Приложение В (справочное). Лабораторные методы: принципы, научное обоснование и интерпретация

Приложение В
(справочное)

Лабораторные методы: принципы, научное обоснование и интерпретация

В.1 Основные положения

B.1.1 Обоснование

В настоящем приложении рассматривают принципы и научное обоснование методов исследования, изложенных в 6.2.1. Подробное описание этих методов можно найти в стандартах по лабораторной медицинской практике и клинической патологии. В ссылках [17] - [44], [46] - [49] и [59] рассматривают методы исследования, которые могут быть полезны для оценки изделий, взаимодействующих с кровью. Из-за биологического разнообразия и технических ограничений точность многих из этих методов недостаточно высока. По возможности, чтобы определить значимость результатов, исследования повторяют несколько раз.

B.1.2 Принципы in vitro тестирования

Используют статические и динамические системы, например, циркуляцию по замкнутому кругу и системы на основе центрифугирования [50], [54].

B.1.3 Условия проведения тестирования

Для того чтобы исследования достигали цели и оценка взаимодействия изделия с кровью была адекватной, содержащую антикоагулянт кровь или плазму здорового человека или экспериментального животного инкубируют в контакте с материалом или изделием. Воздействие должно происходить в стандартизированных условиях, моделирующих условия применения в медицинской практике, в том числе длительность взаимодействия, температуру и характеристики кровотока. Аликвоту крови или плазмы исследуют сразу после контакта с материалом или изделием.

Выбор условий зависит от того, какое изделие или материал исследуют, а также от назначения данного изделия.

При подготовке образцов для тестирования особенно важно избегать активации или выделения в объем крови любых компонентов до начала тестирования. Однако, подходящие условия зависят от тестируемого изделия или материала и определяются условиями его эксплуатации.

В.1.4 Во время исследования изделий, контактирующих извне, и имплантируемых изделий в условиях, в которых их применяют, кровь собирают в антикоагулянт, а исследование проводят, как описано, без предварительной стадии воздействия. Тесты разделены на пять категорий согласно 6.2.1 в соответствии с процессом или системой, которые исследуют: тромбоз, коагуляцию, клетки крови и их функции, гематологию и активацию системы комплемента.

В.2 Тромбоз

B.2.1 Процентное выражение окклюзии

После того как изделие использовали и извлекли, оценку окклюзии осуществляют визуально и оценивают в процентах. Определяют степень тромбообразования в проводящем пути. Отсутствие видимой окклюзии необязательно означает отсутствие процесса тромбообразования, поскольку тромб со времени его образования может изменить свое местонахождение к тому моменту, когда оценивают процент окклюзии. Причиной закупорки сосуда может быть не только тромбоз, но и гиперплазия интимы, особенно в местах соединения протеза с сосудом. Для определения природы окклюзии проводят микроскопическое исследование. Определение площади поверхности, покрытой тромбами и свободной от них, - полуколичественный тест, и может быть использован на основе сравнения.

B.2.2 Уменьшение кровотока

Параметры кровотока (скорость или объем) измеряют после одного применения. Измерение можно проводить во время, перед или после применения. Пояснение и интерпретацию результатов проводят в соответствии с В.2.1.

B.2.3 Гравиметрический анализ (определение массы тромбов)

Массу тромбов измеряют после удаления изделия. Пояснение и интерпретацию результатов проводят в соответствии с В.2.1.

B.2.4 Световая микроскопия

С помощью этой методики можно получить информацию о плотности клеток, клеточной агрегации, фибрине, отложившемся на материале, а также о месте расположения этих отложений на материалах или изделии. Метод является полукачественным.

B.2.5 Перепад давления в изделии

Этот показатель измеряют до и после применения. Пояснение и интерпретацию результатов проводят в соответствии с В.2.1.

B.2.6 Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

Пояснение и интерпретацию проводят в соответствии с В.2.4. Этот метод имеет преимущество перед световой микроскопией (см. В.2.4), так как дает более подробную информацию относительно тонкой структуры изучаемых компонентов. Выводы о количественных характеристиках требуют достаточного числа повторных определений, что позволило бы установить степень воспроизводимости результатов.

B.2.7 Связывание антител

Вслед за качественной оценкой отложений фибрина и тромбоцитов с использованием микроскопа возможно проведение количественных определений этих параметров с использованием антител, специфических к фибриногену и рецепторам мембран тромбоцитов. Для удаления компонентов крови, слабо связанных с поверхностью, исследуемые образцы перед взаимодействием с антителами следует тщательно промыть.

B.2.8 Исследование трансплантированного при аутопсии

Метод имеет важное значение для оценки биологической реакции организма на имплантированное изделие. Распределение, размеры и микроскопическую природу клеточных отложений можно наилучшим образом определить при патологоанатомическом исследовании. Некоторые предлагаемые процедуры опубликованы [40], [41].

B.2.9 Исследование дистальных органов при аутопсии

Цель исследования - изучение влияния имплантированных изделий на дистальные органы. Среди возможных эффектов - тромбоэмболия, инфекция и закупорка изделия.

B.2.10 Ангиография, внутрисосудистый ультразвук, Допплеровский ультразвук, сцинтилляционная томография, магниторезонансная томография

Один или комбинация из данных методов может быть применен для определения наличия просвета или степени сужения сосудистого протеза или другого канала, а также для определения тромбообразования на стенках изделия во время их функционирования in vivo.

В.3 Коагуляция

Коагуляционные методы основаны на использовании нативной (свежей, без антикоагулянтов) цельной крови, цельной крови с антикоагулянтами (обычно - цитратной), плазмы, обогащенной тромбоцитами, и бестромбоцитарной плазмы.

Так как большинство стандартных коагуляционных тест-наборов предназначены для обнаружения нарушений в функционировании системы свертывания, что приводит к замедлению свертывания или повышенной кровопотере, протоколы исследования взаимодействия изделие/кровь должны быть изменены так, чтобы подходить для регистрации ускорения тромбообразования, индуцированного контактом с биоматериалами. Тесты, основанные на активированном частичном тромбопластине, включают в себя такие активаторы, как каолин, целит или элагровую кислоту. Тест-комбинаций, содержащих такого рода активаторы, следует избегать, поскольку их применение маскирует ускорение коагуляции, вызванное контактом с материалом или изделием.

Кровь инкубируют с исследуемым материалом как в статических условиях (ячейка с параллельными пластинами), так и в системе с замкнутой циркуляцией, где исследуемым материалом является внутренняя поверхность трубок. После определенного времени инкубации проводят тестирование как поверхности, так и крови [54].

B.3.1 Частичное тромбопластиновое время (ЧТВ)

Частичное тромбопластиновое время [38] - это время образования сгустка в рекальцифицированной цитратной плазме при добавлении частичного тромбопластина. Частичный тромбопластин - фосфолипидная взвесь, которую обычно экстрагируют из тканевого тромбопластина, гомогената мозга или легкого млекопитающих. Сокращение ЧТВ, возникающее при контакте с материалами в условиях применения в медицинской практике, указывает на гиперкоагуляцию, и его рассматривают как фактор опасности тромбозов. Удлинение ЧТВ предполагает дефицит каких-либо факторов свертывания крови (за исключением факторов VII и XIII): I (фибриноген), II (протромбин), V, VIII, IX, X, XI или XII.

Гепарин и другие антикоагулянты также увеличивают ЧТВ.

В продаже имеется набор реактивов для определения частичного тромбопластинового времени, в который входят различные активные вещества, такие как коалин или целит. Тест-набор, в котором используют эти реактивы, называется "Тест активированного парциального (частичного) тромбопластинового времени" (АЧТВ). Тест не применим для оценки взаимодействия между кровью и изделием in vitro, поскольку активирующие вещества маскируют активацию, вызванную изделием или входящими в его состав материалами.

B.3.2 Протромбиновое время (ПВ)

Этот тест основан на том, что в тщательно измеренном объеме плазмы крови имеется оптимальная концентрация ионов кальция и избыток тромбопластина, и переменные величины - концентрация протромбина и дополнительные факторы [38]. Не рекомендуется использовать оксалат в качестве антикоагулянта, поскольку фактор V менее стабилен в этом растворе, что приводит к увеличению протромбинового времени. Этот тест позволяет определять протромбин и дополнительные факторы. В присутствии тканевого тромбопластина время образования сгустка зависит от концентрации протромбина, факторов V, VII и X (при условии, что фибриноген, фибринолитическая и антикоагулирующая активность в норме). Увеличение протромбинового времени обычно указывает на дефицит протромбина или факторов V, VII, X или фибриногена.

Этот тест имеет значение только для оценки имплантируемых изделий.

B.3.3 Тромбиновое время (ТВ)

Тромбиновое время [38] - время свертывания плазмы при добавлении раствора тромбина со стандартной активностью. Тромбиновое время увеличивается при дефиците фибриногена (ниже 100 мг/л), при аномалиях в молекуле фибриногена и при повышении уровней продуктов деструкции фибриногена и фибрина (ПДФ) или гепарина. Обычно тест проводят для оценки имплантируемых изделий.

B.3.4 Генерация тромбина

При взаимодействии с материалами интактная система свертывания в присутствии фосфолипидов (См. В.3.1.) генерирует тромбин, который может быть количественно измерен по конверсии хромогенного субстрата. Данный метод имеет гораздо более низкий разброс результатов по сравнению с обычными коагуляционными тестами.

B.3.5 Фибриноген

Дисфибриногенемия, афибриногенемия и гипофибриногенемия вызывают увеличение ЧТВ, ПВ и ТВ [21]. Скрининговый тест ТВ наиболее чувствителен к дефициту фибриногена. Если требуется точный показатель фибриногена, рекомендуется модифицированный тест ТВ "Рептилазовое время", тест-набор которого также имеется в продаже.

Тест имеет значение только для оценки имплантируемых изделий.

B.3.6 Продукты деструкции фибриногена и фибрина (ПДФ) Нормальное растворение фибрина происходит с образованием X, Y, С, D и Е фрагментов в концентрации менее 2 мкг/мл плазмы. Нормальный низкий уровень ПДФ достигается при низкой скорости реакции расщепления и высокой скорости выхода ПДФ в кровь. Патологическая деструкция фибриногена и фибрина, результат повышенной активности плазминогена, дает ПДФ в концентрации от 2 до 40 мкг/мл и более. Тест имеет значение лишь для оценки имплантируемых изделий. Рекомендуется использование коммерчески доступных методов [51], [52].

B.3.7 Исследование специфических факторов свертывания крови

Значительное снижение содержания факторов свертывания крови (например, менее 50% нормального или контрольного уровня), возникающее в результате воздействия материала или изделия в условиях применения в медицинской практике, предполагает ускоренный расход этих факторов в процессе абсорбции, коагуляции или в процессе других механизмов.

B.3.8 FPA, D-димер, , ТАТ

Повышение уровня ФПА, D-димеров или является показателем активности механизмов свертывания крови. Увеличение концентрации ТАТ указывает на усиление процесса свертывания крови и формирование комплекса между генерируемым тромбином и циркулирующим антитромбином. D-димер - продукт деградации разлагаемого плазмином полимеризованного фибрина (фактора XIII). Рекомендуется использование твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и радиоиммуноанализа (RIA).

В.4 Тромбоциты и их функции

Особенно важно избегать активации тромбоцитов в процессе приготовления суспензии клеток.

В.4.1 Подсчет числа тромбоцитов

Подсчет числа тромбоцитов является очень важным из-за их ключевой роли в предотвращении возможного кровотечения [21], [49], [59]. Значительное снижение числа тромбоцитов в крови, подверженной воздействию изделия, может быть вызвано процессами объемной и поверхностной агрегации клеток, их депонированием (например, в селезенку) или коагуляцией крови на материалах или изделиях. Уменьшение числа тромбоцитов во время функционирования имплантируемого изделия может быть вызвано ускоренным разрушением или удалением тромбоцитов из системы кровообращения. Подсчет числа тромбоцитов проводят в среде для суспендирования на основе ЭДТА.

Техника забора крови должна быть воспроизводимой. Агрегатометрия является тестом, подтверждающим нормальную реактивность тромбоцитов. Манипуляции с кровью, сопровождающиеся снижением активности тромбоцитов, могут быть легко обнаружены агрегатометрией. Однако под воздействием разнообразных условий, включая неправильный забор крови, тромбоциты способны переходить в гиперактивное состояние, которое плохо определяется с применением агрегометра. Агрегационные тесты следует модифицировать (подбором концентрации тромбоцитов и агрегирующих агентов) так, чтобы модифицированные методы способны были регистрировать гиперактивность тромбоцитов, в том числе проявившуюся в результате контакта с материалами или изделиями.

B.4.1.1 Подсчет тромбоцитов вручную

В некоторых клинических лабораториях подсчет тромбоцитов проводят вручную, несмотря на доступность приборов для подсчета тромбоцитов, обладающих высокой точностью (В.4.1.2).

B.4.1.2 Автоматизированный счет тромбоцитов в цельной крови и в тромбоцитарной плазме

Автоматизированный подсчет тромбоцитов можно проводить либо в хорошо перемешанной цельной крови, либо в тромбоцитарной плазме. Использование цельной крови предпочтительнее, так как использование тромбоцитарной плазмы дает менее точные результаты. Автоматизированный подсчет тромбоцитов проводят на большем числе клеток, чем при подсчете вручную. Следовательно, разброс для автоматизированного счета может составлять всего 4%, в то время как наилучший достижимый показатель для подсчета вручную составляет 11%. Большинство приборов обладают способностью отличать тромбоциты от мелких частиц небиологического происхождения, что исключает необходимость визуально распознавать и дифференцировать осколки тромбоцитов.

В.4.2 Агрегация тромбоцитов

Агрегацию тромбоцитов [38] вызывает добавление к тромбоцитарной плазме при постоянном перемешивании агрегирующих агентов (например, АДФ, эпинефрин, коллаген, тромбин и др.). По мере того, как происходит агрегация тромбоцитов, плазма становится все светлее. Оптическую систему применяют для определения изменения трансмиссии света, а регистрирующее устройство графически изображает изменение трансмиссии света, начиная с базовой установки (на значение "0"). Замедленная или слабая агрегация тромбоцитов может быть вызвана активацией тромбоцитов и высвобождением содержащихся гранул, увеличением показателя ПДФ или определенными лекарственными препаратами (например, аспирином, нестероидными противовоспалительными средствами). Важно учитывать, что у некоторых животных агрегация тромбоцитов может варьировать или отсутствовать, когда используют отдельные агенты. Спонтанная агрегация тромбоцитов, происходящая в отсутствие ее индукторов, является патологическим процессом, указывающим на активацию тромбоцитов. Агрегация тромбоцитов может быть зарегистрирована автоматически с использованием метода WU/HOAK [52].

B.4.3 Адгезивность клеток крови

Адгезивность клеток крови [34] - один из показателей совместимости материала с кровью. Чем меньше адгезированных клеток крови, тем более совместимы поверхность материала и кровь.

Разработаны различные методы измерения адгезивности клеток на поверхности, например, К-счет Куники (Kuniki K-score) [53]. Большинство этих методов основано на следующем наблюдении: определенная часть тромбоцитов удаляется из нормальной цельной крови в результате прохождения через колонку со стеклянными шариками в условиях контролируемого потока и давления. Этот принцип был применен для качественной оценки адгезии других клеток крови на полимеры, которыми покрыты стеклянные шарики. Благодаря применению этого метода, был сделан вывод [34], что адгезия периферических лимфоцитов и полиморфонуклеарных лейкоцитов (PMNs) собак на стеклянные шарики, покрытые полигидроксиэтилметакрилатом (рНЕМА), ниже, чем на стеклянные шарики, покрытые полистиролом и некоторыми другими полимерами. В этом исследовании использовали изолированные лимфоциты и PMNs.

В качестве альтернативного метода можно предложить подсчет числа тромбоцитов, адгезированных на исследуемую поверхность. Вслед за воздействием крови в условиях применения в медицинской практике исследуемую поверхность промывают, чтобы удалить неадгезированные клетки, высушивают и готовят к световой или к сканирующей электронной микроскопии. Подсчитывают число адгезированных тромбоцитов на единицу площади и отмечают их морфологические особенности (общее число тромбоцитов и число агрегатов тромбоцитов). Можно также использовать тромбоциты, меченые изотопами хрома и индия 111[33], [55], [56].

B.4.4 Активация тромбоцитов

Использование определенных материалов и изделий может вызывать активацию тромбоцитов, которая сопровождается:

a) высвобождением из внутриклеточных гранул ряда веществ (ТФ-4, -TG, серотонина и др.);

b) изменением морфологии тромбоцитов;

c) образованием микроагрегатов тромбоцитов.

Активированный тромбоцит протромбогенен. Активация тромбоцитов может быть оценена с помощью микроскопических (световая и электронная) методов, поточной цитометрией (определение наличия микроагрегатов), регистрацией уровня ТФ-4 и -TG, выделения Р-селектина (GMP-140) или активированных гликопротеинов (GP lb и GP llb/llla) с использованием моноклонильных антител. Различные эпитопы активированных тромбоцитов могут быть оценены с использованием двух или более антител (например, одно - к GP lb или GP llb/llla, а другое - к Р-селектину), регистрация с помощью поточной цитометрии [60].

B.4.5 Время кровотечения

Коммерческая доступность стерильного одноразового устройства, предназначенного для проведения разреза кожи стандартных глубины и длины в стандартных условиях, значительно повысила воспроизводимость и ценность этого испытания. Увеличение времени кровотечения указывает на сниженную функцию тромбоцитов или уменьшение числа тромбоцитов, которое может быть определено по В.4.1. Увеличение времени кровотечения при нормальным числе тромбоцитов наблюдается при взаимодействии с некоторыми внешними присоединяемыми устройствами кратковременного действия (например при экстракорпоральном кровообращении) [31]. Испытание может быть проведено на некоторых видах подопытных животных. Измерение времени кровотечения применимо в условиях in vitro.

B.4.6 Анализ функциональных свойств тромбоцитов

Принцип классического стандартного времени кровотечения был использован для автоматизированного анализа. Цельную кровь прокачивают через коллагеновый фильтр с диаметром апертуры (отверстия в измерительной ячейке) в 150 микрон. Тромбоциты адгезируют и агрегируют до тех пор, пока они не закроют просвет апертуры. Давление крови и температуры фиксированы, присутствие антикоагулянтов не влияет на результаты теста. Тест применим для крови животных.

B.4.7 Гамма-излучение тромбоцитов, меченных радиоизотопами

Высокая эмиссия гамма-излучения, свойственная 111, позволяет использовать его для этой цели [23], [30]. Этот метод дает возможность определения локализации тромбоцитов на поверхности изделия и проведения их количественной оценки. Метод используют для оценки изделий, контактирующих извне также хорошо, как и имплантируемые изделия.

В.4.8 Период жизни тромбоцитов (выживание тромбоцитов)

Тромбоциты получают из крови пациентов и метят или [23], [24], [32], [57]. Оба эти изотопа метят тромбоциты всех возрастов, присутствующие в образце, не вымываются в больших количествах из тромбоцитов, не захватываются другими клетками и не используются вновь во время тромбопоэза. 111 обладают преимуществом, поскольку является хорошим источником гамма-излучения. При этом требуется меньшее число меченых тромбоцитов, и появляется возможность одновременного определения локализации тромбоцитов на поверхности и изучения их выживаемости. Снижение выживаемости тромбоцитов указывает на ускоренное удаление тромбоцитов из системы кровообращения в результате иммунного, тромбообразовательного и других процессов.

B.5 Гематология

B.5.1 Число лейкоцитов и дифференциальный подсчет лейкоцитов

Активацию лейкоцитов можно регистрировать с помощью световой микроскопии поверхности изделия, поточной цитометрии, по увеличению уровней маркеров, например, Л-селектина (L-selectin) и CD11b, а также в сдвиге лейкоцитарной формулы.

B.5.2 Гемолиз

Гемолиз является наиболее важным скриннинг-тестом, потому что высокий уровень гемоглобина в плазме, являющийся показателем гемолиза, отражает реакцию лизиса эритроцитов при контакте с материалами и изделиями (см. приложение С).

B.5.3 Подсчет ретикулоцитов

Повышенное число ретикулоцитов - показатель усиленного образования эритроцитов в костном мозге. Это может быть реакцией на уменьшение числа эритроцитов в крови в результате хронической кровопотери (скрытого кровотечения), гемолиза и ряда других причин [61].

B.6 Система комплемента - СН 50, С3а, С5а, ТСС, Bb, iC3b, C4d, SC5b-9

Снижение показателя СН 50 является индикатором расхода общего комплемента.

Недостатком регистрации in vitro продуктов расщепления комплемента является их высокий базовый уровень в плазме крови, а также видоспецифичность метода. Классический СН 50 метод применим для сыворотки крови человека, теленка, свиньи и кролика.

Другим функциональным методом определения in vitro активации системы комплемента является регистрация генерации С3 - или С5-конвертазы комплемента (по конвертации субстрата).

Об активации системы комплемента см. ASTM F1984-99 и ASTM F2065-00 [13], [14].