомы и некатора - овальные с закругленными полюсами, покрыты гладкой, бесцветной, тонкой двуконтурной оболочкой. При малом увеличении микроскопа оболочка кажется одноконтурной. Яйца выделяются с калом на стадии 4-8 бластомеров. При нахождении в течение 1-2 суток при комнатной температуре в яйце могут развиться личинки.

Дифференциальная диагностика до вида проводится только по филяриевидным личинкам (Прилож. 4).

Strongyloides stercoralis - возбудитель стронгилоидоза паразитирует в 12-перстной кишке. При интенсивной инвазии - в пилорической части желудка, поджелудочной железе, желчном пузыре. S. stercoralis - единственный паразит человека, выделяющий во внешнюю среду рабдитовидные личинки. Иногда в кале можно обнаружить и филяриевидные личинки. В сутки S. stercoralis откладывает до 50 тыс. яиц, которые в кишечнике превращаются в неинвазионную рабдитовидную личинку. Личинки имеют размер 0,2 мм. Передний конец личинки тупой с четко выраженным ротовым отверстием. Пищевод занимает 1/3 длины личинки и имеет 2 расширения. Между этими расширениями находится нервное кольцо. Кишечник занимает 2/3 длины личинки. На границе средней и хвостовой трети кишечника находится половой зачаток в виде клетки серого цвета. Хвостовой конец личинки заострен. Рабдитовидная личинка в течение 1-2 суток может превратиться в филяриевидную личинку. Размер ее достигает 0,6 мм, пищевод - цилиндрический, занимает 40% длины личинки. Половой зачаток практически не выделен. Хвостовой конец раздвоен.

Кроме личинок S. stercoralis в кале можно обнаружить личинки свободноживущих почвенных нематод, не являющиеся паразитами человека. На головном конце и в бульбусе этих личинок имеются хитиновые образования в виде "шапочки", усиков, стилета или "якоря". Все эти образования позволяют дифференцировать непаразитарные личинки от личинок S. stercoralis.

Enterobius vermicularus - возбудитель энтеробиоза паразитирует в нижнем отделе тонкого и верхнем отделе толстого кишечника. В матке самки содержится от 5 до 17 тыс. яиц. Яйца чаще всего обнаруживаются в перианальных складках. При исследовании кала яйца остриц выявляются крайне редко. Возможно обнаружение взрослых паразитов, представляющих из себя мелкую нематоду 9-12 мм с резко заостренным хвостовым концом. Яйца остриц - асимметричной формы, покрыты тонкой, гладкой, двуконтурной оболочкой. Внутри яйца находится "зародыш", который через 4-6 ч превращается в инвазионную личинку.

Trichostrongylus sp. - возбудитель трихостронгилёза паразитирует преимущественно в тонком кишечнике. Это раздельнополые гельминты длиной 0,5 см, продолжительность жизни которых свыше 8 лет. Яйца трихостронгилид - овально-эллипсовидной формы с тонкой прозрачной оболочкой с одним тупым закругленным и другим острым концом. Внутри свежевыделенных яиц 16-30 бластомеров. Во внешней среде через 1-3 сутки из выделенных яиц вылупляются рабдитовидные личинки, которые после двукратной линьки превращаются в инвазионные филяриевидные личинки.

1.2. Лабораторная диагностика эхинококкозов

Морфологические методы исследования ларвоцист при цистном и альвеолярном эхинококкозах

Морфологическими методами исследования паразита при эхинококкозах выявляются характерные элементы строения личинок паразита, что служит прямым неопровержимым подтверждением диагноза эхинококкозов.

1.2.1. Лабораторная диагностика цистного эхинококкоза

Методы исследования нашивных и окрашенных мазков

Отбор биологического материала

Исследованию на цистный эхинококкоз подлежат: содержимое паразитарной кисты, ее оболочки, мокрота больного (при эхинококкозе легких), промывные воды при лаваже бронхов (в случаях вскрытия кисты в бронх), желчь (при подозрении на прорыв кисты в желчные протоки), содержимое брюшной и плевральной полостей (при вскрытии кист в полости), содержимое дренажной жидкости в разные сроки после операции, при бронхоскопии, плевральной пункции, дуоденальном зондировании.

Исследованию на цистный эхинококкоз подвергают также материал, полученный при биопсии во время операции, пункционной биопсии печени, открытой биопсии при лапаротомии или торакотомии, на секции.

Необходимое оборудование, инструменты, реактивы

Ножницы

Пинцеты

Мельничный газ с диаметром ячеек 0,3 мм

Стеклянные стаканчики объемом 0,5-0,7 л

Чашки Петри

Пластмассовые одноразовые пипетки

Предметные стекла

Хирургические перчатки

Изотонический раствор хлорида натрия

Концентрированный раствор антибиотиков (пенициллин 2000 ЕД/мл + гентамицин 0,3 ЕД/мл, разведенные в физиологическом растворе)

Эмалированные кюветы

Стереомикроскоп

Световой микроскоп

Подготовка к исследованию

1) Для исследования содержимое кисты, мокроту, желчь и другие объекты исследования собирают в стерильную пробирку для посева на стерильность, выделения микрофлоры и определения ее чувствительности к антибиотикам.

2) Остальную часть материала собирают в центрифужную пробирку и центрифугируют.

3) Из осадка приготовляют нативные и окрашенные мазки. Для окраски мазков используют краску Романовского-Гимза, азур II, эозин.

4) Нативные и окрашенные мазки просматривают под микроскопом при малом и большом увеличении.

5) Для гистологического исследования кусочки стенки кисты или только кутикулярной оболочки размерами 1x1 см фиксируют в нейтральном формалине, жидкости Карнуа.

6) Материал для гистологического исследования заливают в парафин; срезы толщиной 4-6 мкм окрашивают гематоксилин-эозином, пикрофуксином по Ван-Гизон, азур-эозином, PAS-реакцией, реактивом Шиффа на нуклеиновые кислоты по методу Браше и Фельгена.

Результаты исследования

При микроскопическом исследовании выявляют свободные или заключенные в выводковых капсулах юные и зрелые ввернутые и вывернутые протосколексы, фрагменты герминативной и кутикулярной (хитиновой) оболочек, известковые тельца, отпавшие от протосколексов большие и малые крючья, микроскопические ацефалоцисты (рис. 2-5).

При незрелых кистах (не содержащих протосколексы) основным диагностическим признаком цистного эхинококкоза является кутикулярная оболочка и ее фрагменты. Иногда при вскрытии кисты в бронх или брюшную полость выделяются крупные фрагменты кутикулярной оболочки или вся оболочка. Микроскопическая кутикулярная оболочка легко идентифицируется по характерной ярко выраженной слоистости, не утрачиваемой даже при некротических изменениях. Микроскопически кутикулярная оболочка представляет собой плотную эластическую ткань белого или желто-белого цвета.

При зрелых цистах (содержащих протосколексы) наличие юных и зрелых протосколексов является важным прямым диагностическим признаком цистного эхинококкоза, а оценка инвазивности и деструктивных изменений протосколексов является косвенным признаком жизнеспособности ларвоцисты эхинококка у больных, подвергнутых специфической химиотерапии.

При определении жизнеспособности протосколексов при слабо выраженных изменениях их морфологии проводят:

1) окрашивание погибших протосколексов некоторыми красителями (генциановый фиолетовый, толуидиновый синий, негрозин, Янус зеленый, метиленовый синий и др.);

2) активацию выворачивания и двигательной активности живых протосколексов при подогревании инкубационной среды до 39-40°C;

3) обработку протосколексов 80%-м раствором глицерина, что приводит к резкому изменению структуры и очертания тегумента метацестоды.

Прямыми показателями гибели протосколексов являются разной степени выраженности следующие признаки:

1) отсутствие двигательной активности, уменьшение количества или полное исчезновение известковых телец, сглаженность, помутнение и потемнение структуры паренхимы;

2) деформация короны крючьев или ее отпадение у вывернутых форм;

3) набухание, отслоение и нарушение целостности тегумента;

4) наличие "экскреторных пузырьков" вокруг хоботка вывернутых протосколексов. Последний признак проявляется не всегда (рис. 2).

Результаты гистологических исследований

Окраска гематоксилин-эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону необходимы для изучения структуры тканей паразита.

Гистохимические реакции применяют для оценки жизнеспособности возбудителя.

При микроскопии видно:

- кутикулярная оболочка имеет типичное слоистое строение, жизнеспособная киста хорошо окрашивается PAS-реакцией;

- зародышевый слой (герминативная оболочка) представлен рядом крупных клеток с темным ядром (рис. 3).

Выраженность зародышевого слоя у разных кист и разных больных может быть различной. Маложизнеспособная или нежизнеспособная киста теряет свою характерную структуру: исчезает зародышевый слой, кутикулярная оболочка утрачивает выраженную слоистость и теряет способность окрашиваться PAS-реакцией.

1.2.2. Лабораторная диагностика альвеолярного эхинококкоза

Отбор проб, необходимое оборудование и реактивы, подготовка к исследованию материала производятся по такой же методике, как и при цистном эхинококкозе (п. 1.2.1).

Результаты исследований

При альвеококкозе исследуют паразитарную ткань в зоне роста, прилежащие и отдаленные участки паренхимы печени, лимфатические узлы. Производят качественную и количественную оценку клеточных элементов воспалительного инфильтрата вокруг паразитарной ткани. Эти данные позволяют установить диагноз, определить характер роста возбудителя, его жизнеспособность и дать оценку состояния паренхимы пораженного органа. Паразитарная ткань при альвеококкозе представлена пузырьками различных размеров, окруженными зоной некроза и воспалительной инфильтрацией (рис. 6 и 7).

Выявляется четкая зависимость между активностью роста возбудителя и ответной реакцией тканей хозяина.

При малоактивном росте альвеококкоза выявляются крупные паразитарные пузырьки. Зона некроза вокруг пузырьков отсутствует. Пузырьки не контактируют непосредственно с тканью пораженного органа, отделены от нее четко выраженной реакцией фибропластического характера. Эозинофилы в клеточных инфильтратах отсутствуют или встречаются единичные клетки.

При активном росте альвеококка паразитарная ткань представлена мелкими и среднего размера пузырьками, среди которых видны последовательно почкующиеся формы. Кутикулярная оболочка слабо выражена. Зародышевый слой визуализируется не во всех пузырьках. Паразитарные пузырьки окружены зоной некроза, за которой располагается слабо выраженная воспалительная реакция альтернативно-инфильтративного характера. В клеточных инфильтратах преобладают лимфоциты, эпителиоидные клетки, плазмоциты и плазмобласты, большое число гигантских клеток и эозинофилов. Фибропласты содержатся в небольшом количестве.

При особо активном злокачественном росте альвеококка паразитарная ткань представлена мелкими почкующимися пузырьками, часть из которых некротизирована. Кутикулярная оболочка тонкая, зародышевый слой слабо выражен. Пузырьки окружены широкой зоной некроза, содержащей обломки эозинофилов. За зоной некроза располагается неширокая зона воспалительной реакции альтернативного характера. В клеточных инфильтратах преобладают эозинофилы, эпителиоидные клетки, макрофаги, лимфоциты и плазматические клетки. В отдельных случаях инфильтраты состоят почти из одних эозинофилов, небольшого числа лимфоцитов и плазмоцитов. У больных в терминальной стадии заболевания даже при активном росте альвеококка в воспалительных инфильтратах исчезают эозинофилы.

Во всех случаях альвеококкоза человека, за крайне редким исключением, паразитарные ларвоцисты не содержат протосколексов.

Установление жизнеспособности паразита

При снижении жизнеспособности паразита или его гибели наблюдаются некротические изменения паразитарной ткани, отложение в ней солей кальция вплоть до полной кальцификации пузырьков. Погибшие пузырьки окружаются мощной рубцовой тканью.

Для определения жизнеспособности ацефалоцисты выделяют из паразитарного материала следующим образом:

1) Биоптат измельчают ножницами до гомогенного состояния.

2) Полученный гомогенат процеживают через мельничный газ, промывая одновременно физиологическим раствором.

3) Фильтрат помещают в стакан и через 10-15 мин отстаивания удаляют надосадочную жидкость, замещают ее свежим физиологическим раствором.

4) Эту операцию повторяют несколько раз до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной.

5) Приготовление инокулята завершают удалением надосадочной жидкости и добавлением к осадку концентрированного раствора антибиотиков.

Результаты исследования

Наличие и жизнеспособность ацефалоцист в инокуляте определяются при микроскопии проб осадка, помещенных в чашки Петри или между двумя предметными стеклами.

Идентифицируют следующие признаки живых нативных ацефалоцист альвеококка:

- крупные ларвоцисты (диаметром 0,4-0,8 мм) имеют преимущественно неправильную форму; сниженный тургор; хитиновая оболочка неплотно прилегает к фиброзной капсуле, прозрачная, бесцветная, слоистая;

- мелкие ацефалоцисты (диаметром 0,1-0,3 мм) имеют преимущественно круглую или овальную форму; хитиновая оболочка прозрачная, бесцветная, однослойная, плотно прилегает к фиброзной капсуле;

- герминативный (паренхимный) слой ацефалоцист очень тонкий и визуализируется в виде легкой зернистости у всех ацефалоцист в нативных неокрашенных препаратах.

1.2.3. Метод исследования жизнеспособности паразита in vivo (биопроба)

Применяется в специализированных научно-исследовательских лабораториях.

Для определения жизнеспособности и штаммовых особенностей возбудителя проводят исследование по имплантации паразитарной ткани в брюшную полость лабораторных животных, восприимчивых к альвеококкозу. Проведение такого исследования стало возможным после первого внутрибрюшного успешного заражения хлопковых крыс изолированными микроскопическими ацефалоцистами из паразитарного "узла" в печени оперированного больного альвеококкозом. Получению тех же изолированных ацефалоцист альвеококкоза способствует использование недавно выявленного феномена сниженной адгезии хитиновой оболочки ларвоцист альвеококка к окружающей соединительнотканной капсуле в печени у человека. Это свойство обеспечило возможность выделения из малых фрагментов пораженной альвеококком печени больного (постоперационный материал) большого количества ацефалоцист альвеококка, пригодных для диагностического и экспериментального исследований (рис. 8).

Отбор проб

В качестве паразитарного материала используют выделенный в день операции альвеококковый "узел" с прилежащими участками печени.

Необходимое оборудование и материал

Инокулят из пораженного органа

Хлопковые крысы

Подготовка к исследованию

С помощью полученного инокулята осуществляют имплантацию ацефалоцист инъекционно в брюшную полость хлопковых крыс обоего пола в возрасте 1,0-1,5 месяцев. Доза инвазированного материала составляет 200-500 ацефалоцист на одно животное.

Особенности течения вторичного альвеококкоза у хлопковых крыс (скорость пролиферации, созревания ларвоцист, прироста биомассы паразита) определяют при вскрытии животных в разные сроки после заражения (рис. 9).

Результаты исследования биопробы позволяют:

- оценить жизнеспособность паразита у больного;

- выявить штаммовые особенности исследуемого изолята возбудителя (морфология, скорость роста и созревания как на ларвальной, так и на имагинальной стадиях развития), что представляется важным как в эпидемиологическом аспекте (выявление новых природных очагов альвеококкоза), так и в тактике консервативного лечения больных (необходимость применения прозиквантеля в сочетании с карбаматбензилендазолами при лечении больных, в паразитарных кистах которых обнаружены протосколексы альвеококка).

1.3. Лабораторная диагностика трихинеллеза

Лабораторная диагностика трихинеллеза проводится:

- у лиц с подозрением на трихинеллез - методом иммуно-ферментного анализа (ИФА-исследование) в соответствии с действующими методическими указаниями или, в исключительных случаях, методом биопсии мышечной ткани;

- если трихинеллы найдены в мясе, с употреблением которого в пищу связывается данное заболевание, то диагноз последнего может считаться бесспорным и применение биопсии мышечной ткани больного излишне. Исследование мяса (остатков мясных продуктов) по эпидемиологическим показаниям проводится в испытательных лабораторных центрах Роспотребнадзора и Госветнадзора в соответствии с действующими нормативными документами;

- при судебно-медицинской экспертизе, когда исследуются гистологические препараты секционного материала с подозрением на трихинеллез.

При исследовании мышечной ткани на наличие возбудителей трихинеллеза используются два метода:

- трихинеллоскопии;

- переваривания в искусственном желудочном соке.

Биопсия мышечной ткани (поперечнополосатых мышц)

Хирургическим путем или на секции получают биопсию мышечной ткани двуглавой или икроножной мышц (ближе к сухожилию). Материал помещают в стерильную стеклянную посуду с физиологическим раствором.

Лабораторное исследование проводят сразу после биопсии. Если лабораторное исследование откладывается на какой-то срок, пробы мышц помещают в консервант или замораживают. Консервантом может служить концентрированный (30 - 50%-й) раствор хлорида натрия.

1.3.1. Метод трихинеллоскопии

Необходимые реактивы и оборудование

Стеклянный компрессорий

Стереоскопический микроскоп (объективы x8, x10; окуляры x7, x10)

Препаровальные иглы

Термостат

Ножницы Купера, изогнутые

Скальпель

Эмалированные кюветы

Чашки Петри

Пипетки

Магнитная мешалка

Соляная кислота концентрированная

Пепсин кристаллический

Раствор пепсина 3%-й

Дистиллированная вода

Аппарат Бермана

Сито из мельничного газа (N 26)

Химический стакан 200,0 мл

Стеклянные палочки

Пробирки центрифужные с крышкой

Весы

Центрифуга

Компрессорная трихинеллоскопия

Подготовка к исследованию

1) Каждую пробу мышц перед исследованием помещают в чашки Петри, расположенные на эмалированных кюветах, куда помещают и необходимый инструментарий (ножницы, пинцеты, препаровальные иглы), предметные стекла. Работа проводится с соблюдением правил техники безопасности.

2) Из каждой пробы мышц (от одного больного) делают срезы строго вдоль мышечных волокон дельтовидной, двуглавой или икроножных величиной с "овсяное зерно".

3) Мышечные срезы помещают в 5%-й раствор едкой щелочи и выдерживают до исследования в течение 1 ч при комнатной температуре или 10 мин в термостате при температуре 45°C.

4) Срезы с обызвествленными капсулами, где личинки не просматриваются, предварительно помещают в 5-10%-й раствор соляной кислоты на 1-2 ч, чтобы растворить известь, затем помещают в глицерин или молочную кислоту на 20-30 мин в условиях термостата при 37°C (для просветления).

5) Срезы переносят в компрессорий и микроскопируют.

6) Каждый срез помещают на отдельный квадрат нижнего стекла компрессория (всего в компрессории 24 квадрата) и сдавливают верхним стеклом путем завинчивания закрепляющих винтов компрессория.

7) Микроскопируют все срезы, применяя стереоскопический микроскоп (увеличение: объектив x8 или x10, окуляр x7 или x10).

Примечание. Диагностика личинок трихинелл бывает затруднена, если срезы толстые, или кусочки мышц подсохли, или в срезах обильные включения жира, или пробы мышц фиксированы формалином, или личинки находятся в обызвествленных капсулах.

В этих случаях:

- срезы мышц можно поместить в 5%-й раствор едкой щелочи и выдержать в течение 1 ч при комнатной температуре или 10 мин в термостате при температуре 45°C;

- срезы с обызвествленными капсулами, где личинки не видны, помещают предварительно в 5-10%-й раствор соляной кислоты на 1-2 ч, чтобы растворить известь, затем помещают в глицерин или молочную кислоту для просветления.

1.3.2. Методы переваривания в искусственном желудочном соке

Классический метод переваривания по Березанцеву Ю.А.

Подготовка к исследованию

1) Мышечную ткань измельчают.

2) Готовят раствор искусственного желудочного сока: вода дистиллированная 1000 мл, концентрированная соляная кислота 7 мл, пепсин кристаллический 15 г. Пепсин добавляют в последнюю очередь.

3) Желудочный сок наливают в химический стакан, помещают в него измельченные пробы мышечной ткани в соотношении 10:1.

4) Тщательно размешивают.

5) Сосуд помещают в термостат при температуре 39°C на 16-18 ч (периодически помешивают стеклянной палочкой или с помощью магнитной мешалки).

6) После окончания переваривания всю массу выливают в аппарат Бермана на сито из мельничного газа (N 26) или центрифугируют в тканях или пробирках. Через 15-20 мин личинки оседают на дне сосуда.

7) Надосадочную жидкость отсасывают пипеткой с резиновой грушей, а осадок микроскопируют в чашках Петри с использованием стереоскопического микроскопа.

Ускоренный метод переваривания по Владимировой П.А.

Подготовка к исследованию

1) Измельченные пробы мышечной ткани помещают в химический стакан с искусственным желудочным соком в соотношении 1:25.

2) Выдерживают смесь в термостате при температуре 42-47°C в течение 3,5-4,0 ч при периодическом помешивании.

3) После отстаивания в течение 15-20 мин надосадочную жидкость осторожно сливают.

4) Осадок помещают на предметное стекло или в чашку Петри и исследуют под малым увеличением стереоскопического микроскопа.

Результат исследования

Юные трихинеллы (личинки) имеют характерный вид спирально закрученных образований, инкапсулированные в мышечных тканях. Капсула имеет лимонообразную форму размером (0,25-0,66 x 0,21-0,42) мм, содержит одну мышечную трихинеллу, реже 2-3.

1.4. Лабораторная диагностика филяриозов

Филяриозы - это гельминтозы, возбудители которых относятся к нематодам, характеризуются трансмиссивным путем передачи. Наибольшее распространение имеют филяриозы лимфатической системы - вухериоз и бругиоз, поражающие кожу и ткани и среды глаза - онхоцеркоз, лоаоз, дирофиляриоз.

В России регистрируется местный дирофиляриоз, остальные виды филяриозов являются завозными из стран тропического пояса.

Лабораторный диагноз филяриозов устанавливается по обнаружению микрофилярий в крови либо биоптатах кожи, в тканях и средах глаза.

Микрофилярии накапливаются и длительно циркулируют в периферических кровеносных сосудах или мигрируют в поверхностных слоях кожи. При онхоцеркозе они могут проникать также в оболочки и среду глаза. Длительность жизни личинок (микрофилярий) в организме человека составляет от нескольких месяцев до 2-5 лет.

В организме человека микрофилярии не растут, морфологически не изменяются и имеют четко выраженные видовые признаки (Прилож. 6).

Важное диагностическое значение имеет также тот факт, что для микрофилярий характерен определенный ритм их присутствия в периферических кровеносных сосудах с четко выраженным пиком микрофиляриемии: только днем, только ночью или в течение суток равномерно.

Отбор проб крови

При подозрении на лимфатические филяриозы исследуют кровь из пальца или венозную кровь. Кровь из пальца берется обязательно в ночное время (после 19.00 ч). Для выявления микрофилярий Loa loa отбор крови производится в дневное время.

В венозной крови микрофилярии присутствуют в течение суток равномерно, поэтому производить забор крови в ночное время не требуется. Объем проб крови из пальца или вены указывается в описании методов исследования.

1.4.1. Лабораторная диагностика онхоцеркоза

При подозрении на онхоцеркоз исследуют биоптат кожи.

Приготовление биоптатов кожи

1) Эпидермис срезается с пораженного участка кожи диаметром 2-3 мм: кончиком иглы приподнимают эпидермис кожи и лезвием бритвы или острым глазным скальпелем бескровно, соблюдая правила асептики. Делают одновременно несколько срезов, главным образом с тех участков, на которых заметны изменения кожи и отмечается зуд (чаще в области гребешков подвздошной кости, боковых поверхностей грудной клетки).

2) Срезы эпидермиса помещают в стерильную чашку Петри с физиологическим раствором и доставляют в лабораторию для исследований.

3) Микроскопию лучше проводить с МБС при увеличении: окуляры x12,5. Срезы для исследований помещают на предметные стекла, для этого сначала рисуют на них карандашом по стеклу 3-4 ячейки диаметром 1 см и затем заполняют их водой или физиологическим раствором. В каждую ячейку помещают 1-2 биоптата кожи. Во избежание высыхания препараты хранят на влажных ватных тампонах в чашке Петри, сверху закрытой второй чашкой. В таких условиях личинки сохраняют подвижность в течение двух и более суток.

4) Микроонхоцерки обладают фототропизмом, в связи с чем для улучшения их выхода из биоптатов кожи в физиологический раствор перед микроскопией препараты содержат в темноте в течение 1-2 ч.

Для обнаружения живых микрофилярий в биоптатах кожи используют два метода:

- метод исследования необогащенного нативного препарата;

- метод исследования обогащенного препарата.

Методы применяются при диагностике онхоцеркоза и кожного мансонеллеза (стрептоцеркоза).

Метод исследования необогащенного нативного препарата

Необходимые реактивы и оборудование

Стерильные иглы

Стерильное лезвие бритвы или глазной скальпель

Стерильные чашки Петри

Физиологический раствор

Предметные и покровные стекла

Микроскоп, стереомикроскоп

Подготовка к исследованию

1) Биоптат эпидермиса кожи помещают на предметное стекло в каплю физиологического раствора.

2) Микроскопируют сразу после приготовления препарата при увеличении: объектив x8 или x10, окуляр x10. При отсутствии выходящих личинок из биоптата микроскопию проводят каждые 2 ч в течение 2 суток, сохраняя препараты во влажной камере.

3) В жидкости вокруг биоптата кожи живые личинки, даже единичные, легко выявляются благодаря их подвижности.

4) Из положительных препаратов можно приготовить постоянные препараты: удалить срезы кожи, высушить, зафиксировать 96° этанолом в течение 10 мин, окрасить по Романовскому-Гимзе.

Метод исследования обогащенного препарата

Необходимые реактивы и оборудование

Стерильные иглы

Стерильное лезвие бритвы или глазной скальпель

Стерильные центрифужные пробирки

Физиологический раствор

Предметные и покровные стекла

Микроскоп, стереомикроскоп

Подготовка к исследованию

1) Срезы кожи помещают в центрифужную пробирку с физиологическим раствором и оставляют при температуре 24-37°C на 24-36 ч.

2) Надосадочную жидкость сливают.

3) Осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют при увеличении: объектив x8 или x10, окуляр x10.

4) При обнаружении личинок препараты окрашивают и идентифицируют до вида.

5) Микроскопическое исследование:

- микроскопируют готовые нативные препараты с помощью МБС при увеличении: окуляр x12,5; объективы x2, x4, x6 последовательно;

- окрашенные препараты исследуют любым световым микроскопом при увеличении: окуляр x10. Объектив x8 или x10.

Идентификация микрофилярий Onchocerca volvulus

Микроонхоцерки идентифицируются по следующим морфологическим признакам: крупные личинки, ядра соматических клеток крупные, глыбковидные, отсутствуют на головном и хвостовом концах личинок; чехлик отсутствует (Прилож. 6).

Микрофилярии Mansonella streptocerca идентифицируют по характерной форме хвостового конца, загнутого в виде крючка. Ядерная колонка из 9-12 округлых ядер доходит до вершины хвоста (Прилож. 6).

1.4.2. Лабораторная диагностика филяриозов лимфатической системы (вухериоза и бругиоза)

Для обнаружения микрофилярий в крови используют следующие методы:

1) Исследование крови из пальца:

- метод исследования нативного мазка крови из пальца;

- микрокапиллярный метод обнаружения живых микрофилярий по Супряге.

2) Исследование венозной крови:

- метод концентрации осадка по Кнотту;

- метод мембранной фильтрации по Беллу.

Метод исследования нативного мазка крови из пальца

Необходимые реактивы и оборудование

Стерильные скарификаторы или иглы

Обезжиренные предметные стекла

Дистиллированная вода

Иммерсионное масло

Краска Романовского-Гимза

Микроскоп, стереомикроскоп

Подготовка к исследованию

1) Кровь из пальца (до 0,25 мл - 10 капель) помещают на предметное стекло в рамку, обведенную карандашом по стеклу, размером 2x4 см.

2) Добавляют дистиллированную воду каплями и одновременно размешивают для ускорения гемолиза эритроцитов.

3) Микроскопируют гемолизированный мазок, используя стереоскопический бинокулярный микроскоп с увеличением: окуляры x12,5; объективы x2, x4, x6 - последовательно.

4) Препараты с обнаруженными живыми подвижными личинками высушивают, фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе.

5) Идентифицируют и подсчитывают микрофилярии по видам при исследовании препаратов под иммерсией (x90) (Прилож. 6).

Микрокапиллярный метод обнаружения живых микрофилярий по Супряге

Необходимые реактивы и оборудование

Стерильные скарификаторы или иглы

Обезжиренные предметные стекла

Дистиллированная вода

Иммерсионное масло

Краска Романовского-Гимза

Микрокапилляры-гематокриты, обработанные гепарином, размером (/75,0-100,0/x/0,8-1,0/) мм или капилляры Панченкова

Пластилин

Центрифуга

Микроскоп, стереомикроскоп

Подготовка к исследованию

1) Кровь из пальца собирается в несколько обработанных гепарином микрокапилляров, у которых после заполнения кровью один конец закрывается пластилином.

2) Микрокапилляры в вертикальном положении оставляют на пластилиновой подушке до разделения эритроцитов и плазмы либо микрокапилляры центрифугируют при 2000 об./мин в течение 3 мин

3) Микрокапилляры с кровью от одного обследуемого кладут на предметное стекло и скрепляют полоской лейкопластыря, на которую наносят маркировку с регистрационным номером исследования.

4) Всю поверхность микрокапилляров покрывают тонким слоем иммерсионного масла и микроскопируют.

5) Микрокапилляры, содержащие подвижные микрофилярии, разламывают по границе разделения эритроцитов и плазмы крови.

6) Плазму с помощью микрогруши выдувают на обезжиренное предметное стекло и повторно микроскопируют для подтверждения наличия живых микрофилярий.

7) В плазму добавляют несколько капель 1%-го раствора уксусной кислоты и делают мазок, высушивают на воздухе, фиксируют, окрашивают.

8) Идентифицируют и подсчитывают личинки по видам под иммерсией (x90), предварительно покрыв тонким слоем иммерсионного масла всю поверхность препарата.

9) Метод нативного мазка для обнаружения живых личинок используют для подсчета микрофилярии в препарате крови.

Примечание. Микрокапилляры по той же методике могут быть заменены капиллярами Панченкова, используемыми при исследовании крови на СОЭ:

1) Капилляр заполняют кровью на всю его длину, отстаивают в штативе.

2) Микроскопируют плазму непосредственно в капилляре, поместив его на предметное стекло и покрыв поверхность капилляра иммерсионным маслом.

3) При обнаружении живых микрофилярий готовят препарат из плазмы на предметном стекле и исследуют, как описано выше по методике.

Методы исследования венозной крови

Методы исследования венозной крови более эффективны благодаря большому объему (не менее 1 мл) исследуемой крови.

Метод концентрации микрофилярий в осадке по Кнотту

Необходимые реактивы и оборудование

Раствор уксусной кислоты 1%-й или раствор формалина 2%-й

Обезжиренные центрифужные пробирки

Обезжиренные предметные стекла

Дистиллированная вода

Краска Романовского-Гимза

Иммерсионное масло

Центрифуга

Микроскоп, стереомикроскоп

Подготовка к исследованию

1) Кровь из вены (1 мл) собирают в центрифужную пробирку, гемолизируют 9 мл 1%-го раствора уксусной кислоты.

2) Пробирки центрифугируют при 2000 об./мин в течение 3 мин.

3) Полученный осадок (0,5-1,0 мл) переносят на обезжиренные предметные стекла и микроскопируют в нативном виде.

4) Препараты с обнаруженными личинками высушивают, фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе.

5) Идентификация вида личинок проводится под иммерсией (x90).

Метод мембранной фильтрации микрофилярий по Беллу, модифицированный Супрягой и Андреенковым

Необходимые реактивы и оборудование

Раствор уксусной кислоты 1%-й или раствор формалина 2%-й

Обезжиренные центрифужные пробирки

Обезжиренные предметные стекла

Дистиллированная вода

Мембранные фильтры с диаметром пор 0,8-5,0 мкм

Краска Романовского-Гимза

Иммерсионное масло

Установка для вакуумного фильтрования

Фильтродержатель

Центрифуга

Микроскоп, стереомикроскоп

Специальное оборудование: аппарат для фильтрации крови состоит из воронки-фильтродержателя с прямоугольным отверстием размером меньше фильтра. Для ускорения фильтрации используют вакуум.

Подготовка к исследованию

1) К 1 мл крови в центрифужной пробирке добавляют 9 мл 1-3%-го раствора уксусной кислоты или 2%-го раствора формалина.

2) Фильтруют гемолизированную кровь и смывы 2-3 раза с пробирки на мембранные фильтры под вакуумом.

3) Полученный осадок на фильтре под вакуумом фиксируют крутым кипятком в объеме 20-30 мл и фильтры вынимают из фильтродержателя.

4) Фильтры высушивают и окрашивают по Романовскому-Гимзе.

5) Контроль качества окраски личинок в препаратах проводится по степени окрашивания ядер лимфоцитов.

6) Окрашенные фильтры тщательно споласкивают водой и высушивают.

7) Микроскопирование фильтров проводят на предметном стекле, предварительно покрыв всю поверхность фильтра тонким слоем иммерсионного масла, при малом увеличении с применением препаратоводителя.

8) Идентификацию окрашенных микрофилярий проводят под иммерсией (x90), их количество учитывают отдельно по видам.

Примечание. Вместо специального аппарата можно использовать шприц с фильтродержателем: 25-миллиметровый держатель Суини с 25-миллиметровой мембраной "Миллипор" размером пор 5 мкм, который поддерживается снизу мягкой прокладкой.

Микрофилярии на окрашенных фильтрах, пропитанных иммерсионным маслом, сохраняют морфологические признаки в течение 5 лет и более.

Микроскопическое исследование препаратов крови

Нативные неокрашенные препараты микроскопируют с помощью любого стереоскопического бинокулярного микроскопа при увеличении: окуляр x12,5; объективы x2, x4, x6 - последовательно.

Идентификация личинок

Идентификацию личинок на окрашенных препаратах проводят на любом световом микроскопе при увеличении окуляра x10, объективов x10, x20, x40.

Микрофилярии идентифицируют по морфологическим признакам:

- наличие чехлика W. bancrofti, B. malayi, Loa loa - чехлик выступает за головной и хвостовой концы тела;

- отсутствие чехлика M. perstans, M. ozzardi;

- расположение окрашенных ядер соматических клеток внутри тела - на хвостовом конце в виде ядерной колонки (диагностический признак);

- W. bancrofti - ядерная колонка заканчивается несколькими удлиненными ядрами, не доходящими до вершины хвостового конца;

- B. malayi - ядерная колонка не доходит до хвостового конца. Отдельно от ядерной колонки и друг от друга расположены два ядра, одно - субтерминально на самой хвостовой вершине;

- Loa loa - одноядерная колонка доходит до вершины хвостового конца;

- M. perstans - ядерная колонка компактная по всей длине тела, форма хвостового конца - пальцевидная;

- M. ozzardi - ядерная колонка заполняет хвостовой конец, форма хвостового конца - суженная;

- ядра соматических клеток у всех видов микрофилярий на головном отделе отсутствуют (Прилож. 6).

1.4.3. Методы диагностики подкожного дирофиляриоза

Необходимые реактивы и оборудование

Раствор уксусной кислоты или формалина 1%-й

Раствор глицерина 50%-й

Иммерсионное масло

Дистиллированная вода

Мембранные фильтры

Краска Романовского-Гимза или гематоксилин Эрлиха

Центрифуга

Обезжиренные предметные стекла

Стеклянная пластина 8x15 см

Миллиметровая линейка длиной до 30 см

Микроскоп, стереомикроскоп

Подготовка к исследованию

В лабораторию доставляются следующие объекты для исследований:

- взрослые самки и самцы дирофилярий или их фрагменты, выделенные хирургическим путем или самопроизвольно вышедшие из пораженных тканей;

- гистологические препараты внутренних органов и тканей;

- кровь, пунктаты подкожных опухолей;

- удаленные подкожные опухоли, гранулемы, кисты, цисты и другие патологические образования.

Диагностические признаки дирофилярий

Возбудитель дирофиляриоза - Dirofilaria repens, в препаратах определяются взрослые особи или их фрагменты.

При макроскопическом исследовании визуально идентифицируют взрослых гельминтов, поместив их на большую стеклянную пластину, которую предварительно смачивают водой или 50%-м раствором глицерина. На этой пластине производят измерение длины гельминтов.

Взрослые гельминты - дирофилярии - имеют нитевидное тело, покрытое тонко исчерченной кутикулой. Половозрелые гельминты D. repens - живородящие. Самки от самцов отличаются размерами: самки в 2,5-3,0 раза длиннее самцов.

Самка D. repens. Тело сужено к концам. Кутикула белая с четкой продольной и нежной поперечной исчерченностью. Рот простой, ротовая капсула рудиментарна. Длина тела половозрелой самки 120-150 мм, ширина 0,48-0,55 мм. Пищевод 1,05-1,53 мм, передняя мускульная часть 0,49-0,54 мм. Пищевод отделен от кишечника тремя маленькими клапанами. Нервное кольцо расположено на расстоянии 0,31-0,37 мм от головного конца. Цервикальные сосочки и экскреторное отверстие не обнаружены. Вульва оплодотворенной самки окаймлена слегка выступающими губами и расположена на расстоянии 1,84-1,92 мм от головного конца. Вагина длинная, около 3,42 мм. У половозрелых самок вагина и яйцеводы описывают многочисленные петли, которые тянутся сначала вперед, затем заворачиваются назад и соединяются с матками, занимающими почти всю полость тела. Скрученные яичники расположены в заднем отделе тела. Кишечник тонкий, более или менее прямой. Анус расположен почти терминально. Хвост с тупым кончиком, слегка загнут вентрально.

Самец D. repens. Длина тела 58,0-70,0 мм, максимальная ширина 0,41 мм. Ширина тела в области конца пищевода доходит до 0,38 мм, а на уровне клоаки - 0,36 мм. Длина пищевода достигает 1,74 мм. Нервное кольцо отстоит от головного конца на расстоянии 0,26 мм. Позади нервного кольца, на расстоянии 0,34 мм от головного конца, располагаются шейные сосочки. На голове нет никаких орнаментаций, заметны лишь выступающие субмедианные головные сосочки (4 шт.). Хвостовой конец тупо закруглен. Отверстие клоаки отстоит от хвостового конца на 0,38 мм. Половые сосочки асимметричны: с правой стороны заметны 4 крупных преанальных сосочка и два постанальных; с левой стороны имеются 3 преанальных сосочка, а постанальные отсутствуют. Спикулы неравной величины и неодинаковой структуры. Левая спикула достигает 0,45 мм длины. Проксимальный конец левой спикулы имеет ширину 0,03 мм; постепенно спикула суживается и приобретает желобовидную форму. На расстоянии 0,21 мм от проксимального конца спикула расщепляется как бы на 2 отдела, соединенные друг с другом мембраной, которые вскоре снова соединяются воедино. Дистальный конец левой спикулы заострен. Правая толстая и короткая спикула достигает 0,18 мм длины при максимальной ширине 0,03 мм. Она имеет форму желоба, постепенно утончающегося по направлению кзади, дистальный конец тупо закруглен.

Основной диагностический признак нематод рода Dirofilaria - наличие кутикулярной орнаментации в виде продольных гребней на поверхности тела гельминтов. При большом увеличении на теле дирофилярий просматривается также нежная поперечная исчерченность кольцевидной формы, благодаря которой дирофилярии могут активно продвигаться под кожей (D. repens) или упираться в стенки кровенос и экскреторной пор: у D. repens имеется только анальная пных# сосудов (D. immitis).

Идентификация микрофилярий проводится на окрашенных препаратах под большим увеличением (окуляр x10, объектив x40) и с иммерсией по наличию анальнойоры#, у D. immitis - анальная и экскреторная поры.

Микрофилярии D. repens имеют длину 0,22-0,29 мм, по ширине равны диаметру эритроцита. Микрофилярии циркулируют по кровеносным и лимфатическим сосудам, поэтому могут проникать в любые органы и ткани. Микрофилярии не имеют чехлика, передний конец их тупой, задний - заостренный, нитевидный. Ядерная колонка не доходит до вершины хвостового конца.

При исследовании гистологических срезов патологического материала (гранулемы, цисты, кисты, опухоли и др.) на поперечных срезах кутикулярной оболочки гельминта диагностируют по наличию выступающих острых "шипов" - вершин продольных гребней, а также выявляется внутреннее содержимое тела гельминта - кишечник, половые трубки и другие элементы. На окрашенных препаратах внутри матки самок могут быть обнаружены микродирофилярии, имеющие окрашенные ядра соматических клеток, так же, как при обнаружении их в крови или в пунктатах подкожных опухолей.

1.4.4. Диагностика сердечно-легочного дирофиляриоза

Лабораторный диагноз D. immitis устанавливается при микроскопическом исследовании как взрослых особей, выделенных из кровеносных сосудов сердца и тканей легких, так и гистологических препаратов органов локализации возбудителя. Взрослые особи самок D. immitis длиннее, по сравнению с D. repens, вдвое (150-300 мм) и размеры самцов D. immitis длиннее D. repens втрое (до 200 мм); их диагностируют по наличию продольных кутикулярных гребней у взрослых особей. В гистологических срезах D. immitis идентифицируют по наличию "шипов" - вершин кутикулярных гребней (Прилож. 6).

Иллюстрации диагностических признаков микрофилярий приведены в Прилож. 6, морфологического строения взрослых дирофилярий - в Прилож. 7.