Раздел 2. Лабораторная диагностика протозоозов

Раздел 2. Лабораторная диагностика протозоозов

2.1. Лабораторная диагностика протозойных инфекций кишечника

Протозойные инфекции кишечника обусловлены паразитированием в кишечнике одноклеточных эукариотных организмов разных типов царства Protista: Rizopoda (паразитические амебы), Polymastigota (жгутиконосцы), Sporozoa (кокцидии) и Ciliophora (инфузория). Многие паразитические организмы распространены повсеместно (паразитические амебы, бластоцисты, диентамебы, лямблии). Однако значительное число видов встречается преимущественно в тропической и субтропической зоне (дизентерийная амеба, изоспора, циклоспора) и/или в регионах с развитым свиноводством и животноводством (балантидии, криптоспоридии, саркоцисты).

Для каждого вида характерна своя экологическая ниша. В тонком кишечнике, за исключением жгутиконосца Lamblia intestinalis, преобладающими видами простейших являются кокцидии: изоспоры, криптоспоридии, саркоцисты и циклоспоры. В их жизненном цикле существуют эндогенные внутриклеточные стадии, развивающиеся в эпителии кишечника или имеющие тропизм к области его микроворсинок (криптоспоридии). Толстый кишечник колонизируют паразитические амебы, балантидии, бластоцисты и при определенных условиях их представители Entamoeba histolytica u Balantidium coli могут нарушать целостность слизистой.

Протозойные инфекции кишечника диагностируются прямыми методами по обнаружению в биологическом материале (кал, дуоденальное содержимое - проба А) простейших на разных стадиях развития - трофозоитов и цист. Для этого используют микроскопические методы диагностики.

Возможно применение экспресс-тестов по определению антигенов лямблий, криптоспоридий в кале.

В последние годы успешно развивается ПЦР-диагностика протозоозов.

2.1.1. Микроскопические методы исследования кала на простейшие кишечника

К микроскопическим методам относятся основные и специальные методы исследования.

Основные методы исследования кала на простейшие кишечника

К основным методам исследования кала на наличие простейших кишечника относятся методы формалин-эфирной или уксусной седиментации и их модификации: методы с применением одноразовых концентраторов "PARASEP" и минисистемы "Real" (раздел 1).

Необходимые реактивы и оборудование (раздел 1).

Подготовка к исследованию препаратов нативного кала

1) Налить в центрифужные пробирки 9 мл 10%-го раствора формалина.

2) Пробу перемешать и добавить в формалин кал объемом 1 г, в случае жидкого стула - не менее 3-4 мл кала.

3) Перемешать.

4) Профильтровать через 2 слоя марли или металлическое ситечко.

5) Если требуется, довести объем суспензии до 8 мл.

6) Долить 2 мл эфира, заткнуть пробку.

7) Энергично встряхивать пробирку не менее 30 с.

8) Центрифугировать при 1500 об./мин в течение 2 мин или при 2000 об./мин в течение 1 мин.

9) После центрифугирования образуются 4 слоя: осадок, раствор формалина, коагулированный белок и фекальный детрит - "пробка" и сверху эфир с растворенными в нем жирами.

10) Верхние 3 слоя удалить резким опрокидыванием пробирки (полипропилен легко отделяет "пробку").

11) Осадок суспендировать и 1-2 капли поместить на предметное стекло в каплю 2%-го раствора Люголя.

12) Микроскопировать при увеличении: окуляр x10, объектив x40.

Применение основных методов седиментации, как и его модификаций, без дополнительной окраски позволяет:

- обнаружить почти всех представителей простейших кишечника: цисты и трофозоиты жгутиковых и амеб, основные формы бластоцист, ооцисты изоспор, балантидии;

- при условии 2-3-кратного исследования кала или сборе в консервант трех порций кала методы являются наиболее информативными из всех существующих методов для микроскопической диагностики простейших кишечника.

2.1.2. Специальные методы исследования кала на простейшие кишечника

Применяются для выделения мелких (3-5 мкм) и плохо различимых даже при большом увеличении микроскопа простейших (криптоспоридии и некоторые формы бластоциста), а также для проведения дифференциальной диагностики четырехядерных# цист энтамеб, то есть для видовой идентификации дизентерийной амебы.

К специальным методам исследования на наличие простейших кишечника относятся методы влажного мазка с физиологическим раствором, раствором Люголя или метиленовым синим; методы приготовления постоянно окрашенных препаратов (трихромовый метод, модифицированный метод окраски по Цилю-Нильсену).

Метод приготовления влажного мазка нативного кала с физиологическим раствором, растворами Люголя и метиленового синего

Исследование свежего кала применяется для дифференциальной диагностики простейших и, в особенности, четырехядерных# цист и трофозоитов амеб. Диагностика до вида может быть осуществлена по типичному движению живых паразитов. Но практически трудно осуществить доставку в лабораторию свежего кала в течение 30-40 мин. Более длительное время транспортирования приводит к потере подвижности и дегенерации трофозоитов всех видов амеб, жгутиковых и ресничных. В таком случае применяется окрашивание растворами Люголя и метиленового синего.

Необходимые реактивы и оборудование

Обезжиренные предметные и покровные стекла (24x24 мм)

Стеклянные палочки или деревянный шпатель

Физиологический раствор

Раствор Люголя 2%-й

Метиленовый синий раствор по прописи

Микроскоп

Подготовка к исследованию

1) Предварительно нанести на предметные стекла 1-2 капли физиологического раствора, раствора Люголя и метиленового синего.

2) Из пробы кала выбрать обычную порцию и порцию с патологическими признаками (слизь, кровь), смешать с каплей подготовленных на предметном стекле растворов, накрыть покровным стеклом.

3) Препарат должен быть почти прозрачным, светопроницаемой плотности, чтобы "можно было видеть газетный шрифт".

4) Микроскопировать при увеличении: окуляр x10, объектив x10, а затем окуляр x10, объектив x40. При необходимости можно осторожно использовать водную иммерсию и увеличение: окуляр x10, объектив x100.

Результаты исследования

В неокрашенных препаратах простейшие отличаются от фекального детрита светопреломлением, ядра живых амеб не видны.

Метиленовый синий и йод обнаруживают внутреннюю структуру клеток: строение оболочек, цитоплазмы, наличие гликогена, хроматоидных телец, число ядер и морфологию ядерных структур (Прилож. 5). Окраска метиленовым синим позволяет также дифференцировать простейших от других клеток, встречающихся в кале: лейкоцитов, макрофагов, клеток эпителия.

Если удается прижизненная диагностика в теплом физиологическом растворе, оценивают характер движения трофозоитов (Прилож. 5).

Методы приготовления постоянных окрашенных препаратов кала

Методы приготовления постоянных окрашенных препаратов из нативного кала включают применение фиксирующих смесей на основе сулемы и окраску препаратов трихромовым методом или по Цилю-Нильсену, что позволяет выявлять морфологию ядерных структур.

Метод окрашивания трихромовой краской

Самый простой и быстрый метод для обнаружения структуры ядер и компонентов цитоплазмы амеб.

Необходимые реактивы и оборудование

Предметные стекла обезжиренные, желательно с шлифованным краем, покровные стекла 24x24 мм

Батарея стеклянных банок с притертыми крышками для хранения и использования реактивов при окраске: диаметр горла не менее 24 мм для погружения предметного стекла

Стеклянные палочки

Пинцет пластмассовый

Фильтровальная бумага

Фиксатор Шаудина

Этанол 95%-й

Этанол 70%-й

Этанол абсолютный

Обесцвечивающий раствор уксусной кислоты и спирта

Карбол-ксилол

Раствор йода и спирта

Раствор трихромовой краски

Ксилол

Канадский бальзам или же его быстро высыхающие заменители

Сыворотка любая

Подготовка к исследованию

1) Приготовить тонкий мазок из исследуемого нативного кала.

1а. Если используется осадок после седиментации, каплю осадка смешать с каплей любой сыворотки (для лучшего прилипания) и распределить по стеклу. Мазки готовить быстро, не допуская высыхания препарата.

2) Фиксировать мазок в смеси Шаудина в течение часа (при необходимости мазок может быть оставлен в фиксаторе до 2 дней).

3) С помощью пластмассового пинцета вынуть стекло, слегка обсушить фильтровальной бумагой, но не досуха!

4) Выполнять п. 3 после каждого этапа работы.

5) Поместить стекло в 70%-й этанол-1 на 1 мин.

6) Поместить стекло в 70%-й этанол-2 на 1 мин.

Внимание! На этапе работы в п. 5 процесс окраски при необходимости может быть приостановлен. После завершения этого этапа процесс прерывать нельзя!

7) Окрасить смесью трихром - 8 мин.

8) Обесцветить мазок раствором уксусной кислоты со спиртом: 2-кратным погружением стекла.

9) Погрузить препарат в 95%-й этанол-1 на 1-2 сек.

10) Погрузить препарат в 95%-й этанол-2 на 2-3 сек.

11) Обезводить в карбол-ксилоле или абсолютном спирте 1 мин.

12) Просветлить препарат в ксилоле - 2-3 мин.

13) Препарат высушить и сразу же нанести каплю (или несколько капель) бальзама.

14) Закрыть покровным стеклом.

15) Микроскопировать препараты следует сначала при большом увеличении: окуляр x10, объектив x40, находя похожие по размеру объекты - на малом увеличении, а затем с водной или масляной иммерсией при увеличении: окуляр x10, объектив x90 или окуляр x10, объектив x100.

Результаты окрашивания

Цитоплазма простейших окрашивается в зеленовато-голубой или зеленый цвет. Ядра и их структуры (кариосомы, периферический хроматин), хроматоидные тельца в цистах амеб, филаменты в цистах жгутиковых окрашиваются в красный или фиолетовый цвет. Гликоген растворяется, и в цитоплазме будут видны пустые участки. Оттенки окрашивания могут варьировать и зависят от точности соблюдения экспозиций, сроков использования и замены реагентов (пропись - Прилож. 8).

Модифицированный метод окрашивания по Цилю-Нильсену

Является методом специфической окраски ооцист кокцидий: криптоспоридиев и изоспор.

Необходимое оборудование и реактивы

Предметные стекла обезжиренные, желательно с матированным краем

Стеклянные палочки или шпатели

Стеклянные стаканчики объемом 50 мл или контейнеры для окраски мазков на предметных стеклах в вертикальном положении

Мосты для окраски стекол в горизонтальном положении

Кюветы (эмалированные, нержавеющие или пластиковые)

Любая сыворотка

Краска карбол-фуксин

Метиленовый синий или малахитовый зеленый 5%-й раствор

Раствор серной кислоты 7%-й

Смесь Никифорова

Микроскоп

Подготовка к исследованию

1) Подготовка мазков:

1а) каплю жидких нефиксированных фекалий (кокцидии обычно встречаются в жидком или неоформленном стуле) нанести на обезжиренное предметное стекло и равномерно распределить с помощью стеклянной палочки или краем шлифованного стекла;

1б) осадок после формалин-эфирной седиментации суспендировать, каплю осадка смешать с каплей сыворотки для лучшего прилипания, распределить краем шлифованного стекла.

2) Мазки высушить.

3) Зафиксировать в смеси Никифорова (пропись - Прилож. 8) - 20-30 мин.

4) Окрашивать карбол-фуксином в вертикальном положении (п. 1а) или горизонтальном (п. 1б) - 30-40 мин для перекрашивания объектов.

5) Промыть мазки в нескольких сменах водопроводной воды в стаканчике!

6) Дифференцировать в растворе кислоты, пока не перестанут отходить облачка краски.

7) Промыть дистиллированной водой.

8) На несколько секунд погрузить в раствор метиленового синего или малахитового зеленого для подкраски фона.

9) Повторить п. 7.

10) Высушить мазки.

11) Микроскопировать препараты следует при большом увеличении: окуляр x10, объектив x40, предварительно находя похожие по размеру объекты при малом увеличении.

Результаты окрашивания

Ооцисты криптоспоридий - очень мелкие округлые объекты около 3-5 мкм, окрашиваются в красный цвет, внутри определяются овально вытянутые, полукруглые образования - спорозоиты.

Примечание.

1. Микроскопировать постоянно окрашенные препараты можно только после полного высыхания бальзама или его искусственного заменителя! Если ситуация экстренная, можно препарат осторожно микроскопировать с водной иммерсией!

2. Диагностика крупных, имеющих характерную морфологию изоспор не представляет трудностей и возможна любым из рекомендованных методов.

3. Постоянно окрашенные препараты можно длительно хранить. Для этого нужно часть мазков после промывания провести через спирты возрастающей крепости - 50, 70, 95%, карбол-ксилол, ксилол и заключить в канадский бальзам под покровным стеклом.

4. Прописи растворов, реагентов, применяемых в методах исследований, и способы их приготовления приведены в Прилож. 8.

2.1.3. Диагностические признаки трофозоитов и цист кишечных простейших

Идентификация дизентерийной амебы

Амебиаз - единственная протозойная кишечная инфекция, при которой в процессе паразитирования дизентерийной амебы может возникать особая, доступная для диагностики, морфологическая форма, отражающая развитие патологического процесса в тканях и органах хозяина. Идентификация тканевой (именуемой еще как гематофаг) формы E. histolytica в слизисто-гнойном, диффузно окрашенном кровью каловом экссудате с адекватностью свидетельствует о наличии специфических поражений кишечника при амебной дизентерии.

В случае подозрения на наличие в препарате каких-либо вегетативных амебных клеток, особенно при исследовании жидких фекалий, слизи с изъязвленного участка кишки при ректоскопии, биопсии и/или при вскрытии абсцесса необходимо провести микроскопию нативного мазка. Следует помнить, что амебы покидают активную зону воспаления и их можно обнаружить в краевых зонах язв или абсцесса. Одновременно с исследованием нативного мазка готовят постоянно окрашенный препарат и производят посев на среду Павловой. Готовые нативные препараты просматривают под микроскопом сначала с малым увеличением, а затем с большим (10x40) для оценки характера движения, выявления ядер и каких-либо включений в цитоплазме.

Если результат микроскопического изучения нативного мазка приводит к обнаружению трофозоитов, способных к поступательному передвижению путем быстрого формирования гиалиновых прозрачных цитоплазматических выростов (псевдоподий), а мелкозернистая цитоплазма не имеет других включений, кроме заглоченных эритроцитов, то это исследование рассматривается как диагностический критерий идентификации E. histolytica - ее тканевой формы.

Просветная форма - основная форма существования E. histolytica в кишечнике может быть обнаружена в полуоформленных фекалиях реконвалесцента или носителя. Она никогда не фагоцитирует эритроцитов, в ее цитоплазме содержатся вакуоли с различным содержимым, включая бактерии, что подчеркивает ее комменсальный образ жизни. Движение трофозоитов замедленное благодаря образованию коротких прозрачных стекловидных псевдоподий.

На основе изучения постоянно окрашенных препаратов составлено представление о наиболее типичном распределении хроматина в ядрах трофозоитов и цист различных видов амеб (рис. 10).

В нативном мазке, окрашенном раствором Люголя, более отчетливо различается тонкая структура паразита, а именно - проявление ядер, которые в мазке с физиологическим раствором не видны.

Ядерные структуры являются наиболее характерным диагностическим признаком:

- Трофозоит E. histolytica обычно имеет одно ядро с равномерно распределенным хроматином по внутренней поверхности ядра и обычно центрально расположенной небольшой кариосомой.

- Наиболее типичное расположение хроматина в ядрах трофозоитов и цист E. histolytica и E. hartmanni# в отличие от E. coli представлено равномерным его распределением по внутренней стороне оболочки ядра с центрально расположенной кариосомой.

- Ядра трофозоитов и цист I. buetschlii и E. nana имеют большую, свободно расположенную в кариоплазме кариосому и не содержат хроматин на оболочке ядра.

- Для ядер жгутиконосца D. fragilis характерна концентрация хроматина в виде гранул в центрально локализованной розетке.

Выявление цист E. histolytica возможно при микроскопических исследованиях препаратов, приготовленных из оформленного кала и окрашенных раствором Люголя. Они представлены клеткой правильной, шарообразной формы с хорошо заметной оболочкой. Содержимое цист включает от 1 до 4 ядер (в зависимости от зрелости), хроматоидные тела (короткие, толстые палочки с округлыми концами) и гликоген, активно вкрапленный в цитоплазму или, реже, заключенный в вакуоль. Обнаружение в препарате четырехядерных цист, даже совместно с просветной формой паразита, характерно для состояния носительства.

В настоящее время общепринятым является положение о том, что E. histolytica есть видовой комплекс с сохранением истинной патогенной формы, в то время как ее морфологический аналог Entamoeba dispar считается непатогенным эквивалентом. Известно также, что E. histolytica способна вызвать иммунный ответ в организме хозяина, а E. dispar - нет. Поэтому во всех случаях морфологической идентификации паразита дополнительное проведение серологического теста (РИФ) является оптимальным для диагностики амебиаза.

Идентификация паразитических амеб

Сложность идентификации дизентерийной амебы может быть связана как с наслоением побочного действия антидиарейных и противомикробных препаратов, так и с присутствием в кишечнике других амеб, идентичных (E. dispar, E. moshkovskii) или сходных (Entamoeba coli, Entamoeba hartmanni) с E. histolytica. Морфология основных видов амеб, паразитирующих в кишечнике человека, представлена на рис. 11.

Трофозоиты всех видов паразитических амеб за исключением тканевой формы E. histolytica активно питаются бактериями, поэтому цитоплазма амеб весьма вакуолизирована и содержит заглоченные бактерии. Наиболее выраженный "фагоцитоз" характерен для E. coli.

Вегетативные формы амеб значительно варьируют в размерах: от 8-10 мкм (E. hartmanni, E. nana) до 18-20 мкм и выше (E. coli). Сходный размер с просветной формой E. histolytica (13-18 мкм) имеют только Jodamoeba buetschlii и Dientamoeba fragilis, однако они резко различаются по строению ядер. Таким образом, тканевая и просветная формы дизентерийной амебы могут быть с адекватностью идентифицированы.

Цистные формы амеб могут быть дифференцированы как по размеру, так и по строению ядер. Среди цист большого размера выделяется E. coli (15-18 мкм). Цисты малого размера (5-8 мкм) - это E. hartmanni и E. nana, а E. histolytica и J. buetschlii относятся к цистам среднего размера (10-13 мкм). Однако они существенно различаются по форме и строению ядра. Кроме того для цист J. buetschlii характерно наличие четко очерченной гликогеновой вакуоли, в то время как в цистах E. histolytica гликоген чаще всего растворен вкраплениями в цитоплазму. А наличие у E. histolytica хроматоидных тел характерного вида довершает дифференциальную картину идентификации цист E. histolytica, морфологического комплекса, обозначаемого как E. histolytica/E. dispar.

"Рис. 11. Мормофология основных видов амеб кишечника человека*"

Идентификация паразитических жгутиконосцев

У человека паразитирует несколько видов жгутиковых, преимущественно в толстом кишечнике, некоторые из них существуют только в вегетативной форме (Pentatrichomonas hominis). Идентификация вегетативных форм этих организмов осуществляется, главным образом при исследовании нативного мазка при малом увеличении микроскопа - окуляр x10, объектив x10 - с последующим изучением препарата, окрашенного раствором Люголя, при увеличении: окуляр x10, объектив x40. Основные критерии идентификации: характер движения, форма и размер паразита с дальнейшей оценкой наличия специальных органелл внутренней структуры клетки. Основные морфологические признаки жгутиконосцев представлены на рис. 12.

Pentatrichomonas hominis - кишечная трихомонада - сложно организованная клетка с характерным порхающим, толчкообразным движением за счет 5 жгутиков передней части тела, а также волнообразной перепонки - ундулирующей мембраны, вытянутой вдоль тела более чем на 2/3. Аксостиль - опорная нить, заканчивающаяся вне тела небольшим шипиком. Хорошо виден цитостом.

Chilomastix mesnili - как и кишечная трихомонада имеет варьирующие размеры и своеобразную спирально закрученную грушевидную форму тела с 4 жгутами. Организм способен совершать активные буравливающие продвижения внутри кишечного детрита. В препарате можно наблюдать наличие вегетативных форм и цист одновременно. Цисты по форме напоминают лимончик за счет наплыва толстой оболочки клетки. Эти организмы могут интенсивно размножаться при растительной диете человека, образуя массивную популяцию на фоне временных расстройств кишечника.

Lamblia intestinalis - запоминающийся организм с билатеральной симметрией и 4 парами жгутиков. Расширенная передняя часть сформирована своеобразной структурой - присасывательным диском, на фоне которого хорошо видны овальные 2 ядра с крупными, окруженными светлой зоной, эндосомами (рис. 12). В отличие от трихомонад и хиломастикса у лямблий цитостом отсутствует. Они питаются осмотически, являясь паразитами тонкого кишечника, закрепляясь на его поверхности при помощи специальных органелл и синусоидального движения (биения) центральных жгутов, хорошо заметных в нативных прижизненных препаратах. Лямблий можно идентифицировать в диарейном, кашицеобразном и оформленном стуле. Отмечена периодичность их выделений в просвет кишечника, что требует повторного лабораторного исследования или использования накопительной пробы.

Идентификация бластоцистов

Blastocystis sp. - бластоцисты - полиморфный паразит толстого кишечника. Различают три существенно варьирующих в размерах формы бластоцистов (от 5 до 20 мкм и более).

Вакуолярная форма - наиболее часто встречаемая форма бластоцистов с четко выделенной центральной вакуолью, которая занимает большую часть клетки (рис. 13а). В зоне периферической цитоплазмы располагаются 2-4, реже 6 ядер полулунного типа. Центральная вакуоль обычно содержит различный материал - еле заметные гранулы или хлопьевидный материал различной степени плотности.

Гранулярная форма имеет сходные структуры с вакуолярной формой бластоцистов, за исключением четко выраженных гранул, которые обнаруживаются как внутри периферического слоя цитоплазмы, так и внутри центральной вакуоли.

Амебоидная форма - редко обнаруживаемая форма бластоцистов. Это небольшого размера клетка от 5 до 8 мкм с одной или двумя псевдоподиями. Обладает вялопротекающими движениями. Содержит различные вакуоли с бактериями и без них, а также трудно дифференцируемые ядра.

Для выявления бластоцистов препараты кала, окрашенные раствором Люголя, микроскопируют сначала при малом, а затем при большом увеличении: окуляр x10, объектив x40. Бластоцисты вакуолярной и гранулярной форм довольно легко определяются. Затруднения могут вызвать бластоцисты амебоидной и переходных форм, которые следует отличать от цист паразитических амеб (рис. 13).

Примечание. Иллюстрации простейших кишечника к разделу 2 приведены в Прилож. 5.

2.1.4. Экспресс-тест для определения антигенов лямблий и криптоспоридий в пробах кала

Экспресс-тест - метод диагностики на основе иммунохроматографического теста для обнаружения антигенов Lamblia intestinalis и Cryptosporidium parvum в пробах кала.

Назначение

Экспресс-тесты выпускаются как для раздельного, так и одновременного определения антигенов лямблий и/или криптоспоридий в образцах кала, что позволяет идентифицировать наиболее важные инфекции кишечника. Тест не требует от персонала владения микроскопическими методами, быстр и прост в исполнении. Однако при его проведении используется только свежий образец кала.

Принцип метода

RIDA-Quick - тест на криптоспоридии и лямблии (Cryptosporidium/Giardia Combi) является одностадийным тестом, основанным на иммунохроматографическом принципе, в котором используются специфичные к каждому паразитическому организму моноклональные антитела, фиксированные на мембране тест-кассеты и окрашенные латексными частицами: красные для лямблий и голубые для криптоспоридий. Образец кала суспендируют в буфере для экстракции. Аликвоту супернатанта без примеси нерастворенных частиц образца вносят в окошко тест-кассеты. Если образец содержит выявляемые антигены, то происходит образование комплекса "антиген-антитело-латексная частица". В зависимости от вида паразита, присутствующего в образце, могут образовываться красная (для лямблий) и/или голубая (для криптоспоридий) тестовые полосы.

Материалы и реагенты

Набор включает реагенты, достаточные для выполнения 20 определений

Тест-кассеты (каждая в индивидуальной упаковке)

Буфер для экстракции (содержит азид натрия 0,1%)

Одноразовые пипетки

Инструкция по применению

Оборудование и материалы, не входящие в набор

Пробирки для суспензии образцов кала; вортекс

Микропипетка на 200-1000 мкл

Контейнер для утилизации и обеззараживания отходов

Сбор и хранение проб

Пробы кала необходимо собирать в чистые контейнеры. Исследования проводятся в день доставки материала в лабораторию или пробы замораживают и хранят при -20°C. Перед проведением анализа образцы необходимо разморозить.

Подготовка к исследованию

1) Довести реагенты до комнатной температуры 20°C.

2) Внести 1 мл буфера для экстракции в маркированную пробирку.

3) Набрать в микропипетку 100 мкл жидкого образца кала и суспендировать его в буфере для экстракции. Если кал твердый, отобрать эквивалентное количество с помощью шпателя (примерно 1/2 горошины) и гомогенизировать.

4) Провести 3-минутную экспозицию для осаждения частиц.

5) Извлечь тест-кассету из упаковки и внести 200 мкл прозрачного супернатанта в круглое окошко кассеты. Следить за тем, чтобы с жидкостью не попадали твердые частицы, которые мешают ей проходить через реакционную зону - белый фон центрального окна кассеты.

6) Считать результаты теста через 5 мин.

Контроль качества

При постановке теста обязательно должна быть видна контрольная полоса. Если она не появилась, следует повторить исследование, проверив предварительно следующие моменты: срок годности используемых реагентов; точность выполнения процедуры исследования.

Интерпретация результатов

A. Положительный тест на криптоспоридии: в реакционной зоне кассеты в дополнение к зеленой контрольной полосе (С) появляется СИНЯЯ тестовая полоса (Т).

B. Положительный тест на лямблии: в реакционной зоне кассеты в дополнение к зеленой контрольной полосе (С) появляется КРАСНАЯ тестовая полоса (Т).

C. Положительный тест на лямблии и криптоспоридии: в реакционной зоне кассеты в дополнение к зеленой полосе (С) появляется СИНЯЯ и КРАСНАЯ тестовые полосы. Интенсивность окраски полос может быть разной, так как она зависит от концентрации антигенов в образце кала.

D. Отрицательный результат. На белом фоне реакционной зоны центрального окошка кассеты появляется только ЗЕЛЕНАЯ контрольная полоса рядом с буквой "С".

E. Неверный результат. На белом фоне реакционной зоны кассеты рядом с буквой "С" отсутствует ЗЕЛЕНАЯ контрольная полоса. Исследование необходимо повторить на новой кассете. Если контрольная полоса не появляется и при повторном исследовании, то тест-система непригодна к использованию.

Любые окрашенные линии, которые появляются спустя 10 мин после внесения супернатанта в реакционную зону, не имеют диагностического значения. Такой результат может быть при использовании избыточного количества пробы кала.

Аналитические характеристики экспресс-теста

Одноступенчатый иммунохроматографический тест с использованием моноклональных специфических антител, фиксированных на мембране к каждому из определяемых паразитов, обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Тест прост в исполнении, не требует много времени.

2.2. Лабораторная диагностика трипаносомозов

Африканский трипаносомоз - африканская "сонная болезнь", группа тропических болезней, вызываемых простейшими рода Trypanosoma, характеризующимися трансмиссивным путем передачи. Подвиды простейшего Trypanosoma brucei: Trypanosoma brucei gambiense и Trypanosoma brucei rhodesiense являются возбудителями соответственно западно-африканского трипаносомоза и восточно-африканского трипаносомоза. Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi - возбудитель американского трипаносомоза (болезнь Шагаса). В России могут регистрироваться исключительно случаи завозного трипаносомоза.

Лабораторный диагноз устанавливается по обнаружению трипаносом в препаратах крови, спинно-мозговой жидкости и пунктатах лимфатических узлов.

Для обнаружения возбудителей трипаносомоза используют следующие методы исследования:

- нативные препараты крови;

- метод толстой капли крови;

- метод неокрашенных мазков пунктата лимфатического узла или спинно-мозговой жидкости.

2.2.1. Метод исследования нативных препаратов крови

Необходимые материалы и оборудование

Скарификатор

Обезжиренные предметные стекла

Покровные стекла

Физиологический раствор

Раствор краски Романовского-Гимза

Микроскоп

Ход исследования

1) Кровь из пальца наносят на предметное стекло и добавляют сверху каплю физиологического раствора.

2) Углом покровного стекла перемешивают кровь и закрывают каплю покровным стеклом.

3) Микроскопируют при увеличении: окуляр x10, объектив x40.

Метод исследования толстой капли

Необходимые материалы и оборудование

Скарификатор

Обезжиренные предметные стекла

Покровные стекла

Краска Романовского-Гимза

Иммерсионное масло

Микроскоп

Подготовка к исследованию

1) Подготовка мазка:

1а) на сухое предметное стекло наносят каплю крови диаметром около 5 мм, кровь распределяют либо в равномерный диск, либо прямоугольник размером 1,0-1,5 см или

1б) готовится препарат "толстая капля" на мазке: на предметном стекле готовят мазок крови более толстый, чем требуемый, например для исследования на малярию.

2) Сразу после приготовления мазка, пока мазок не высох, его влажной поверхностью прикасаются к выступившей капле крови или наносят на него кровь из капилляра.

3) Кровь на влажном мазке распределится в равномерный диск при осторожных наклонах предметного стекла под небольшим углом в разные стороны; чем больше взятая капля крови, тем больше площадь, по которой она распределится.

4) Капля крови, нанесенная на мазок, более прочно прикрепляется, чем нанесенная непосредственно на предметное стекло.

5) Толщина толстой капли должна быть такой, "чтобы через нее просматривался печатный текст". Слишком толстая капля может оторваться от стекла при высушивании; такой препарат не пригоден для исследования.

6) Препараты окрашивают по Романовскому-Гимзе.

7) Независимо от методики приготовления показателем достаточного содержания крови в толстой капле является обнаружение в одном поле зрения микроскопа в среднем 10-15 лейкоцитов.

8) Микроскопируют с масляной иммерсией, увеличение: окуляр x7, объектив x90 или x100.

2.2.2. Метод исследования неокрашенных мазков из лимфатических узлов

Необходимые материалы и оборудование

Обезжиренные предметные стекла

Покровные стекла

Микроскоп

Подготовка к исследованию

1) Пунктат лимфатического узла наносят на середину предметного стекла.

2) Закрывают покровным стеклом и сразу исследуют под микроскопом при увеличении: окуляр x10, объектив x40. Микроскопию препарата начинают с периферических участков, куда стремятся проникнуть трипаносомы. Затем исследуют остальные участки препарата. Любое движение, замеченное в препарате, должно вызвать подозрение на наличие паразитов!

2.2.3. Метод исследования неокрашенных мазков из спинно-мозговой жидкости

Необходимые материалы и оборудование

Обезжиренные предметные стекла

Покровные стекла

Центрифуга

Микроскоп

Подготовка к исследованию

1) Спинно-мозговую жидкость центрифугируют при 900 об./мин в течение 10 мин.

2) Сливают надосадочную жидкость.

3) Осадок ресуспензируют.

4) Наносят одну каплю осадка на предметное стекло.

5) Закрывают покровным стеклом.

6) Микроскопируют сначала при малом увеличении: окуляр x10, объектив x10, затем - при большом увеличении: окуляр x10, объектив x40.

2.2.4. Диагностические признаки возбудителей трипаносомоза

При исследовании нативного мазка указанием на наличие живых трипаносом является их быстрое движение среди эритроцитов (Прилож. 5).

Трипаносом легче увидеть при несколько уменьшенном освещении (опустить конденсор микроскопа). При исследовании окрашенных мазков учитывают форму и расположение ядра, размеры и локализацию кинетопласта.

Возбудители трипанасомоза Trypanosoma brucei gambiense и Trypanosoma brucei rhodesiense морфологически идентичны - это плоские, продолговато-веретенообразные по форме простейшие от 12 до 35 мкм в длину и 1,5-3,5 мкм в ширину. Подвижны, для перемещения используют тянущуюся вдоль тела волнистую полупрозрачную мембрану. Ядро и кинетопласт трипаносомы окрашивается в красный или фиолетовый цвет. Ядро - крупное, располагается вблизи середины тела, кинетопласт - небольшое образование, находится ближе к концу клетки.

Trypanosoma (S) cruzi имеет характерный крупный кинетопласт, резко отличающийся от африканских трипаносом.

2.3. Лабораторная диагностика лейшманиозов

Лейшманиозы - трансмиссивные болезни человека, вызываемые простейшими рода Leishmania. Переносчиком является москит. Существуют две группы лейшманиозов человека: висцеральный (возбудители L. donovani, L. infantum, L. chagasi) с поражением внутренних органов (печени, селезенки, костного мозга, лимфатических узлов) и кожный (возбудители L. major, L. tropica и др.), при котором наблюдаются локальные патологические изменения кожи, иногда слизистых. Все виды лейшманий морфологически сходны. Возбудители размножаются в клетках ретикуло-эндотелиальной системы. Лейшманиозы характеризуются как паразитарные ретикулоэндотелиозы.

Диагноз устанавливается, главным образом, микроскопически при обнаружении лейшманий в мазках пунктатов костного мозга (в крови лейшмании обнаруживаются крайне редко) или мазках костных инфильтратов (или язв). В последние годы используется современный метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий также обнаруживать лейшмании в биологическом материале и идентифицировать их до вида.

Возможно использование экспресс-метода Kalazar detect (rK39), привлекательного быстротой постановки диагноза.

Лейшманиозы широко распространены в тропическом, субтропическом поясе всех континентов. Однако в XX столетии на Северном Кавказе были регистрированы единичные случаи лейшманиозов.

Отбор проб биологического материала на наличие возбудителей кожного лейшманиоза

Взятие биологического материала для исследования на кожный лейшманиоз

При подозрении на кожный лейшманиоз исследуют соскоб из инфильтрата вокруг язвы кожи или пунктат инфильтрата, сформировавшегося на месте укуса насекомого (москита). Содержимое из центральной зоны язвы непригодно для диагностического исследования, так как оно состоит из детрита, бактериальных клеток, паразитов и клеток больного.

Взятие материала из инфильтрата кожи проводится с помощью инсулинового (или туберкулинового) шприца. Выбирают более выраженный инфильтрат. Перед взятием материала поверхность кожи вокруг поражения протирают 96°-м этиловым спиртом и дают подсохнуть.

Набирают 0,1 мл физиологического раствора в шприц и вводят его в этот участок инфильтрата, слегка изменяя положение иглы, чтобы легче было оттянуть содержимое инфильтрата в шприц. Затем раскапывают на предметные стекла. На каждого пациента надо брать по 2-3 стекла. На предметных стеклах из содержимого инфильтрата быстро делают мазки шлифовальным стеклом (как при приготовлении мазка крови). Можно наносить капли в середине предметных стекол и быстро размазать их на поверхности. В этом случае получится препарат по типу "толстой капли". Во всех случаях капли должны быть незначительны по объему.

Взятие материала из язвенного поражения кожи проводится с помощью узкого глазного скальпеля. Кожу по краю язвы обрабатывают 96°-м этиловым спиртом и дают подсохнуть. В зоне размягченного участка краевого инфильтрата скальпелем делают прокол глубиной 1,0-1,5 мм и слегка пошевеливают концом скальпеля, чтобы разрушить инфильтрат. Желательно, чтобы на кончике скальпеля была не только кровь, но и мелкие кусочки (1 ) инфильтрата. На чистом стекле быстро размазывают собранное содержимое в виде нескольких штрихов и дают препарату подсохнуть. Подобную процедуру повторяют 2-3 раза, содержимое наносят на то же стекло или свежее.

Подсохшие препараты нумеруют и фиксируют в 96°-м этиловом спирте. Продолжительность фиксации 25-30 мин при комнатной температуре. Далее препараты окрашивают.

Отбор проб биологического материала на наличие возбудителей висцерального лейшманиоза

Отбор проб костного мозга

Пунктат костного мозга берут с помощью иглы Кассирского чаще всего из грудины, особенно у взрослых. У маленьких детей пунктируют пяточную кость, бугорок в верхней части tibia, а также из верхнего края тазовой кости. Обычно берут 5-10 мл костного мозга, чтобы можно было произвести развернутое цитологическое исследование, а также получить сыворотку для серологического и генетического исследования с целью установления этиологии инфекционного заболевания. Все манипуляции при проведении костно-мозговой пункции проводятся гематологом-хирургом при соблюдении режима стерильности.

Мазки готовят сразу же после взятия костного мозга. Важно, чтобы они были тонкими, а также чтобы ширина мазка была уже на 1-2 мм с каждой стороны. Эти требования необходимо выполнять тщательно, так как зараженные клетки крупнее и более тяжелые, они преимущественно располагаются по краям мазка, особенно в "бахромке" - в конце мазка.

Подсохшие препараты нумеруют и фиксируют в 96°-м этиловом спирте. Продолжительность фиксации 25-30 мин при комнатной температуре. Далее препараты окрашивают.

2.3.1. Микроскопические методы исследований на лейшманиозы

Необходимые материалы и оборудование

Материал из инфильтрата кожи

Инсулиновый или туберкулиновый шприц

Физиологический раствор

Глазной узкий скальпель

Этиловый спирт 96°-й

Раствор краски Романовского-Гимза

Дистиллированная вода

Фильтровальная бумага

Мерная лабораторная посуда

Пинцеты

Часы песочные или сигнальные

Специальные контейнеры для окрашивания препаратов крови или стеклянные рельсы и кюветы

Приспособления для высушивания препаратов

Перчатки резиновые

Обезжиренные предметные стекла

Иммерсионное масло

Микроскоп

Окрашивание препаратов можно проводить двумя способами:

- препараты с мазками вертикально погрузить в рабочий раствор краски, налитый в специальные ванночки или контейнеры, без соприкосновения друг с другом. Данный способ окраски наиболее приемлем, когда есть необходимость окраски большого количества препаратов. В стандартном контейнере можно окрасить 20 препаратов при вместимости 90 мл краски. Повторное использование краски недопустимо;

- препараты расположить горизонтально (мазками вверх) на стеклянных рельсах, лежащих на кюветах. Осторожно нанести краску. Этот способ окраски приемлем при окрашивании небольшого количества препаратов. Расход краски составляет примерно 3 мл на 1 препарат.

Время окрашивания зависит от температуры окружающей среды. При температуре 20-25°C окрашивать в течение 35-40 мин. При более низкой температуре время окрашивания увеличивается. При очень высокой температуре (30°C) время окрашивания может быть сокращено до 20 мин

Результат окрашивания

Правильно окрашенный макроскопический препарат имеет синий цвет с сиреневым оттенком, а при его микроскопии:

- ядра лейкоцитов - фиолетово-красного цвета с различимой структурой;

- зернистость базофилов - фиолетового цвета;

- зернистость эозинофилов - красного цвета;

- у моноцитов на фоне серо-голубой цитоплазмы может быть розовая зернистость;

- зрелые эритроциты - розового цвета с сероватым оттенком;

- ретикулоциты - сиренево-голубые;

- тромбоциты - сиренево-розового цвета с различимой сетчатостью.

2.3.2. Посев возбудителей лейшманиозов на питательную среду с последующим культивированием

Необходимые реактивы и оборудование для культивирования

Посуда химическая стеклянная: воронки, колбы мерные плоскодонные конические (25, 50, 100, 200, 1000 мл), цилиндры мерные (25, 100, 1000 мл), пастеровские пипетки (5 и 10 мл), пипетки Мора (30, 50 и 100 мл), пробирки 15-25 мл с крышками, предметные стекла

Химические реактивы (х.ч.): хлористый натрий, бактериологический агар, бактериологический пептон, вода дистиллированная

Говяжий экстракт

Среды питательные: среда 199 с солями Хенкса с глутамином, среда RPMI-1640 с глутамином

Кровь кролика или человека

Антибиотики: стрептомицин и пенициллин

Штативы для пробирок

Автоматический пипеточный дозатор

Микроскоп (монокуляр или бинокуляр) с осветителем, объективом х40, окуляром х10

Холодильники бытовые или холодильные шкафы с морозильной камерой, обеспечивающей температуру от 0 до 8°C

Термостат суховоздушный лабораторный, поддерживающий температуру в диапазоне 25-37°C

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г

Водяная баня лабораторная с диапазоном температур от 15 до 60°C

Стерилизатор паровой медицинский

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды по ГОСТ 6709-72

Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов

Приготовление питательной среды

Приготовление полужидкой среды

1) В мерной колбе на 200 мл перемешать все компоненты: 2,5 г бактериологического агара, 1 г бактериологического пептона, 0,5 г хлористого натрия, 0,3 г говяжьего экстракта, 100 мл дистиллированной воды. Приготовленную агарную основу стерилизовать автоклавированием, затем остудить до 50-45°C.

2) На водяной бане нагреть питательную среду 199 с солями Хенкса с глутамином до 45-50°C.

3) В новой колбе к 1 части теплой агарной основы добавить 7 частей теплой питательной среды, перемешать встряхиванием, придавая полужидкую консистенцию.

4) Добавить к этой смеси свежую, стерильно взятую, дефибринированную нормальную кровь кролика или человека в соотношении 1:10. Добавить пенициллин 200 Ед/мл и стрептомицин 200 мг/мл, тщательно перемешать встряхиванием.

5) Среду разлить в пробирки по 1,5-2,0 мл. Хранить при 4°C до 3 месяцев.

Приготовление питательной среды N N N

1) В мерной колбе на 200 мл перемешать все компоненты: 1,4 г бактериологического агара, 0,6 г хлористого натрия и 90 мл дистиллированной воды.

2) Приготовленную агарную основу стерилизовать автоклавированием, затем остудить до 50-45°C.

3) Добавить 15 мл стерильно взятой дефибринированной крови кролика или человека, перемешать, вращая колбу.

4) Разлить в пробирки по 2-4 мл, после этого пробирки в слегка наклонном положении охладить до застывания или в холодильнике (косой агар) и поместить в термостат с температурой 37°C для контроля стерильности и получения конденсационной жидкости. Пробирки хранить при 4°C до 3 месяцев.

5) Перед использованием для культивирования лейшманий в пробирки с застывшим агаром добавить 2-3 мл среды 199 с солями Хенкса с глутамином или среды RPMI-1640 с глутамином. Для подавления роста бактериальной флоры в жидкую питательную среду добавить антибиотики: пенициллин 200 Ед/мл и стрептомицин 200 мг/мл, тщательно перемешать встряхиванием; pH среды должен составлять 7,4-7,6.

Примечание. При выделении и культивировании возбудителя использовать одну из представленных питательных сред.

Выделение и культивирование возбудителя

1) Подготовить пробирки со средой: нагреть до комнатной температуры и подписать. При возможности в стерильных условиях добавить клеточный материал в пробирку: несколько капель пунктата костного мозга, лимфатического узла при висцеральном лейшманиозе; соскоб со стенок разреза края поражения при наличии язвы или папулы.

2) Пробирки поместить в термостат на 25°C, в лабораторный журнал записывают имя пациента, материал для посева, дату посева, а также сведения о больном и иную необходимую информацию.

3) Через 5-10 дней культуру просмотреть. Результат считать положительным, если обнаруживаются промастиготы. В данном случае штамму дать наименование согласно международной классификации.

4) Если через 10-15 дней промастиготы не обнаруживаются, результат считать отрицательным.

5) Перевозка пробирок должна осуществляться с соблюдением правил хранения образцов и правил транспортирования инфекционных материалов.

2.3.3. Диагностические признаки возбудителей лейшманиозов

Препараты микроскопируют с применением масляной иммерсии при увеличении: окуляр х7 или х10, объектив х90 или х100.

В окрашенных мазках лейшмании (амастиготы) обнаруживаются в макрофагах и вне их в виде округлых, овальных, рисовидных телец длиной 3-5 мкм, шириной 1-3 мкм. Цитоплазма лейшманий окрашивается в серовато-голубой цвет, ядро - в красно-фиолетовый, рядом с ядром хорошо виден кинетопласт - округлое палочковидное образование, меньше ядра и более интенсивно окрашенное. При висцеральном лейшманиозе лейшмании легче найти в разгар болезни, чем на ранней стадии, когда требуется тщательный просмотр нескольких мазков. При кожных лейшманиозах в поражениях паразитов больше в начальной стадии болезни, а на стадии заживления и при специфическом лечении они обнаруживаются реже.

В мазке паразиты могут быть неравномерно распределены. Поэтому необходимо проводить перекрестный просмотр всего мазка, что занимает примерно 10 мин. Если вероятность заболевания у пациента велика, а паразиты не выявляются, рекомендуется не увеличивать время просмотра одного и того препарата, а просмотреть второй препарат.

Препарат считается отрицательным, если паразиты не обнаружены после просмотра всего мазка.