Приложение С (справочное). Исследование гемолитических свойств медицинских изделий и их компонентов

Приложение С
(справочное)

Исследование гемолитических свойств медицинских изделий и их компонентов

С.1 Общие положения

Существует обширная литература, описывающая взаимодействие материал/кровь. Однако существует лишь несколько достаточно надежных и воспроизводимых методов тестирования, позволяющих предсказать поведение исследуемого материала при его клиническом применении. В настоящем приложении приведен обзор известных методов тестирования гемолитической активности и обсуждены факторы, имеющие отношение к их способности охарактеризовать медицинские и стоматологические изделия.

С.2 Термины и определения

В настоящем приложении применены следующие термины с соответствующими определениями:

С.2.1 антикоагулянт: Агент, предотвращающий или препятствующий коагуляции [62].

Примеры - Гепарин или цитрат.

С.2.2 онкотическое давление; коллоидное осмотическое давление: Суммарное влияние белков и других высокомолекулярных компонентов на осмотическое давление плазмы [62].

С.2.3 гематокрит: Отношение объема эритроцитов к общему объему крови (индивидуально для каждого образца).

С.2.4 гемолиз: Выделение гемоглобина (Нb) из эритроцитов в результате разрушения или частичного повреждения при интактной клеточной мембране.

С.2.5 отрицательный контрольный образец: Полиэтилен высокой плотности или другой материал с подтвержденными свойствами.

Примечание - См. ISO 10993-12.

С.2.6 эритроцитарная масса: Компонент, полученный в результате центрифугирования цельной крови с последующим удалением супернатанта, состоящего из плазмы.

Примечание - Свойства эритроцитов человека для трансфузии: объем фракции эритроцитов составляет 0,65 - 0,80 объема цельной крови. Используемый образец содержит все эритроциты, большую часть лейкоцитов (примерно 2,5 - 3,0 х клеток/мл) и различное число тромбоцитов (в зависимости от метода центрифугирования).

С.2.7 отмытые эритроциты: Суспензия эритроцитов, полученная из цельной крови после удаления плазмы и отмывки в физиологическом растворе.

Примечание - Это эритроцитарная суспензия, из которой удалена большая часть плазмы, лейкоцитов и тромбоцитов. Число остаточной плазмы определяется протоколом отмывки. Использовать суспензию отмытых эритроцитов следует как можно быстрее после окончания процедуры отмывки. Хранить не дольше, чем 24 ч при 1 °С -6 °С.

С.2.8 цельная кровь: Кровь, полученная от здорового донора, содержащая цитрат или гепарин в качестве антикоагулянта.

С.3 Причины гемолиза

С.3.1 Механические силы - давление

Мембрана эритроцита полупроницаема. Разность давлений возникает, когда такая мембрана разделяет два раствора с различными концентрациями. Осмотическое давление существует, когда мембрана непроницаема для пассивного переноса растворителя. Этот перепад давления может вызывать разбухание эритроцитов и разрушение клеточной мембраны, сопровождаемое выделением свободного гемоглобина [62].

С.3.2 Механические силы - реология

Факторы, воздействующие на кровь (скорость потока, сдвиговые напряжения и другие силы), способные деформировать мембрану эритроцитов, могут вызывать разрушение их мембраны.

С.3.3 Биохимические факторы

Изменение структуры мембраны на молекулярном уровне способно изменить прочность и эластичность мембран эритроцитов. Недостаток питания или энергии (АТФ) может сопровождаться потерей дискообразной формы и микровезикуляции (microvesiculation) гемоглобина. Химические агенты, бактериальные токсины, рН и нарушения метаболизма под воздействием температуры способны подвергать опасности мембраны эритроцитов [63]. Эти факторы способствуют разрушению мембран эритроцитов при осмотических давлениях, существенно меньше ожидаемых. Может быть выполнен специальный тест, определяющий при каком осмотическом давлении разрушается мембрана эритроцита (осмотическая хрупкость).

С.4 Клиническая значимость гемолиза

С.4.1 Токсический эффект

Повышение уровня свободного гемоглобина в плазме может вызывать токсические эффекты или инициировать процессы, приводящие к поражению почек или других органов [62]. Определение концентрации свободного гемоглобина плазмы является удобным методом измерения степени повреждения эритроцитов, а также является косвенным индикатором травмы других форменных компонентов крови.

С.4.2 Тромбоз

Внутрисосудистый гемолиз сопровождается выделением фосфолипидов, способствующих тромбообразованию [66]. Значительное падение числа эритроцитов в крови в результате гемолиза приводит к анемии и снижению способности транспортировать кислород, что имеет соответствующее отрицательное воздействие на мозг и другие ткани.

С.5 Определение критериев отбора для гемолиза

Гемолиз является функцией от времени и свойств материала, таких как поверхностная энергия, морфология и химия поверхности. Гемолиз зависит также от сдвигового напряжения, взаимодействия материал/клетка, характера слоя адсорбированных белков, стабильности потока, захвата воздуха и особенностей источника крови [67], [68], [69]. При сравнении гемолитического потенциала материалов и медицинских приборов эти параметры следует тщательно контролировать. Спектр методов изучения гемолиза чрезвычайно широк: от простейших (in vitro в статике) до высокосложных (in vivo в потоке). Изучение гемолитического потенциала носит не абсолютный, но, скорее, относительный характер и определяется набором методов и стандартов, принятых в конкретной лаборатории. Методами in vitro могут быть измерены небольшие уровни гемоглобина плазмы, которые нельзя определить в условиях in vivo (например, вследствие связывания гемоглобина плазмы с гаптоглобином и быстрого удаления из крови). В качестве индикаторов in vivo гемолиза может быть применено измерение уровня лактат дегидрогеназы и гаптоглобина. Невозможно вывести универсальный критерий допустимого уровня гемоглобина, применимого для оценки любых медицинских изделий. Воздействие изделия на гемолиз может на какое-то время быть замаскировано травмой крови при хирургическом вмешательстве. Применение аппарата, провоцирующего гемолиз, может быть единственным шансом спасения жизни пациента. На практике применение многих аппаратов сопровождается гемолизом. Следовательно, если изделие провоцирует гемолиз, важно подтвердить, что изделие имеет клинические преимущества, а значение гемолиза лежит в клинически допустимых пределах.

Критерии применимости должны быть обоснованы на основе оценки критериев риска и пользы. Следующие вопросы могут быть предложены выработки таких критериев:

a) Как долго будет применяться изделие в контакте с пациентом?

b) Насколько велик гемолиз, индуцированный материалом или изделием?

c) Каково отношение рисков и преимуществ в случае применения других известных аналогичных методов лечения?

d) Каковы гемолитические свойства этих известных аналогичных методов лечения? Как ведет себя данное изделие по сравнению с другими методами лечения?

e) Насколько эффективно тестируемое изделие по сравнению с другими методами лечения? Более эффективное изделие может вызывать более высокий гемолиз, однако дополнительная эффективность может повысить пользу для пациента.

С.6 Исследование гемолиза - Общие положения

С.6.1 Методы

С.6.1.1 Общие положения

Для оценки повреждения эритроцитов использую тесты in vitro. Прямые методы определяют гемолиз, индуцированный физическим и химическим контактом с эритроцитами. Непрямые методы определяют гемолиз, вызванный контактом с экстрактами из исследуемых материалов. Стандарт ASTM F 756-00 [10] описывает тестирование гемолитических свойств материалов (в основном за счет химических факторов), но его недостаточно для тестирования медицинских изделий в целом. ASTM F 756-00 (и тесты на гемолиз, перечисленные в GB/T 16175-1996 [11]) приведены в качестве примера и возможной отправной точки при разработке протокола тестирования гемолитических свойств конкретного аппарата. Исследование гемолитических свойств отдельных материалов следует дополнить динамическими тестами аппарата в сборе для определения вклада в гемолиз его конструкции, специфики использования по назначению и гемодинамических факторов.

В простейшей форме, в случае использования для контакта с тестируемыми материалами сильно разбавленных суспензий эритроцитов, значение гемолиза часто представляют в процентах гемоглобина, выделившегося в супернатант и нормализованного на общее количество гемоглобина в пробе (за 100% принимают концентрацию гемоглобина, выделяющегося в пробу при полном разрушении всех присутствующих в ней эритроцитов). В случае тестирования медицинских изделий, для которых применение высоко разбавленных суспензий эритроцитов невозможно, гематокрит крови и другие факторы должны быть учтены при нормализации индекса гемолиза [63].

Каждая лаборатория, по меньшей мере, должна иметь возможность измерять общую концентрацию гемоглобина в крови и содержание его в плазме. Концентрация свободного гемоглобина плазмы (в норме от 0 до 10 мг/л) существенно ниже его общей концентрации в крови (в норме от 11000 до 18000 мг/л). Следовательно, для их определения в процессе тестирования должны быть задействованы разные методы.

Три аналитических метода получили наибольшее распространение при определении концентрации общего гемоглобина крови Нb [70].

Примечание - Исследователь должен учитывать, что ряд факторов может вносить искажения в результаты тестирования гемолитической активности. Химические агенты некоторых видов, содержащиеся в медицинских материалах и растворах, способны воздействовать на осмотическую стойкость эритроцитов (например, фиксирующие агенты, такие как формальдегид или глутаровыи альдегид), провоцировать осаждение эритроцитов (например, ионы меди или цинка), изменять спектры поглощения гемоглобина (например, полиэтиленгликоль или этанол) [64], [65].

С.6.1.2 Определение концентрации общего гемоглобина крови

С.6.1.2.1 Гемоглобинцианидный метод

Первый из классических методов определения концентрации общего гемоглобина крови - гемоглобинцианидный - был опубликован Международным Комитетом по Стандартизации в Гематологии (International Committee for Standardization in Haematology) [71]. Гемоглобинцианидный анализ удобен тем, что легко может быть автоматизирован и для него доступны прямые стандарты (HiCN). Метод основан на окислении гемоглобина с последующим образованием циангемоглобина, имеющего максимум поглощения при 540 нм. Детергент, используемый в качестве лизирующего агента, помимо высвобождения гемоглобина из эритроцитов снижает мутность раствора (источник помех и ошибок при фотометрировании на 540 нм) за счет преципитации белков. При использовании данного метода спектральные помехи со стороны плазмы минимальны, что позволяет сравнивать поглощение образцов плазмы непосредственно с контрольным раствором.

Широкая полоса поглощения HiCN позволяет для ручного и автоматического определения использовать не только точные спектрофотометры, но и простые фотоколориметры с фильтрами. Применение эталонных образцов позволяет добиться сопоставимости результатов, полученных при использовании данного метода в разных лабораториях. Основной недостаток метода связан с необходимостью использовать высокотоксичные растворы цианидов, способные к тому же выделять синильную кислоту в процессе кислого гидролиза. Определенные трудности и расходы связаны с утилизацией опасных отходов.

С.6.1.2.2 Оксигемоглобиновый метод

Второй из классических методов определения концентрации общего гемоглобина крови - оксигемоглобиновый - в настоящее время не находит широкого применения. Оксигемоглобиновый метод основан на образовании Нb02 в процессе обработки гидроксидом аммония и последующем спектрофотометрическом определении этого продукта. Применяют также регистрацию оксигемоглобина в разбавленном растворе карбоната натрия. Метод не имеет стабильных контрольных или стандартных образцов, что, впрочем, не столь важно, поскольку данный метод может быть использован в тех случаях, когда результат (концентрацию гемоглобина в плазме) представляют в процентах от концентрации общего гемоглобина крови. В таком случае стандартный образец (образец со 100%-ным гемолизом) готовят из забранной крови непосредственно перед измерением.

С.6.1.2.3 Железный метод

Третий из классических методов определения концентрации общего гемоглобина крови основан на определении концентрации ионов железа, выделенных из гемоглобина крови взаимодействием с кислотой или озолением. Полученные препараты титруют или обрабатывают специфическими агентами, взаимодействующими с железом, с последующим фотометрированием окрашенных комплексов. Данный метод слишком сложен для рутинных измерений и потому используется редко.

С.6.1.3 Измерение свободного гемоглобина плазмы

С.6.1.3.1 Прямые оптические и дополнительные химические методы

Благодаря многочисленным различным факторам (традициям, простоте применения, утилизации жидких отходов, доступности стандартов и т. д.) для определения концентрации свободного гемоглобина плазмы как индикатора гемолиза, в настоящее время применяют около 20 методов, но ни один из них не распространен широко. Все методы могут быть разделены на две большие группы:

1 Использующие регистрацию поглощения непосредственно оксигемоглобина (при 415, 541 и 577 нм) и его производных;

2 Использующие регистрацию поглощения производных гемоглобина, полученных путем химических превращений (гемоглобин реагирует с бензидин-подобными хромогенами и перекисью водорода, или из него формируют циангемоглобин) [72].

Анализы всех видов могут быть выполнены как в ручном режиме, так и автоматически.

Популярный метод измерения концентрации гемоглобина основан на его катализирующем эффекте при окислении производных бензидина, например, окислении тетраметилбензидина преркисью водорода. Скорость образования окрашенного продукта (определяется фотометрически при 600 нм) прямо пропорциональна концентрации гемоглобина. К преимуществам этого метода можно отнести простоту автоматизации с привлечением коммерчески доступной аппаратуры, отсутствие высокотоксичных и экологически опасных реагентов или отходов (синильная кислота и ее производные), доступность стандартных образцов гемоглобина, откалиброванных против стандартных образцов HiCN. Нижний предел чувствительности метода (5 мг/л) сравним с таковым для гемоглобинцианидного метода [70]. Основным недостатком этого метода является использование потенциально опасных для здоровья производных бензидина, а также высокие расходы на утилизацию реагентов и продуктов. Более того, диапазон регистрируемых концентраций недостаточно широк (от 5 до 50 мг/л) [73], и в исследуемом образце может присутствовать ряд агентов, способных ингибировать (до 40%) [74] реакцию окисления под действием перекиси: антикоагулянты, комплексообразующие с кальцием (цитраты, оксалаты, ЭДТА) [73], альбумин [75] или другие неспецифические компоненты плазмы [74].

Таким образом, прямые оптические методы, такие как методы Harboe [76], Cripps [77] или Taulier [78] с сравнимой чувствительностью и воспроизводимостью, могут быть заменены. Однако, как уже было отмечено выше, химические превращения гемоглобина и вызванные ими изменения его спектра могут искажать результаты в пробах на определение гемоглобина. Более того, необходимо вводить поправки, компенсирующие фоновую составляющую плазмы крови, способную влиять на вид спектра поглощения гемоглобина [72]. Исследователи должны хорошо понимать существование ограничений методов определения гемоглобина и осведомляться об их наличии при использовании конкретной методики [64], [65], [72], [75]. Это включает в себя и исследование супернатанта на предмет присутствия осадков и его спектра (с 400 до 700 нм) со спектром чистого гемоглобина.

С.6.1.3.2 Иммунонефелометрический метод

Иммунонефелометрический метод основан на регистрации гемоглобина плазмы методом нефелометрии с использованием коммерчески доступных антител. Этот метод пригоден для проведения рутинных работ. Он хорошо кореллирует и сопоставим с данными, полученными в случае применения оптических методов [79].

С.6.2 Консервация крови и ее компонентов

В этом разделе освещены лучшие способы сохранения крови и ее компонентов, рекомендованные Американской Ассоциации Банков Крови [80] и Совета Европы [81]. В целом, материалы и изделия следует тестировать с использованием крови, с химическими кондициями, имитирующими те, в которых изделие будет эксплуатироваться в клинике (выбор соответствующего антикоагулянта; минимальное использование консервантов; значения рН, соответствующие физиологическим [63]).

Растворы антикоагулянтов были разработаны для того, чтобы предотвращать свертывание крови при ее заборе, что позволят сохранять эритроциты в течение определенного времени. Все эти растворы содержат цитрат натрия, лимонную кислоту и глюкозу. Некоторые растворы дополнительно содержат аденин, гуанозин, маннитол, сахарозу, сорбитол и/или фосфаты [82], [83], [84], [85], [86], [87]. Хотя гепарин не используют для сохранения крови, его часто применяют в качестве антикоагулянта в клинике для пациентов, подвергаемых воздействию медицинских аппаратов и изделий.

Свертывание крови предотвращается за счет связывания цитратом ионов кальция. Во время хранения эритроциты метаболизируют глюкозу. Две молекулы аденозинтрифосфата (АТФ) генерируются фосфорилированием аденозиндифосфата (АДФ) на каждую молекулу глюкозы, метаболизированную в анаэробном цикле гликолиза Эмбдена-Мейерхофа. Молекулы АТФ поддерживают энергетические потребности эритроцитов по поддержке упругости мембран и определенных функций мембранного транспорта. Превращение АТФ в АДФ сопровождается выделением энергии, необходимой для поддержки этих функций. Для продления времени хранения раствор антикоагулянта должен быть подкислен, что обеспечивает достаточно высокую концентрацию ионов водорода в начальные моменты хранения при 4 °С. Повышение кислотности во время хранения снижает интенсивность гликолиза. Аденозиновые нуклеотиды (АТФ, АДФ, АМФ) истощаются во время хранения, поэтому введение аденозина в раствор антикоагулянта позволяет синтезировать замену АМФ, АДФ и АТФ.

В процессе приготовления эритроцитарного концентрата значительные части глюкозы и аденина удаляются вместе с плазмой. Достаточная жизнеспособность эритроцитов после удаления плазмы может быть достигнута в случае, если клетки излишне не концентрированны. Нормальный цитрат фосфат декстрозный (ЦФД)-аденин концентрат эритроцитов должен иметь объем фракции эритроцитов не выше 0,8. Даже если удалить 90% плазмы, жизнестойкость эритроцитов может быть поддержана введением добавок или суспензионных сред. Хлорид натрия, аденин и глюкоза необходимы для жизнестойкости, в то время как аденин и глюкоза могут быть применены для дальнейшей стабилизации клеточных мембран и предотвращения гемолиза [80].

Пригодность контейнеров для хранения продуктов крови оценивают различными методами, измеряющими качество продуктов крови [70], [83]. Контейнер с продуктами крови, содержащими подходящий антикоагулянт, хранят при температуре от 1 °С до 6 °С в статике. Через определенные промежутки времени определяют концентрацию свободного гемоглобина плазмы, чтобы определить жизнеспособность и качество сохраняемого продукта. Качество сохраняемого продукта может быть повышено аккуратным перемешиванием один раз в неделю. Оценку хранения в контейнере косвенно определяют по выделению из контейнера двуокиси углерода, генерируемой эритроцитами в процессе жизнедеятельности в отсутствии факторов перемешивания.

С.6.3 Защита персонала при работе с кровью

Для защиты персонала, получающего, транспортирующего и работающего с потенциально инфицированной кровью человека, необходимо наличие письменных инструкций. Потенциально инфицированные материалы включают в себя кровь и другие продукты и жидкости организма, оборудование, контактирующее (или потенциально способное контактировать) с кровью и другими жидкостями организма, а также материалы, используемые при культивировании организмов, вызывающих переносимые с кровью инфекции [88].

С.6.4 Забор крови (флеботомия)

Поскольку при заборе крови невозможно гарантировать 100%-ную стерильность поверхности кожи, должна существовать строгая, стандартизованная процедура подготовки рабочей области для флеботомии. Прежде чем начать пункцию вены, особенно важно убедиться, что раствор антисептика, нанесенный на поверхность кожи, полностью высох и никаких посторонних контактов с кожей не было допущено до момента установки иглы для забора [80].

Для предотвращения осеменения крови микроорганизмами лучше всего подходит забор в контейнер закрытого типа, не содержащий воздуха. Отверстие от иглы, остающееся после прокола изолирующей резиновой пробки флакона для образцов, должно быть тщательно закрыто, иначе частичный вакуум, создающийся в результате остывания образца крови, может привести к втягиванию загрязненного воздуха в контейнер [80].

С.6.5 Выбор источника эритроцитов

В идеальном случае тестирование гемолиза следует проводить с использованием эритроцитов человека. Однако в ряде случаев такой выбор может быть затруднен или даже невозможен. В некоторых странах источники крови человека ограничены, и запасы консервированной крови могут быть использованы исключительно для трансфузии человеку. Критерии здоровья доноров (человека или животных) также должны быть вопросом, подлежащим обсуждению. Любая кровь, независимо от источника ее получения, имеет ограниченное время хранения, поэтому своевременное получение именно крови человека может доставлять определенные трудности. В случае использования эритроцитов животного, особое внимание следует уделить получению 100% контрольного раствора (полностью лизированные клетки), поскольку стабильность мембраны эритроцитов варьирует между различными видами животных. Отрицательный контрольный образец должен вызывать минимальный гемолиз, чтобы не маскировать гемолитическую активность исследуемого материала. Эритроциты кролика имеют гемолитические свойства, схожие с эритроцитами человека; эритроциты обезьяны - более, а гвинейской свиньи - менее чувствительны, по сравнению с эритроцитами человека [89].

С.6.6 Определение гемолиза - воздействие на кровь или ее компоненты in vitro, ex vivo и in vivo

Гемолиз может быть зарегистрирован после воздействия на исследуемый материал крови или ее компоненты в условиях in vitro, ex vivo и in vivo. Ex vivo и in vivo условия используют при изучении изделий, содержащих несколько различных материалов.

Допускается ex vivo и in vivo оценка на животных моделях или в процессе клинических испытаний. В первом случае тестируемое изделие сравнивают с контрольным образцом, обладающим допустимым уровнем гемолитической активности. Во втором случае исследуемый объект оценивают по клинически значимым последствиям гемолиза.

Цель ex vivo или in vivo тестов - охарактеризовать гемолитический потенциал медицинского изделия. Предварительные исследования могут проводиться и in vitro с применением как свежей, так и просроченной крови человека, а также крови животных. Для медицинских изделий, предназначенных для использования ex vivo, общепринятым методом является организация рециркуляции крови через изделие в условиях, имитирующих соответствующее клиническое применение. В дальнейшем некоторые изделия дополнительно изучают моделированием ex vivo на животной модели, а для ограниченного круга изделий - контрольными изучениями на людях. Размеры медицинского изделия и его назначение влияют на планирование этих исследований.

С.6.7 Прямой или непрямой контакт

Предлагаемые условия экстракции описаны в ISO 10993-12. Некоторые методы предусматривают прямой контакт изделия с эритроцитами, в то время как в других описано приготовление экстрактов, которые затем приводят в контакт с эритроцитами. Выбор метода должен базироваться на назначении изделия и условиях его применения. Граничные условия следует принимать во внимание, если используются повышенные температуры, условия подготовки экстрактов изложены в ISO 10993-12.