Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 16140-2011 "Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Протокол валидации альтернативных методов" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 1474-ст)

Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 16140-2011
"Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Протокол валидации альтернативных методов"
(введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 1474-ст)

Microbiology of food and animal feeding stuffs. Protocol for the validation of alternative methods

Дата введения - 1 января 2013 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Введение

Необходимость быстрой оценки микробиологических качеств сырья и готовых продуктов, а также микробиологического статуса методов приготовления в пищевой промышленности привела к разработке и усовершенствованию альтернативных методов микробиологического анализа, которые быстрее и/или проще в осуществлении, чем соответствующий стандартный метод, и некоторые из них можно автоматизировать.

Среди альтернативных методов есть такие, которые могут давать результаты, эквивалентные результатам стандартного метода, а результаты других могут заметно отличаться.

Поставщики и разработчики альтернативных методов, производители пищевых продуктов и напитков, службы здравоохранения и другие органы нуждаются в надежном общем протоколе валидации подобных альтернативных методов. Полученные данные могут также стать основой для сертификации метода независимой организацией.

Из-за большого числа методов, использованных лабораторией-организатором в сравнительном исследовании, представленном в настоящем стандарте, процедура не всегда подходит для "внутреннего" метода валидации альтернативного метода, применяемого отдельной лабораторией.

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает основной принцип и технический протокол валидации альтернативных методов в сфере микробиологического анализа пищевых продуктов, кормов для животных, образцов окружающей среды и ветеринарных образцов (см. 5.1.1.2.1) для:

- валидации альтернативных методов, которые можно использовать, в частности, в рамках официального контроля;

- международного признания результатов, полученных альтернативным методом.

Настоящий стандарт также устанавливает основные принципы сертификации альтернативных методов, основанные на протоколе валидации, определенном в 4.1.

В тех случаях, когда альтернативный метод применяется на постоянной основе для внутрилабораторного использования и не требуется соответствие (более высоким) сторонним критериям контроля качества, может оказаться достаточной менее строгая сравнительная валидация альтернативного метода.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ISO 3534-1 Statistics - Vocabulary and symbols - Part 1: General statistical terms and terms used in probability (Статистика. Словарь и условные обозначения. Часть 1. Общие статистические термины и термины, используемые в теории вероятности)

ISO 5725 (все части) Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results (Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений)

ISO/TS 11133-1 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культуральных сред в лаборатории)

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины и соответствующие определения:

3.1 альтернативный метод (alternative): Метод анализа, обеспечивающий для продуктов данной категории обнаружение или оценку такого же аналита (3.4), какой измеряют с помощью соответствующего референтного метода (3.2).

Примечание 1 - Метод может быть патентованным или некоммерческим и не обязательно должен включать всю процедуру анализа от приготовления образцов до отчета об испытании.

Примечание 2 - Альтернативный метод должен обладать качествами, соответствующими нуждам пользователя, например:

- быстродействие проведения анализа и/или получения результата;

- простота выполнения и/или автоматизации;

- аналитические качества (прецизионность, точность, предел обнаружения и т.д.);

- миниатюризация;

- снижение затрат.

Примечание 3 - Термин "альтернативный" применяется для общего обозначения "процедуры испытания и реакционной системы". Этот термин включает в себя все компоненты - материальные и иные, необходимые для реализации метода.

3.2 референтный метод (reference): Принятый на международном уровне и широко применяемый метод.

Примечание - В настоящем стандарте под стандартным методом подразумеваются международные и европейские стандарты, а в случае их отсутствия - подходящие национальные стандарты эквивалентного статуса.

3.3 валидация альтернативного метода (validation of an alternative method): Процедура подтверждения соответствия того, что результаты, полученные альтернативным методом, сравнимы с результатами, полученными стандартным методом.

Примечание - Термин "сравнимы" определяется в настоящем стандарте техническим протоколом, адаптированным для метода каждого типа (см. разделы 5 и 6).

3.4 аналит (analyte): Компонент, измеряемый данным методом анализа. Это может быть микроорганизм.

3.5 качественный метод (qualitative method): Метод анализа, результатом которого является установление наличия или отсутствия аналита (3.4), обнаруживаемого прямо или косвенно в определенном количестве образца.

3.6 количественный метод (quantitative method): Метод анализа, результатом которого является количество аналита (3.4), измеренное прямо (подсчет по массе или объему) или косвенно (поглощение цвета, импеданс и т.д.) в определенном количестве образца.

3.7 сравнительное исследование методов (methods comparison study): Исследование, проводимое лабораторией-организатором, целью которого является сравнение альтернативного метода со стандартным методом.

3.8 межлабораторное исследование (inter-laboratory study): Исследование рабочих характеристик метода с использованием одних и тех же образцов в нескольких лабораториях под контролем лаборатории-организатора.

3.9 лаборатория-организатор (organising laboratory): Лаборатория с квалифицированными сотрудниками, имеющими опыт проведения сравнительного исследования и организации межлабораторного исследования.

Примечание - Для анализа результатов необходимо участие квалифицированного специалиста по статистическим исследованиям.

4 Общие принципы валидации и сертификации альтернативных методов

4.1 Протокол валидации

Протокол валидации включает в себя два этапа:

- сравнительное исследование (3.7) альтернативного (3.1) и референтного (3.2) методов в лаборатории-организаторе;

- межлабораторное исследование (3.8) каждого из двух методов.

Если это возможно, оба проводят параллельно.

Технические правила проведения сравнительного исследования методов и межлабораторного исследования представлены в разделах 5 и 6 соответственно в зависимости от того, является ли альтернативный метод качественным или количественным.

Если альтернативный метод прошел валидацию и соответствует требованиям другой организации, то для процедуры признания таких результатов предусмотрены специальные правила, приведенные в приложении А.

4.2 Принципы сертификации

4.2.1 При последующей сертификации альтернативного метода применяют (в дополнение к 4.1) два следующих принципа.

Подробные сведения о проведении сертификации (управление сравнительным исследованием методов и межлабораторным исследованием, перечень организаций, участвующих в процессе, включая экспертную лабораторию, называемую в настоящем стандарте "лабораторией-организатором", и приглашенных экспертов, сертифицирующий орган и т.д.) предоставляются сертифицирующим органом.

4.2.2 Изготовитель должен использовать систему качества, охватывающую весь ряд продукции, подлежащей сертификации и основанную на соответствующем стандарте, относящемся к системам качества (см. ISO 9001).

При выдаче сертификата сертифицирующая организация должна учитывать наличие сертификата системы качества, выданного сертифицирующим органом, аккредитованным в сфере систем качества.

4.2.3 После выдачи сертификата должна проводиться регулярная проверка качества сертифицированного метода. Должен регулярно проводиться аудит для установления соответствия:

- требованиям обеспечения качества (см. 4.2.1);

- требованиям контроля производства продукции (см. 4.2.1).

В дополнение к общим требованиям системы качества изготовитель регулярно предъявляет сертифицирующей организации обновленную документацию, учитывающую все изменения, внесенные в продукт или в процесс производства, которые могут отразиться на инструкциях по использованию метода и/или на рабочих характеристиках метода. После этого сертифицирующая организация решает, влияют ли внесенные изменения на результаты сертификации.

5 Качественные методы. Технический протокол валидации

5.1 Сравнительное исследование методов

5.1.1 Относительная точность, относительная специфичность и относительная чувствительность

5.1.1.1 Термины и определения

В рамках данного стандарта используются следующие термины и определения:

5.1.1.1.1 относительная точность (АС) (relative accuracy): Степень соответствия между результатом, полученным стандартным методом, и результатом, полученным альтернативным методом, при исследовании идентичных образцов*1) (см. 5.1.1.3.1).

Примечание - Термин "относительная точность", используемый в настоящем стандарте, является дополнительным к терминам "точность" и "правильность", как они определены в ISO 5725-1 и в ISO 3534-1. В этих стандартах указывается, что точность - это "степень близости результата испытания и принятого опорного значения" и что правильность - это "степень близости среднего значения большого числа результатов испытания и принятого опорного значения". В настоящем стандарте в качестве принятого опорного значения выбрано значение, получаемое референтным методом. Таким образом, термин "относительный" указывает на то, что стандартный метод автоматически не дает принятое опорное значение.

5.1.1.1.2 положительное отклонение (PD) (positive deviation): Альтернативный метод "ложноположителен", когда он показывает положительное отклонение, (т.е. получен положительный результат), в то время как стандартный метод дает отрицательный результат.

Положительное отклонение становится ложноположительным результатом, когда можно доказать, что истинный результат отрицателен.

Положительное отклонение считается "истинно положительным", когда можно доказать, что истинный результат положителен.

5.1.1.1.3 отрицательное отклонение (ND) (negative deviation): Альтернативный метод показывает отрицательное отклонение (т.е. получен отрицательный результат), в то время как референтный метод дает положительный результат.

Отрицательное отклонение считается "ложноотрицательным", когда можно доказать, что истинный результат положителен.

5.1.1.2.4 относительная чувствительность (SE) (relative sensitivity): Способность альтернативного метода обнаруживать аналит, когда его обнаруживает референтный метод (см. 5.1.1.3.1).

5.1.1.2.5 относительная специфичность (SP) (relative specifi city): Способность альтернативного метода не обнаруживать микроорганизм тогда же, когда его не обнаруживает референтный метод (см. 5.1.1.3.1).

5.1.1.2 Протокол измерений

5.1.1.2.1 Образцы пищевых продуктов

Для оценки чрезвычайно важно отобрать образцы пищевых продуктов, естественно контаминированные аналитом, подлежащим обнаружению при валидации.

Если метод нужно оценить для всех пищевых продуктов, то нужно изучить пять категорий пищевых продуктов. По просьбе изготовителя, это число категорий можно снизить до одной, двух, трех или четырех, если валидация альтернативного метода ограничена такими указанными категориями. Рекомендованные категории перечислены в приложении В.

Подходящие образцы окружающей среды также могут быть включены в качестве одной из категорий. Ветеринарные образцы можно считать еще одной категорией (см. приложение В).

Желательно, чтобы образцы пищевых продуктов происходили из как можно более широкой зоны распространения для уменьшения искажения, связанного со спецификой местной пищи, и для расширения диапазона валидации.

При анализе естественно контаминированных образцов диапазон и распределение контаминации образцов должны представлять все уровни, обычно присутствующие в этих продуктах, с упором на меньшее значение.

Если невозможно получить достаточное количество естественно контаминированных пищевых продуктов каждой категории, то допустимо использование искусственно контаминированных образцов. Метод и уровни искусственной контаминации должны обеспечивать подобие характеристик полученных образцов характеристикам естественно контаминированных образцов (см. методы инокуляции и ограничения в приложении С).

5.1.1.2.2 Число образцов

Суммарное число испытательных подобразцов для анализа равно 60 для каждой пищевой категории, выбранной из списка, приведенного в приложении В. Внутри каждой категории выбирают представительные типы пищевых продуктов и анализируют 20 испытательных подобразцов пищевого продукта каждого типа предлагаемым методом и референтным методом для получения минимум 60 результатов для каждой категории каждым методом. Для естественно контаминированных типов пищевых продуктов готовят образец, как описано в приложении D. Для искусственно контаминированных типов пищевых продуктов подстраивают уровни инокуляции таким образом, чтобы достичь частичного положительного выделения микроорганизмов в анализируемых испытательных подобразцах хотя бы одним из методов. Частичное выделение микроорганизмов достигается, когда в некотором числе, но не во всех, испытательных подобразцах обнаруживается положительный результат одним или обоими методами, альтернативным или референтным.

Желательно получить примерно 50% положительных результатов и 50% отрицательных. Это рекомендация, а не абсолютно требуемое процентное соотношение, при условии, что некоторое число испытательных подобразцов "положительно", а часть - "отрицательны" для одного и того же типа пищевого продукта.

5.1.1.2.3 Приготовление испытательных образцов

Референтный и альтернативный методы должны быть проведены, насколько это возможно, на одном и том же образце.

Так, если первая стадия обоих методов одинакова (например, тот же самый предварительно обогащенный бульон), то проводят репликацию на второй стадии (приложение D, случай 1).

В случае, когда первоначальная культуральная среда, методология или растворы различаются, готовят парные испытательные подобразцы для анализа. Имеются два основных метода для таких процедур приготовления.

В первом случае смешивают двойную навеску образца с равной по весу или объему навеской стерильной воды или другого подходящего разбавителя и тщательно гомогенизируют. Затем разделяют ее на два подобразца, обращая особое внимание на увеличение концентрации первичного обогащения примерно на 10% для компенсации эффекта разбавления разбавленного гомогенизированного образца (приложение D, случай 2).

Во втором случае непосредственно засевают образец пищевого продукта начальным посевным материалом в количестве, достаточном для получения частичного выделения микроорганизмов из анализируемых испытательных подобразцов хотя бы одним методом после того, как микроорганизмы пришли в состояние равновесия в образце пищевого продукта. Потом приготовляют испытательные подобразцы весом в 25 г и процедуру продолжают так, как описано в приложении D. Такая процедура предпочтительна для жидких продуктов, но может быть применима и для пищевого продукта любого типа при условии, что пищевой продукт тщательно гомогенизирован.

5.1.1.3 Вычисления и интерпретация результатов

5.1.1.3.1 Обработка данных

Парные данные референтного и альтернативного методов заносят в таблицу и вычисляют следующие параметры для каждой категории пищевого продукта (60 образцов), как указано в таблице 1.

Таблица 1 - Парные результаты референтного и альтернативного методов

Результаты	Референтный метод положителен (R +)	Референтный метод отрицателен (R -)
Альтернативный метод положителен (А+)	+ / + положительное согласование (РА)	- / + положительное отклонение (R -/А +)
Альтернативный метод отрицателен (А-)	+ / - отрицательное отклонение ND) (A -/ R +)	- / - отрицательное согласование (NA)

Вычисления должны проводиться на ряде отрицательных результатов, полученных стандартным методом, число которых для результатов из таблицы 1 не может превышать удвоенное число положи тельных результатов. При необходимости можно выбирать отрицательные результаты, непосредствен но следующие за положительным результатом, в порядке анализа образцов.

Используются три следующих критерия:

Относительная точность ():

.

Относительная специфичность ():

.

Относительная чувствительность ():

,

где - суммарное число образцов ();

(Положительное отклонение (), отрицательное отклонение (ND), отрицательное согласование (NA), положительное согласование ());

- суммарное число отрицательных результатов для референтного метода ();

- суммарное число положительных результатов для референтного метода ().

5.1.1.3.2 Доверительные интервалы

Вычисление доверительных интервалов, связанных с числом испытанных образцов, приведено в приложении Е.

5.1.1.3.3 Несовпадающие результаты

Проверяют несовпадающие результаты, как описано в приложении F [критерий Мак-Немара (McNemar)], используя подсчет PD и ND (см. 5.1.1.3.1).

Когда значения PD и ND высоки и практически одинаковы, критерий Мак-Немара не позволяет установить статистическое различие между методами. В таком случае лаборатория-организатор должна постараться выяснить причины высоких значений PD и ND. Более того, из вышесказанного следует, что относительную точность метода нельзя интерпретировать, используя только критерий Мак-Немара.

5.1.1.3.4 Сводка вычислений

Все вычисления должны быть представлены в форме таблицы 2.

Таблица 2 - Вычисление относительной точности, относительной чувствительности и относительной специфичности

Матрицы	РА	NA	ND	PD	Сумма	Относительная точность АС (%)		Относительная чувствительность SE (%)		Относительная специфичность SP (%)
					N		РА + ND		NA + PD
Пищевая категория 1
Пищевая категория 2
Пищевая категория 3
Пищевая категория 4
Пищевая категория 5
ВСЕГО

5.1.1.3.5 Интерпретация результатов

Нужно сформировать таблицу, включающую необработанные результаты (то есть все положительные и отрицательные результаты из таблицы 1).

На основании числа положительных отклонений и числа отрицательных отклонений оценивают возможность альтернативного метода получать большее или меньшее число истинно положительных результатов, чем референтным методом.

В отчете об исследовании результаты, полученные с естественно контаминированными и искусственно контаминированными образцами, должны быть представлены раздельно.

Процедура искусственной контаминации испытательных образцов должна быть описана в отчете об исследовании.

Данные, опубликованные в других источниках и соответствующие условиям, указанным в приложении А, можно использовать для оценки относительной точности.

5.1.2 Относительный уровень обнаружения

5.1.2.1 Определение

В рамках данного стандарта под относительным уровнем обнаружения понимают наименьшее число культивируемых микроорганизмов (3.4), которое может быть обнаружено в образце в 50% случаев альтернативным и референтным методами.

5.1.2.2 Протокол измерений

Испытание проводят следующим образом:

- используют один пищевой продукт из каждой пищевой категории, выбранной по 5.1.1.2.1, с учетом области применения валидации (см. приложение В);

- используют пять разных целевых микроорганизмов (или меньше с учетом области применения валидации), каждый из которых предназначен для одной пищевой категории, если это возможно (определение целевых микроорганизмов приведено в приложении G.1);

- предпочтительно проводят испытания для пяти уровней (но минимум для трех уровней) по одному целевому микроорганизму на каждый пищевой продукт, включая отрицательный контрольный образец и т.д. Первым уровнем должен служить отрицательный контрольный образец. Вторым уровнем должен быть теоретический уровень обнаружения. Третий уровень - немного выше теоретического порога обнаружения, и все последующие уровни должны быть выше предыдущего. Можно использовать последовательные верхние уровни с концентрациями, разнящимися множителем, приблизительно равным 3;

- воспроизводят каждую комбинацию (пищевой продукт, уровень контаминации) шесть раз для испытания и альтернативным и референтным методами. Проводят разделение на уровне, где методы отличаются, как показано в приложении D. Таким образом, если этап 1 обоих методов одинаков (например, тот же предварительно обогащенный бульон), проводят разделение на этапе 2 (см. приложение D, случай 1). Если первый этап не одинаков, то есть культуральная среда, методология или степень разведения различаются, то смешивают удвоенную массу образца с равным по массе или объему количеством стерильной воды или другого подходящего разбавителя, а потом разделяют на два подобразца;

- используют полную процедуру альтернативного и референтного методов, включая подготовку образца. Засев каждого пищевого образца можно проводить до или после добавления культуральной среды.

Если нужно, то для обеспечения лучшей прецизионности на самом нижнем уровне посевного материала увеличивают массу пищевого образца или число реплик образцов. Например, можно использовать 75 г пищевого образца, контаминированного тремя клетками, вместо 25 г образца, контаминированного одной клеткой.

Чем больше число использованных уровней засева, тем точнее определение порога обнаружения.

5.1.2.3 Вычисления

Для каждого уровня (i = от 0 до 3) и каждой комбинации пищевой продукт/штамм (j = от 1 до 5) сравнивают оба метода, как указано в таблице 3.

Таблица 3 - Вычисление относительного уровня обнаружения

Метод	Результаты
	Отрицательные (-)	Положительные (+)	Всего
Референтный	а	n - а	n = 6
Альтернативный	b	n - b	n = 6
Всего	а + b	2_n - (а + b)	2n = 12

Для таблиц малого размера 2 на 2 использовать точные критерии Фишера.

5.1.2.4 Сравнения

Чтобы не проводить сравнение обоих методов на каждом уровне и для каждого продукта и штамма, можно использовать одно и то же испытание при сравнении двух продуктов/штаммов на одном и том же уровне.

Если есть основания считать, что продукт и штаммы сравнимы, то такое же испытание можно провести при n > 6 с объединением продукта/штаммов для каждого уровня .

Уровни тоже можно объединять для проверок, но используя при этом ранжирование: , , , , , _, как с объединением продукта/штаммов, так и без объединения.

В отчете указать все существенные различия между методами, продуктами/штаммами и/или уровнями.

5.1.2.5 Интерпретация результатов

Интерпретацию проводит лаборатория-организатор, на которую возложена ответственность за изучение методов сравнения.

Относительный уровень обнаружения лежит между двумя уровнями контаминирования, дающими соответственно уровень обнаружения менее и более 50%. Поэтому относительный уровень обнаружения представляют диапазоном.

5.1.3 Инклюзивность и эксклюзивность

5.1.3.1 Определение

Инклюзивность - это способность обнаружения с помощью альтернативного метода целевого аналита в широком диапазоне штаммов.

Эксклюзивность - это отсутствие интерференции от уместного для альтернативного метода диапазона нецелевых штаммов.

5.1.3.2 Протокол измерений

5.1.3.2.1 Выбор испытательных штаммов

5.1.3.2.1.1 Общие требования

Для устранения локальных отклонений используют диапазон микроорганизмов или штаммов.

Критерии для выбора испытательных штаммов приведены в приложении G.

Для каждого штамма должны быть приведены биохимические, серологические, а если уместно, то и генетические характеристики, подробные в степени, достаточной для установления их идентичности, и предпочтительно, чтобы штамм был изолирован от продукта. Кроме того, материал продукта, из которого он был выделен первоначально, должен быть известен и документирован.

5.1.3.2.1.2 Целевые микроорганизмы

Выбирают не менее 50 чистых культур микроорганизмов, подходящих для альтернативного метода и используемого пищевого продукта (см. G.3), за исключением случая Salmonella (сальмонеллы).

В случае методов для Salmonella выбирают не менее 30 чистых культур или микроорганизмов.

5.1.3.2.1.3 Нецелевые микроорганизмы

Выбирают не менее 30 чистых культур микроорганизмов из числа тех штаммов, что заведомо приводят к интерференции с целевыми микроорганизмами, и из числа штаммов, естественно содержащихся в каждом материале испытуемого продукта, включенного в валидацию (см. G.4).

5.1.3.2.2 Инокуляция

5.1.3.2.2.1 Общие требования

Каждое испытание производится однократно. Засев питательной среды производят с помощью разбавления чистой культуры каждого испытательного штамма. Образец продукта не добавляют.

5.1.3.2.2.2 Целевые микроорганизмы

Уровень засеваемой культуры должен быть в 10 - 100 раз больше минимального относительного уровня обнаружения для альтернативного метода. При этом нужно использовать полный протокол альтернативного метода, включая, если это необходимо, предварительное обогащение. В случае получения ложноотрицательных или сомнительных результатов штаммы нужно испытать повторно с привлечением референтного метода.

5.1.3.2.2.3 Нецелевые микроорганизмы

Уровень засеваемой культуры должен быть близок к наибольшему уровню контаминации, который ожидают обнаружить во всех категориях используемых продуктов.

Необходимо установить наличие эксклюзивности. Если конечная питательная среда культуральной среды представляет собой избирательную жидкую питательную среду (бульон), то такую среду заменяют на подходящую неизбирательную жидкую питательную среду. Если альтернативный метод дает положительные или сомнительные результаты с нецелевыми микроорганизмами, то испытание повторяют с использованием полного протокола. Измерения референтным методом проводят только один раз.

5.1.3.3 Представление результатов

Результаты представляют в виде таблицы 4.

Таблица 4 - Представление результатов по избирательности

Микроорганизмы	Результаты
	Референтный метод		Альтернативный метод
	Ожидаемый результат	Действительный результат	Ожидаемый результат	Действительный результат
Целевые штаммы
1
2
и т.д.
Нецелевые штаммы
1
2
и т.д.

5.1.3.4 Интерпретация результатов

Интерпретацию проводит лаборатория, на которую возложена ответственность за сравнительное изучение методов, причем в расчет должны приниматься как количественные, так и качественные аспекты (т.е. болезнетворность, распространенность, культуральные аспекты испытательных штаммов, например, подвижность, чувствительность к неблагоприятным факторам и т.д.).

Другие опубликованные данные по альтернативному методу, удовлетворяющие требованиям настоящего стандарта, также могут быть использованы лабораторией, отвечающей за сравнительное изучение методов, для получения дополнительной информации о вышеупомянутых критериях (см. приложение А, содержащее критерии признания сторонних результатов).

5.2 Межлабораторное исследование

Целью межлабораторного исследования является установление изменчивости результатов, полученных разными лабораториями при использовании идентичных образцов, и сравнение этих результатов с результатами, полученными при сравнительном исследовании методов.

5.2.1 Протокол измерений

5.2.1.1 Межлабораторное исследование должно включать в себя минимум 10 сотрудничающих лабораторий, результаты которых не содержат выбросы.

Указания и требования по организации, координации и проведению межлабораторных исследований приведены в приложении Н.

Необходимо, чтобы специалист по анализу результатов из каждой сотрудничающей лаборатории проявил достаточную компетентность в применении альтернативного и референтного методов до участия в самом исследовании.

5.2.1.2 Протокол включает следующие требования:

- для приготовления испытательных образцов используют одну подходящую пищевую матрицу (приложение В);

- протокол искусственной контаминации пищевого образца должен соответствовать выбранному пищевому субстрату. Каждый образец должен быть засеян индивидуально. Каждая "слепая" копия (реплика) должна быть приготовлена так, чтобы гарантировать гомогенность образцов при индивидуальном засеве каждой копии. Для установления гомогенности необходимо проанализировать соответствующее число образцов (см. приложение Н);

- необходимо использовать по меньшей мере три разных уровня контаминации: первым уровнем должен быть отрицательный контрольный уровень, один уровень должен быть немного больше уровня обнаружения альтернативного метода и один уровень должен быть примерно в 10 раз больше уровня обнаружения (например, 0; 3 и 30 клеток / 25 г);

- каждая сотрудничающая лаборатория должна проанализировать по меньшей мере 8 "слепых" копий на каждом уровне контаминации референтным и альтернативным методами;

- для анализа готовят суспензию из каждого образца;

- анализ образцов должен быть проведен в каждой лаборатории в установленный день;

- исследуемые образцы культивируют в соответствии с приложением J. Так, если первый этап культивирования одинаков и для референтного, и для альтернативного методов, эту культуру используют для засева на каждом из последующих этапов (приложение J, случай 1). Если первичные культуры для каждого метода различны, то соответствующие реплики используют для индивидуального выполнения каждого метода (приложение J, случай 2);

- в любом случае комбинация "число уровней контаминации/число реплик/число выбранных лабораторий" должна быть подобрана так, чтобы для вычислений имелось не менее 480 результатов (по 240 для каждого метода).

5.2.1.3 Лаборатория-организатор на основании всех полученных данных (см. приложение Н.3) должна определить, какие результаты являются годными, а какие результаты являются выбросами, для должного учета при вычислении данных о точности. Смотри приложение К, в котором приведены рекомендации, определяющие микробиологические условия для отбраковки данных.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Результаты лабораторий-участников не следует исключать, если нет четкого объяснения имеющихся грубых ошибок.

5.2.2 Вычисления

5.2.2.1 Для каждого уровня положительные результаты для каждого метода внести в таблицы 5 и 6.

Таблица 5 - Положительные результаты для стандартного метода

Лаборатории	Уровень контаминации
Лаборатория 1	/8	/8	/8
Лаборатория 2	/8	/8	/8
Лаборатория 3	/8	/8	/8
и т.д.	/8	/8	/8
Всего	(a)	(b)	(c)
(а)Ложноположительные по референтному методу. (b)Истинно положительные на уровне 1 по референтному методу. (с)Истинно положительные на уровне 2 по референтному методу.

Таблица 6 - Положительные результаты для альтернативного метода

Лаборатории	Уровень контаминации
Лаборатория 1	/8	/8	/8
Лаборатория 2	/8	/8	/8
Лаборатория 3	/8	/8	/8
и т.д.	/8	/8	/8
Всего	(a)	(b)	(c)
(а)Ложноположительные по альтернативному методу. (b)Истинно положительные на уровне 1 по альтернативному методу. (с)Истинно положительные на уровне 2 по альтернативному методу.

5.2.2.2 Для уровня и для каждого метода вычислить выраженную в процентах специфичность по формуле

,

где - общее число всех испытаний для уровня ;

- число ложноположительных результатов.

5.2.2.3 Для каждого уровня контаминации и для каждого метода вычислить выраженную в процентах чувствительность SE по формуле

,

где - общее число всех испытаний для уровней и , соответственно;

- число истинно положительных результатов.

5.2.2.4 Для каждого уровня контаминации и совокупности результатов сравнивают альтернативный метод с референтным методом для вычисления относительной точности и для изучения несовпадающих результатов.

Каждую пару результатов, полученных на образце, измеренном альтернативным и стандартным методами, представляют в таблице 7.

Таблица 7 - Парные результаты альтернативного и референтного методов, полученные в межлабораторном исследовании

Альтернативный метод	Референтный метод		Всего
+	+	-
+	РА	PD
-	ND	NA
Всего

Вычисляют относительную точность АС, выраженную в процентах, по формуле

,

где - число испытанных образцов (для уровня или для всех уровней);

РА - число положительных согласований (positive agreement);

NA - число отрицательных согласований (negative agreement).

5.2.2.5 Вычислить доверительные интервалы для каждого соотношения (см. 5.1.1.3.2).

5.2.2.6 Изучить несовпадающие результаты в соответствии с приложением F , используя результаты подсчета PD и ND (см. таблицу 8).

5.2.3 Интерпретация

Сравнивают АС (таблица 7), SE и SP (таблицы 5 и 6) с соответствующими им данными, полученными в сравнительном исследовании, включая естественно контаминированные образцы и относительный уровень обнаружения.

Эти критерии на самом деле не характеризуют внутрилабораторные и межлабораторные изменчивости метода (понятия повторяемости и воспроизводимости). В приложении L приведены дополнительные критерии (согласованность результатов в одной лаборатории, соответствие результатов в разных лабораториях и коэффициент расхождения между согласованностью и соответствием), которые можно использовать при изучении такой изменчивости (критерии повторяемости и воспроизводимости определены для количественных методов, и их как таковые нельзя использовать применительно к качественным методам).

6 Количественные методы. Технический протокол валидации

6.1 Общие требования

Число колоний микроорганизмов в данном образце является наиболее распространенным результатом стандартных количественных методов. Записывают всю информацию - массу образца, серию разбавления, объем посевного материала и число колоний при каждом разбавлении. В микробиологии эти дискретные данные часто сокращают, например, проводят подсчет колоний только в чашках, содержащих менее 300 колоний, потом для получения конечного результата используют коэффициент расширения, обратно пропорциональный коэффициенту разбавления. Из-за наличия других факторов, влияющих на процесс роста микроорганизмов, а также в целях получения симметричного распределения или квазинормального распределения данные подсчета часто преобразуют в логарифмический вид или в значения квадратного корня. Целесообразность такого преобразования можно проверить, используя гистограммы с набором экспериментальных точек (30 или более), полученных при одинаковых условиях.

Разделы 6.2 и 6.3, в основном, относятся к валидации количественных методов сбора непрерывных данных (или данных в интервале значений), при этом отдельно включены замечания по подсчету числа микроорганизмов.

6.2 Сравнительное исследование методов

6.2.1 Линейность и относительная точность

6.2.1.1 Определения

6.2.1.1.1 линейность (linearity): Способность метода при использовании с заданной матрицей давать результаты, пропорциональные количеству аналита в образце, т.е. увеличению аналита соответствует линейное или пропорциональное увеличение результатов.

Примечание 1 - Характеристику результата или сигнальную функцию получают путем измерения зависимости сигнала или результата метода от концентрации аналита (доз) в различных образцах референтных материалов (RM) с известными характеристиками. В микробиологии, где стабильный референтный материал практически отсутствует, эти "известные характеристики" можно получить путем многократных повторных измерений с использованием референтного метода.

После подгонки, сглаживания или обработки другим алгоритмом данных разработчик альтернативного метода должен создать монотонную модель во всей области применения метода для преобразования результатов измерений в значения, наиболее близкие к стандартным результатам. Подгоночная модель является первой (или исходной) градуировочной характеристикой и включает все градуировочные коэффициенты в области концентраций; она часто нелинейна. Но эти аспекты не включены в процедуру валидации.

Частью процедуры валидации является проверка градуировки, которая дает конечную градуировочную характеристику, устанавливающую соотношение между преобразованными результатами измерений и соответствующими "стандартными значениями*2) в одинаковой системе единиц. При использовании одинаковых шкал на осях эта характеристика должна быть линейной с отсекаемым на оси отрезком, равным нулю (одинаковыми наименьшими значениями), и наклоном 1 (при одинаковых масштабных единицах по осям) и правильно оцененными характеристиками разброса.

Не следует проводить экстраполяцию выше и ниже испытательных концентраций, кроме случаев, когда нужно изучить поведение вблизи "нулевой" концентрации.

Примечание 2 - При обработке результатов подсчетов микроорганизмов с помощью метода регрессии линейность не всегда правильно достигается для результатов подсчета, соответствующих низким уровням или широким диапазонам. Такие результаты подсчетов имеют квазипуассоновские распределения со среднеквадратическим отклонением воспроизводимости, пропорциональным корню квадратному из среднего подсчитанного числа микроорганизмов. При этом возникают те же трудности оценки, которые упомянуты в примечании к пункту 6.2.2.1.

6.2.1.1.2 точность (accuracy): Близость результатов испытания к принятому опорному значению величины (ISO 3534-1).

Примечание - Термин "точность", когда он относится к серии результатов испытаний, включает в себя сочетание случайных составляющих и общей систематической погрешности (смещения).

6.2.1.1.3 смещение (систематическая погрешность) (bias): Разность между математически ожидаемым результатом испытания и принятым опорным значением (ISO 3534-1).

Примечание - Смещение есть полная систематическая погрешность в отличие от случайной погрешности. Могут быть одна или несколько составляющих систематической погрешности, дающих вклад в смещение. Большему систематическому отклонению от принятого опорного значения соответствует большее значение систематической погрешности.

6.2.1.1.4 относительная точность (АС) (relative accuracy): Степень соответствия между результатом, полученным референтным методом, и результатом, полученным альтернативным методом, при исследовании идентичных образцов (см. 5.1.1.1.1).

6.2.1.2 Протокол измерений

6.2.1.2.1 План

Для проверки градуировочной характеристики требуется большое число различных образцов (при возможности, референтные материалы - см. приложение С) и исследование нескольких уровней (доз или концентраций) в зависимости от диапазона концентраций для практического использования.

Для определения градуировочной характеристики требуется использование минимум пяти раз личных уровней аналита для каждого типа пищевого продукта. Уровни должны равномерно распределяться по всему исследуемому диапазону*3), включающему минимальный (равный или не равный нулю), центральный, максимальный и два промежуточных уровня. Шкалу следует выбрать до того, как выбраны уровни концентрации, и с учетом диапазона контаминации и ожидаемого предела обнаружения (LOD): линейную - для небольших диапазонов (например, < 3LOD или от 10LOD до 100LOD), включающих ноль, и логарифмическую - для широких диапазонов (например, > 3LOD). При этом может измениться соотношение между среднеквадратическими отклонениями и средними значениями результатов (см. примечание в п. 6.2.1.3.1).

Приоритет отдается естественно контаминированным образцам. Термин "уровень" используется в значении концентрации аналита, предполагаемой априори. В принципе, оптимальный план для регрессионного анализа получают путем выбора подходящего и уместного диапазона концентраций аналита, исключения исследования образцов с аналогичными подсчетами микроорганизмов или исключения повторяющихся данных с одинаковыми результатами. Для жидкостей диапазон может быть получен путем разведений, но необходимо обеспечить гомогенность как жидких, так и твердых образцов.

Образцы на одном уровне должны быть независимо продублированы путем подготовки подобразцов. На каждом уровне анализируют одинаковое число подобразцов - по меньшей мере два, а в идеальном случае - от 5 до 10. Когда и в референтном, и в альтернативном методах используют одни и те же десятикратные разведения подобразцов, испытания дублируют на уровне чашек Петри (см. случай 1 приложения М). Когда десятикратные разбавления нужно проводить только в референтном методе, проводят исследование дублирующих образцов (см. случай 2 приложения М).

Чашки Петри в двух дупликациях засевают каждым десятикратным разбавлением.

Следовательно, для проверки градуировочной характеристики альтернативным методом проводят минимум 10 измерений (в идеальном случае - от 25 до 50 измерений) с использованием естественно контаминированных образцов.

При отсутствии референтных материалов невозможно корректно оценить точность альтернативного метода, и определяют только относительную точность путем измерения тех же подобразцов референтным методом.

6.2.1.2.2 Категории пищевых продуктов

Исследуют 5 категорий пищевых продуктов. Это число можно уменьшить до 1, 2 или 3 категорий, если альтернативный метод подлежит валидации только для такой заявленной категории (например, молочные продукты). Рекомендованные категории перечислены в приложении В.

Соответствующие образцы должны быть естественно контаминированы исследуемым аналитом.

В случае возможности использования образцов окружающей среды их нужно считать отдельной категорией (см. приложение В).

Желательно, чтобы образцы пищевых продуктов происходили из как можно более широкой зоны распространения, для того чтобы уменьшить смещения, обусловленные особенностями местного пищевого ассортимента, и расширить диапазон валидации.

Диапазон контаминации должен быть распространен на весь диапазон количественного испытания.

Если невозможно получить достаточное число естественно контаминированных образцов пищевых продуктов с нужными уровнями, то допустима искусственная контаминация некоторых образцов. Такие образцы должны составлять меньшинство в общем числе испытуемых образцов. Процедура искусственной контаминации должна обеспечивать получение образцов с характеристиками аналита, подобным таковым для естественно контаминированных образцов (см. приложение С, 2-й и 3-й случаи).

Таким образом, для каждой из пяти пищевых категорий и референтным, и альтернативным методами измеряют минимум пять уровней целевого аналита, причем каждый образец реплицируется одинаковое число раз (от 2 до 10), что составляет всего от 10 до 50 измерений для каждых метода и пищевой категории. Если полученные результаты дают основания полагать, что матрица негомогенна или по составу ее компонентов или из-за вариаций в концентрации целевого аналита по матрице, то необходимо провести исследование дополнительных образцов.

После раздельной оценки по каждой пищевой категории глобальная оценка градуировочной характеристики для всех категорий пищевых продуктов является полезным инструментом для идентификации возможных расхождений между областью применения, точностью и разбросом повторяемости во всем диапазоне аналита.

6.2.1.3 Вычисления

6.2.1.3.1 Общие требования

Перед тем как проводить какие-либо вычисления, строят график значений, представленных двумерными точками, для каждого образца для референтного и альтернативного методов, используя ось у (вертикальную) для альтернативного метода, а ось х (горизонтальную) для референтного метода. Точки на каждом уровне должны образовывать дискретный кластер. Для обнаружения выбросов и нелинейности исследуют график визуально с целью обнаружения аномальных результатов, которыми являются те, что явно отдалены от соответствующего кластера. Если таковые имеются, то образец испытывают повторно, если это возможно. Если нет объяснения или результат по-прежнему остается вне кластера, то надо временно отбросить такой результат и повторить указанные ниже вычисления, чтобы оценить влияние отброшенного результата путем сравнения с вычислениями с учетом всех данных. Если это связано с эффектом разбавления, то внимательно исследуют эту возможность.

Если все кажется правильным, то используют программу линейной регрессии*4), которая дает возможность определить вероятность недостаточного согласования или нелинейности, и, что также возможно, программу регрессии с неравномерным взвешиванием (ISO 11095). Если доступна менее продвинутая программа вычислений или имеется только компьютер с меньшей производительностью, то требуемые вычисления приведены в п. 6.2.1.3.2. Если простая линейная регрессия приводит к линейной аппроксимации (y = a + bx), то ее коэффициента корреляции r недостаточно для получения требуемой информации. Статистическая значимость r или наклона b не являются синонимами критерия линейности. В этом случае нужно проверить две гипотезы (а = 0 и b = 1).

Примечание - Если ошибка повторяемости по у (или также по х) зависит от значения у (что, к сожалению, часто случается на практике), например прямо пропорционально увеличивающаяся ошибка, то лучше использовать сглаженную взвешивающую функцию (например, вес [y] = постоянная/дисперсия = постоянная/), чтобы правильно аппроксимировать прямую линию y = a + bx с помощью метода линейной регрессии (аналогично методу взвешенных наименьших квадратов для взвешенных наименьших квадратов). Это приближает прямую к наблюдаемым точкам, которые имеют меньший разброс, и удаляет от точек с большим разбросом. При этом оценки наклона b и отсекаемого отрезка а сильно зависят от такой процедуры взвешивания. Это трудный технический прием, предназначенный для статистического использования, и в настоящем стандарте не применяется. Дополнительные сведения можно найти в книгах по статистике, посвященным общему линейному моделированию GLIM/GLM, и т.д. (ISO 11095). Таким образом, если после сбора данных и изучения графиков регрессии вопрос о линейности остается сомнительным, рекомендуется использовать статистическую экспертизу для данного анализа.

6.2.1.3.2 Оценки с помощью метода регрессии

6.2.1.3.2.1 Принцип метода регрессии

В общем случае вертикальную ось у (зависимую переменную) используют для альтернативного метода, а горизонтальную ось х (независимую переменную) - для референтного метода. Эта независимая переменная х должна быть точной, прецизионной и иметь вполне известные значения.

Если есть основания предполагать, что погрешность повторяемости (x), которая может возникнуть по x, сравнительно сопоставима или превышает таковую для (y) по y, то подгоночная функция y(x) или x(y) может привести к значительно отличающимся прямым линиям. В случае, когда среднеквадратичные отклонения повторяемости (x) и (y) сравнимы (соответственно по x и по y), вычисляют другие оценки (см. приложение R.3). Если повторяемость для намного больше, чем для , то меняют оси x на y и y на x для проведения регрессии y(x) или используют регрессию x(y) без перестановки осей (см. приложение R.4). При таких выборах (см. приложение R.2) используют критическую точку отсечения, равную 2, для отношения погрешностей повторяемости по x и y или обратного значения.

Подробности вычислений приведены в приложении R.

6.2.1.3.2.2 Дополнительные оценки

Если погрешности повторяемости или остаточная погрешность сильно зависят от х (или от у), то есть остатки, кажется, явно увеличиваются или уменьшаются с х (или с у, то есть s не является константой), то подгоночная линия регрессии может быть неверной и может не проходить через точки с большей точностью. Более того, соотношение между CL и х (или и у) может быть ненадежным в основной части диапазона измерений. В этом случае используют метод взвешенной регрессии.

Когда это представляется необходимым и для того, чтобы упростить этот шаг, можно использовать монотонные математические преобразования обеих осей х и у. Например, преобразования x' = log x и y' = log y или x' = и y' = можно использовать для получения хорошей оценки для m (отрицательного или положительного, полуцелого или нет): выбор производят по визуальной оценке остатков или повторяемости для каждого х. Постоянные погрешности соответствуют идеальному преобразованию.

При использовании такого преобразования отсекаемый на оси отрезок а не должен очень сильно отличаться от нуля. Затем, когда проведены все оценки, как, например, оценки значений < y > и CL, могут быть выполнены их обратные преобразования.

6.2.1.4 Интерпретация

6.2.1.4.1 Соотношение относительных точностей альтернативного и референтного методов оценивают с помощью линейной модели: y = a + bx.

При отсутствии систематической погрешности между методами (т.е. при идеальной точности) это уравнение переходит в уравнение у = х, которое применимо в случае, когда характеристики методов эквивалентны. В этом случае отсекаемый отрезок теоретически равен нулю. Оценку величины отсекаемого отрезка а получают для обоих методов путем проверки гипотезы р {а = 0}. Если альтернативный метод имеет систематическое смещение относительно референтного метода, то вероятность р {а = 0} менее а = 0,005 (двухсторонний доверительный интервал).

Теоретический наклон линии, проходящей через точки, соответствующие общей истинной эквивалентности методов, равен единице. Оценочный наклон b, полученный обоими методами, должен быть проверен при помощи гипотезы р {b = 0}. Если альтернативный метод не дает достоверно совпадающих значений со значениями референтного метода, то вероятность р {b = 1} менее = 0,05 (двухсторонний доверительный интервал). В этом случае альтернативный метод имеет систематическую погрешность относительно стандартного метода, зависящую от значений концентрации (х или у) и достигающую максимума на границах области.

6.2.1.4.2 Линейность или несогласование может быть представлено графически (приложение N). Лучшим является график остатков (см. приложение R.1). Строится не график зависимости значений {} от {} {k = 1 до N, N = qn), а график зависимости оценочных остатков {} от {}, который характеризует характер нелинейности, если она обнаружена с помощью функции p(F), приведенной в приложении R.5.

6.2.1.4.3 Оценку точности методов с использованием получают, главным образом, на основании остаточного среднеквадратического отклонения (см. приложение R). Такая оценка характеризует границы, в пределах которых специфицированная точность результата определяется с вероятностью 95% при t, приблизительно равном 2.

Соответствующие (см. приложение R) предпочтительнее для использования, так как они включены в справочную систему.

6.2.2 Обнаружение и предел количественного определения

6.2.2.1 Общие требования

Следующая характеристика связана с надежностью сигнала (или результата), полученного альтернативным методом, для определения ненулевой концентрации, измеренной референтным методом. Такая характеристика дает пределы прецизионности, включающие систематическую погрешность на нижнем крае области концентраций.

Фоновый шум, или "фон", (инструментального или иного происхождения) обычно определяют как минимум шестью независимыми холостыми измерениями. Результат такого измерения используют для корректировки общей систематической погрешности реальных измерений с помощью центрального (среднего) значения, и он служит важной оценкой разброса .

Часто, когда невозможно измерить или обнаружить величину ниже данного нижнего уровня, выбирают образцы с концентрацией микроорганизмов, близкой к первой оценке , взятой из предыдущей прямой линии для проверки градуировки:

,

где определено в приложении R. В окрестности такой концентрации оценивают среднеквадратическое отклонение, ожидаемое значение которого близко к и которое используется вместо него. Другая процедура предусматривает использование среднего значения и среднеквадратического отклонения всех данных измерений самых низких доз, обнаруженных после реплицирования разведений по одной и той же схеме (коэффициент разведения от 1:2 до 1:10).

Примечание - Оценка среднеквадратического отклонения включает в себя много неопределенностей, в основном, связанных с диапазоном ниже нижнего уровня разведения. Таким образом, исходная оценка s (проводимая, по возможности, устойчивым методом , приведенным в приложении Q) часто является достаточной для получения дополнительных оценок.

6.2.2.2 Определения

6.2.2.2.1 критический уровень (LC) (critical level): Наименьшее (ненулевое) количество, которое можно обнаружить, но для которого нельзя получить точное количественное значение. Ниже этого уровня нельзя быть уверенным, что истинное значение не равно нулю.

Примечание - На этом уровне вероятность ложноотрицательных результатов равна 50% ( - статистическая ошибка второго типа, см. 6.2.2.4).

6.2.2.2.2 предел обнаружения (LOD) (detection limit): Больше, чем критический уровень (6.2.2.2.1), поскольку он включает показатель, т.е. доверительную вероятность 1 - , который должен быть намного выше 50 %, например 95%.

Например, среднее значение (холостое) + (холостое), где есть гауссовское критическое значение при (односторонний доверительный интервал, см. 6.2.2.4) для достаточно большого числа n холостых образцов.

6.2.2.2.3 предел количественного определения (LOQ) (quantification limit): Наименьшее количество аналита (т.е. наименьшее реальное число организмов), которое можно измерить и количественно оценить с заданной прецизионностью и точностью в экспериментальных условиях метода, подлежащего валидации.

Примечание - Ассоциация химиков-аналитиков, состоящих на государственной службе, (АОАС), определяет предел количественного определения для количественных методов как LOQ = . Это равноценно утверждению, что коэффициент изменчивости должен быть ниже 10% , см. [2].

6.2.2.3 Протокол измерений и образцы

Для оценки базового или порогового разброса проводят по меньшей мере шесть (лучше 10) определений холостых образцов (отрицательных, с нулевой дозой или дозой, близкой к нулю).

Примечание - При подсчете числа организмов достаточно более пяти образцов на минимальном, не равном нулю, уровне, для того, чтобы удостовериться, что степень контаминации составляет р < 50%, когда не обнаруживается положительных образцов (доверительный уровень 95%). Если обнаруживается один положительный образец из пяти, то можно считать, что р > 1%. Таким образом, если начать с трех доз аналита стандартного материала, выбранных из 3, 10, 30, 100, 300 и т.д. КОЕ/единица, и реплицируя каждый из них минимум шесть раз, можно оценить критический уровень (50%-ное обнаружение): например, в идеальном случае может быть следующее: 0/6 при 10, 2/6 при 30, 5/6 при 100, что дает оценку, близкую к 30 КОЕ/единица. Тем не менее, оценку, которую дает эта процедура, можно использовать (Данные о когерентном оценивании см. в приложении Р).

6.2.2.4 Вычисления

В общем случае критический уровень и предел обнаружения включают статистические ошибки двух типов: (соответствует определению несуществующей разницы (ложноположительный результат) и (соответствует определению несуществующей разницы (ложноположительный результат)). Показатель 1 - * является вероятностью достоверного определения значения, превышающего критический уровень (LC).

Из результатов определений на холостом образце оценивают их среднеквадратическое отклонение (по , приложение R) и систематическую погрешность = медиане , что свидетельствует об общей недостаточной специфичности, которая является статистически значимой, если

(см. ниже).

Критический уровень (+ для альтернативного метода) для (и 1 - = 50%).

(Точнее, , где является значением коэффициента Стьюдента для одностороннего уровня и n - 1 степени свободы, для и , и при этом ; если , то ).

Предел обнаружения равен (+ для альтернативного метода) для и 1 - = 95%.

(Точнее, , где является значением коэффициента Стьюдента для одностороннего уровня и - 1 степени свободы, например, для и и при этом ; для , ).

Предел количественного определения LOQ 10 ( для альтернативного метода).

6.2.3 Относительная чувствительность и определение неизвестных образцов

6.2.3.1 Общие требования

Оценку чувствительности применяют для того, чтобы убедиться, что значения, получаемые альтернативным методом, заметно не отличаются от таковых для стандартного метода (разница менее 30%).

6.2.3.2 Определение

6.2.3.2.1 относительная чувствительность метода (SE) (relative sensitivity): Способность альтернативного метода обнаруживать два разных количества аналита, измеренных референтным методом в заданной матрице с заданным средним значением или по всему диапазону измерения; т.е. это - минимальное изменение количества (увеличение концентрации х аналита), которое приводит к значимому изменению измеряемого сигнала (результат у).

Примечание - Относительная чувствительность отличается от предела обнаружения (6.2.2), так как ее вычисляют для каждого значения в диапазоне измерений. Она связана со статистическими ошибками двух типов (двухсторонний доверительный интервал) и b.

6.2.3.3 Вычисления

Протокол измерений и образцы описаны в 6.2.1.2.

Относительная чувствительность: (<х(у)>) для двухстороннего доверительного интервала с = 5% и показателя при s(< х(у) >) s(< у >)/b в соответствии с приложением R.6.2.

(Точнее, = ( + )(< х(у) >). Для статистической мощности и и , при этом ).

Идентификация и определение неизвестных образцов: < х(у) > = < х >t

Строят график профиля прецизионности s(< х(у) >) или график зависимости CV(< x(y) >) от х(у).

6.2.4 Специфичность, инклюзивность и эксклюзивность

6.2.4.1 Определения

6.3.7.1.24 специфичность (specificity): В настоящем стандарте определяется как степень, в которой на метод влияют (или не влияют) другие компоненты, присутствующие в многокомпонентном образце, т.е. способность метода точно обнаруживать данный аналит или измерять его количество в образце без интерференции со стороны нецелевых компонентов, таких как влияние матрицы или фоновый шум.

6.3.7.1.25 инклюзивность и эксклюзивность (inclusivity, exclusivity): В настоящем стандарте избирательность определяется как мера степени отсутствия интерференции при наличии нецелевых аналитов. Метод избирателен, если его можно использовать для обнаружения исследуемого аналита и если он гарантирует, что обнаруживаемый сигнал может происходить только от такого специфического аналита.

Критерий неприменим к суммарному числу жизнеспособных организмов.

6.3.7.1.26 Инклюзивность: Способность альтернативного метода обнаружить целевой аналит в широком спектре штаммов.

6.3.7.1.27 Эксклюзивность: Отсутствие интерференции от сопутствующего спектра нецелевых штаммов в альтернативном методе.

6.2.4.2 Протокол измерения

6.2.4.2.1 Образцы

В микробиологии (за исключением случая суммарного определения числа микроорганизмов, посеянных в чашки Петри) инклюзивность и эксклюзивность устанавливаются с помощью анализа:

- минимум 30 положительных чистых штаммов (исследуемого аналита);

- минимум 20 отрицательных чистых штаммов (аналитов, отличных от исследуемого) из культур, отличающихся тем, что они обычно создают постоянную и устойчивую интерференцию с целевым аналитом.

Выбирают положительные и отрицательные штаммы, которые часто контаминируют исследуемый пищевой продукт (ы). Для штаммов, не принадлежащих к данному набору, проводят полную идентификацию различных испытываемых штаммов. Необходимо знать источник происхождения штаммов, не входящих в набор.

Критерии для выбора штаммов приведены в приложении G.

Чистые штаммы из лабораторных культур составляют испытываемые образцы. Уровень инокуляции для каждого микроорганизма фиксируют на уровне, в 100 раз превышающем порог обнаружения целевых штаммов.

Каждый образец, содержащий штамм, анализируют дважды.

6.2.4.2.2 Протокол измерений

Специфичность, инклюзивность и эксклюзивность референтного метода не нужно устанавливать, если они уже известны.

6.2.4.3 Представление результатов

Характеристика избирательности дается только описательно (см. таблицу 8) относительно предела обнаружения целевого аналита, и поэтому вычисления не требуются. Отсутствие инклюзивности и эксклюзивности - это часть общей недостаточности специфичности (см. также систематическую по грешность в п. 6.2.1.4).

Таблица 8 - Представление результатов для инклюзивности и эксклюзивности

Испытанный штамм	Референтный метод. Ожидаемый или полученный результат, уровень инокулята и т.д.	Альтернативный метод. Результаты (указать уровень обнаружения, и т.д.)
	(Единичное испытание)	Дупликат
Целевые штаммы
и т.д.
Нецелевые штаммы
и т.д.

Опубликованные данные, соответствующие требованиям настоящего стандарта, лаборатория-организатор, на которую возложена ответственность за сравнительное исследование методов, также могут использовать для получения информации, дополнительной к вышеуказанным критериям (см. приложение А, в котором приведены критерии для признания сторонних результатов).

6.2.4.4 Интерпретация

Для надежного использования необходимо оценить, соответствует ли альтернативный метод спецификациям изготовителя, а также конкретным требованиям.

6.2.5 Дополнительные характеристики альтернативного метода

Для альтернативного метода документируют все относящиеся к делу характеристики, влияющие на работу метода, например стабильность, достоверность, устойчивость или повышенная надежность и т.д.

6.3 Межлабораторное исследование

6.3.1 Общие требования

Проводят совместное исследование для сравнения рабочих характеристик (точности и прецизионности) альтернативного метода и референтного метода.

Рекомендации для лаборатории-организатора, относящиеся к совместному исследованию, приведены в приложении Н (также см. ISO 5725-2).

6.3.2 Термины и определения

В настоящем стандарте используются следующие термины и определения:

6.3.2.1 точность (accuracy): Степень близости результатов измерений к принятому опорному значению (ISO 3534-1).

Примечание - Это примерно оценивается как систематическая ошибка, которая является системной частью ошибки.

6.3.2.2 прецизионность (precision): Степень близости независимых результатов испытаний, полученных в конкретных регламентированных условиях повторяемости и воспроизводимости (см. 6.3.5 и 6.3.6) (ISO 3534-1).

6.3.2.3 выброс - резко отклоняющееся значение (outlier): Экстремальное значение, которое обычно случайным образом проявляется менее чем в 1% испытаний, но более часто в случае возникновения аномальных ситуаций. Для количественной оценки соответствующей вероятности нужно использовать соответствующие критерии.

Примечание - "Устойчивый" подход, используемый в настоящем стандарте, не исключает из рассмотрения выброс, за исключением того случая, когда имеются явные свидетельства разумного микробиологического обоснования. Такой подход можно использовать или в виде испытательной процедуры для обнаружения выброса, или для "устойчивых" статистических оценок.

6.3.3 Протокол измерений и образцы

6.3.3.1 Межлабораторное исследование проводят минимум в восьми сотрудничающих лабораториях, имеющих результаты без выбросов.

Оценки точности и прецизионности вычисляют по большому числу дублирующих результатов испытаний. Полученное значение должно включать в себя минимум 96 результатов для одной выбранной пищевой матрицы.

Рекомендации и требования к организации, координации и проведению межлабораторных исследований приведены в приложении Н.

На лабораторию-организатор возложена также ответственность за подготовку протокола испытаний и таблицы данных (см. ниже) для записи всех экспериментальных данных и критических экспериментальных условий, использованных каждой лабораторией (см. приложение Н.3).

Необходимо, чтобы специалист по анализу результатов из каждой сотрудничающей лаборатории проявил достаточную компетентность в применении альтернативного и референтного методов до участия в самом исследовании.

6.3.3.2 Протокол включает в себя следующие требования:

- нужно использовать одну подходящую пищевую матрицу (см. приложение В);

- концентрации аналита должны быть выбраны так, чтобы они включали, по меньшей мере, нижний, средний и верхний уровни всего диапазона для альтернативного метода. Лаборатория-организатор должна подтвердить гомогенность образцов;

- должен быть включен отрицательный контрольный образец; можно - использовать пищевые образцы, искусственно контаминированные целевым аналитом;

- для сравнения альтернативного и референтного методов должны использоваться одни и те же образцы для обоих методов. Четыре подобразца на каждом уровне (или две аликвотные пробы, каждую из которых измеряют обоими методами) приготовляют для каждой лаборатории. Такие образцы кодируют слепым образом, но снабжают этикетками так, чтобы два из них измерялись референтным методом и два - альтернативным;

- жидкие образцы (по сравнению с твердыми образцами) обеспечивают большую гарантию гомогенности, если их приготавливают и рассылают без изменения микробиологического состава и правильно используют. В особых случаях может оказаться необходимым разделить образцы прямо перед измерением обоими методами;

- анализ образцов нужно проводить в каждой сотрудничающей лаборатории и в лаборатории-организаторе в указанный день с использованием сходных партий сред и комплектов оборудования для испытаний;

- округление результатов должна проводить лаборатория-организатор. После группировки результатов каждой из лабораторий окончательные табулированные данные для каждого уровня (j) аналита должны быть представлены, как показано в таблице 9.

Таблица 9 - Представление результатов межлабораторного исследования для каждого уровня (j) аналита

Лаборатории (i)	Методы () и дупликаты ( )
	Референтный метод (кодированный)		Альтернативный метод (кодированный)
	Дупликат 1	Дупликат 2	Дупликат 1	Дупликат 2
1
2
и т.д.
(n)

6.3.4 Вычисления

6.3.4.1 В микробиологии данные {y} не всегда подчиняются нормальному, т.е. гауссовскому, статистическому распределению.

Распределение данных можно проверить, если имеется достаточное число значений (намного более 30 результатов) - все для одного уровня. Часто для получения более симметричного распределения немногочисленные отсчеты лучше преобразовать в логарифмы. Также можно использовать более сложные процедуры.

Часто бывает трудно получить надежные оценки (среднее, среднеквадратическое отклонение и т.д.) с малой систематической погрешностью, особенно при наличии выбросов. ISO 5725 включает в себя критерии резко отклоняющихся значений, т.е. выбросов, для того чтобы отбросить неблагоприятно влияющие значения и получить лучшую оценку; однако при этом уменьшается число значений, используемых для статистического анализа.

Поэтому для того, чтобы избежать таких трудностей, в настоящем стандарте используют устойчивые оценочные алгоритмы, которые нечувствительны к экстремальным значениям и, более того, не слишком зависят от распределения данных. Кроме того, такие алгоритмы позволяют сохранить данные лабораторий с экстремальными значениями, если исключение данных не подтверждено вескими микробиологическими обоснованиями. Используют три согласованных значения для каждой из лабораторий-участников:

- оценку глобального центра (для оценок систематической погрешности): срединное значение (медиану) MED (вместо среднего значения М);

- оценку разброса между средними значениями дупликатов, включая воспроизводимость , основанную на значении рекурсивной медианы (6) (см. приложение Q), вместо классического среднеквадратического отклонения (s);

- оценку типичного внутреннего разброса, среднеквадратического отклонения повторяемости, полученного из срединного значения (медианы) среднеквадратических отклонений дупликатов: MED{}, вместо классического обобщенного среднеквадратического отклонения, основанного на среднем значении дисперсий.

6.3.4.2 Для каждого метода k (например, 1 - стандартный, 2 - альтернативный) и уровня j аналита производят вычисления в соответствии с таблицей 10.

Таблица 10 - Представление результатов межлабораторного исследования по оценке согласованных значений для каждого метода

Уровень Метод	Реплики
	1	2
Лаборатория () 1
2	...		...	...	...
...
N	...		...	...	...
МЕДИАНА: Устойчивая

Константы и только последняя константа зависима от того, что используются только дупликаты (значения двух лабораторий), а не большее число реплик*(5).

соответствует следующей процедуре, в которой не используется оценка центра:

. Она включает два этапа последовательного вычисления медианы:

- по каждому из n значений вычисляют медиану (n - 1) абсолютных разностей этого значения с другими значениями; и

- оценка разброса - это медиана n медиан этих отклонений, подсчитанных в предыдущем шаге (например, см. приложение Р).

Примечание - Более совершенные процедуры отсутствуют. Абсолютное отклонение медианы для значений, вычисленных по процедуре МЕDианы (или MAD), равно . Это устойчивая оценка разброса симметрична относительно оценки центра (MED).

Для распределения Гаусса: 1,4826MAD. Другая сопоставимая альтернатива основана на межквантильном диапазоне IQR = Q3 - Q1 = 3-я - 1-я квартили; для распределения Гаусса 1,4826 /QR/2. Последний результат легко получить с помощью процедур программы EXCEL*6).

6.3.5 Относительная точность

6.3.5.1 Определение

В настоящем стандарте принятые опорные значения, используемые в определении правильности, задаются только результатами, полученными референтным методом на идентичных образцах.

Таким образом, отклонение результатов измерений, полученных альтернативным методом, лучше соответствует относительной точности.

6.3.5.2 Вычисления

Для каждого уровня аналита вычисляют для всех лабораторий до , где - среднее дупликатов лаборатории i, полученное альтернативным методом;

- среднее дупликатов лаборатории i, полученное стандартным методом.

Таким образом, медиана , равная систематической погрешности D, и устойчивое среднеквадратическое отклонение порождают - образную статистику:

с n - 1 степенями свободы (df).

По таблице распределения Стьюдента t находят вероятность того, что D = 0. (Например, для n = 12(11df) критическое значение для двухстороннего доверительного интервала с = 0,05 равняется ). Если , то систематическая погрешность D между двумя сравниваемыми методами значима, т.е. альтернативный метод имеет недостаточную точность относительно референтного метода для такого уровня j.

Соотношение между относительной точностью и уровнями можно моделировать (постоянная или пропорциональная систематическая погрешность и т.д.) с учетом линейности градуировочной характеристики.

6.3.5.3 Интерпретация

Предполагается нулевая систематическая погрешность (D = 0). Однако если оцененное абсолютное значение D слишком большое для цели данного метода или достигнута статистическая значимость, то альтернативный метод отличается от референтного.

6.3.6 Повторяемость

6.3.6.1 Термины и определения

6.3.6.1.1 повторяемость (сходимость) (repeatability): Характеристика близости согласования последовательных и независимых результатов анализа, полученных одним и тем же методом на идентичном испытуемом материале при одних и тех же условиях (оборудование, оператор, лаборатория и короткий промежуток времени, т.е. в условиях повторяемости).

6.3.6.1.2 предел повторяемости (r) (repeatability limit): Значение, которое с доверительной вероятностью 95% не превышается абсолютной величиной разности между результатами двух измерений (или испытаний), полученными в условиях повторяемости.

На практике, если разность между двумя результатами превышает (r), результаты должны считаться сомнительными.

6.3.6.2 Вычисления

Для каждого метода k и уровня j аналита вычисляют:

- предел повторяемости *7) среднеквадратическим отклонением повторяемости ;

- относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости .

Повторяемость альтернативного и справочного методов проверяют, используя F-распределение:

c и степенями свободы. По F-таблице определяют вероятность p(F) того, что ; например, для = 12 критическое значение для двухстороннего доверительного интервала с равно

Если F или 1/F больше , то тогда сравниваемые методы обладают разной повторяемостью для уровня j.

Соотношение между повторяемостью и уровнями можно моделировать так же, как относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости. Дополнительные сведения содержатся в ISO 5725.

6.3.6.3 Интерпретация

Предполагается сопоставимая повторяемость для каждого уровня аналита. Однако, если получена статистическая значимость (двухсторонний доверительный интервал), альтернативный метод отличается от референтного.

В настоящее время отсутствуют критерии для отбраковки альтернативного метода.

6.3.7 Воспроизводимость

6.3.7.1 Термины и определения

В настоящем стандарте используются следующие термины и определения:

6.3.7.1.1 воспроизводимость (reproducibility): Характеристика близости согласования между отдельными результатами испытаний на идентичном испытательном материале, полученными с использованием одного и того же метода операторами в разных лабораториях с использованием разного оборудования (т.е. в условиях воспроизводимости)

6.3.7.1.2 предел воспроизводимости (R) (reproducibility limit): Значение, которое с доверительной вероятностью 95% не превышается абсолютной величиной разности между результатами двух измерений (или испытаний), полученными в условиях воспроизводимости.

На практике, если разность между двумя результатами превышает R, результаты должны считаться сомнительными.

6.3.7.2 Вычисления

Значение R вычисляют по среднеквадратическому отклонению воспроизводимости и межлабораторному среднеквадратическому отклонению для каждого метода k и каждого уровня j аналита:

- предел воспроизводимости со среднеквадратическим отклонением воспроизводимости и лабораторной дисперсии при ;

- относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости = 100% .

Воспроизводимости альтернативного и референтного методов сравнивают, используя F - распределение: с (- 1) степенями свободы. По F - таблице определяют вероятность p(F) того, что ; например, для = 12 (11df) критическое значение для двухстороннего доверительного интервала с = 0,05 равно . Если или 1/F больше , то сравниваемые методы обладают разной воспроизводимостью для уровня j.

Можно моделировать соотношение между воспроизводимостью и уровнями, а также относительную воспроизводимость . Дополнительные сведения содержатся в ISO 5725.

После этого оценить вероятность p(F) того, что однородность "межлабораторного разброса", представляющего собой лабораторные различия, меньше, чем их собственный типичный разброс измерений: с и степеней свободы. По F - таблице определяют вероятность p(F), характеризующую важность межлабораторной дисперсии .

6.3.7.3 Интерпретация

Предполагается сопоставимая воспроизводимость для каждого уровня аналита. Однако, если получена статистическая значимость p(F) < (двухсторонний доверительный интервал), альтернативный метод отличается от референтного (в худшую или лучшую сторону в зависимости от R).

В настоящее время отсутствуют критерии для отбраковки альтернативного метода.

Соотношение в целом верно. Однако это зависит от результатов метода и контекста применения. Вероятность наличия неоднородности при большом разбросе между лабораториями обычно свидетельствует о том, что стандартизацию метода нужно усовершенствовать, т.е. рабочие инструкции не вполне понятны (формулировка, объяснения и т.д.), анализы проводятся некачественно (недостаточность квалификации) или присутствуют аномальные изменения во времени для реакций, культур и т.д., а также всех внешних условий в лаборатории.

_________________________

*1) Труднодостижимо, если различаются этапы предварительного обогащения.

*2) Их получают по стандартному методу с естественно контаминированными образцами, если недоступны референтные материалы и известные значения.

*3) Графические примеры неприемлемых и приемлемых распределений результатов измерений приведены в приложении Р.

*4) Или электронную таблицу, как в Excel.

*5) Константа вычисляется по формуле , где = значению - квадрат для p = 0,5 {здесь } и v степеней свободы в повторных результатах (здесь для дубликата v = 2 - 1).

*6) Использовать следующие статистические функции Excel: MEDIAN (диапазон) для 2-й квартили и QUARTILE (диапазон; k), где = 1,2 или 3 для 1-й, 2-й и 3-й квартилей.

*7) Константа c и двухсторонним или 95% уровнем доверительной вероятности.

Библиография

[1] EN ISO 9001, Quality management systems - Requirements (ISO 9001:2000)

[2] EN ISO/IEC 17025, General requirements for the competenct of testing and calibration laboratories (ISO/IEC 17025:1999)

[3] ISO 11095, Linear calibration using reference materials

[4] C. Clayton, J. Hines, .P.Elkins, Detections limins with specified assurance probabilities, Anal. Chem. (1987), 59, 2506 - 2514

[5] D. Coleman, J. Auses, N. Grams, Regulation - From an industry perspective or Relationships between detection limits, quantation limits, and significant digits, Chermometric & Intel. Lab. Syst. (1997), 37, 71-80

[6] L. A Currie, Limits for qualitative determination: Application to radiochemistry, Anal. Chem. (1968), 40, 586 - 593

[7] DRAPER Norman R., YANG Younghong (Fred); Gtntralization of geometric mean functional relationship, Comput. Statist. & Data Anal. (1997), 23, 355 - 372

[8] A. Hubaux, G. Vos, Decision and detection limits for linear calibration curves, Anal. Chem. (1970), 42, 8, 849 - 855

[9] Rousseeuw Peter J., Croux Christope, Alternatives to the median absolute deviation, JASA 88, (1993), 424, 1273 - 1283

[10] Gopal K. Kanji, Statistical tests, Sage publications, (1993)

[11] MicroVal Rules and Certification Scheme (1998), published by the VicroVal secretariat NEN, Nederlands Normalie - satie-instituut (NEN) Vlinderweg 6 P.O. Box 5059, 2600 GB Delft< Netherlands

[12] Langton, SD, Chevennement, R., Nagelkerke, N., and Lombard, B: Analizing cjllaborative trials for qualitative microbiological methods: accordance and concordance, International Journal of Food Microbiology (in press)