Приложение В (справочное). Дополнительные методы исследования раздражающего действия

Приложение В
(справочное)

Дополнительные методы
исследования раздражающего действия

B.1 Общие положения

Следующие специальные методы нужно считать дополнительными к базовым исследованиям, они не заменяют основные. Если эти методы применяют, то необходимо объяснить их выбор. Они рекомендуются для меди цинских изделий, имеющих соответствующее специфическое применение.

B.2 Внутрикожная реакция

B.2.1 Принцип метода

Исследование проводят для определения потенциальной возможности материала оказывать раздражающий эффект после внутрикожной инъекции экстракта из материала.

B.2.2 Исключение из исследования

Материал, вызывающий раздражение кожи, глаз или слизистой, или материал, значение рН которого меньше или равно 2 или больше или равно 11,5, внутрикожным исследованиям не подвергают.

B.2.3 Исследуемый материал

Испытуемый образец должен быть экстрактом, приготовленным в соответствии с приложением А. Большое число участков на каждом животном может быть подготовлено вместе с соответствующим отрицательным контролем или контролем растворителя.

B.2.4 Экспериментальные животные и их содержание

Используют молодых здоровых половозрелых кроликов-альбиносов любого пола, одной линии, массой не менее 2 кг.

Акклиматизацию и содержание животных осуществляют в соответствии с ISO 10993-2.

Для предварительной оценки исследуемого материала в опытную и контрольную группы берут по две особи.

При неудовлетворительных или сомнительных результатах, полученных при предварительной оценке, про водят дополнительные исследования.

B.2.5 Процедура исследований

За 4 - 18 ч до начала исследования, подстригают мех на спинах животных, оставляя достаточное расстояние с обеих сторон позвоночного столба для инъекции экстрактов.

Вводят внутрикожно 0,2 мл экстракта, полученного с полярным растворителем на пяти участках на одной стороне каждого кролика (см. рисунок В.1). Используют иглу для внутрикожных инъекций наименьшего диаметра, соответствующего вязкости исследуемого материала.

Точно также вводят 0,2 мл контроля полярного растворителя на следующих пяти участках, на том же самом боку каждого кролика (см. рисунок В.1).

Повторяют все процедуры для экстрактов, полученных с неполярным растворителем и контролем неполярного растворителя на другом боку каждого кролика (см. рисунок В.1).

Если используют другие растворители, повторяют вышеупомянутые процедуры для экстрактов, полученных с другими растворителями и контрольными группами растворителей.

B.2.6 Обследование животных

Отмечают состояние мест инъекции непосредственно сразу, через 24, 48 и 72 ч после введения.

Оценивают степень тканевой реакции, включая эритему и отек, в соответствии с классификацией, представленной в таблице В.1, для каждого места инъекции и каждого интервала времени наблюдения и регистрируют результаты.

Примечание - Внутрикожная инъекция масла часто вызывает воспалительную реакцию.

Внутривенное введение соответствующих витальных красителей, таких как трипановый синий или Evans blue, сделанное перед последним обследованием животных (72 ч после инъекции), позволяет лучше оценить реакцию на внутрикожное введение вещества, окрашивая места возникшего раздражения.

Для оценки, по возможности, применяют методы, наименее травмирующие животных.

"Рисунок В.1 - Расположение участков инъекции"

Таблица В.1 - Система оценки внутрикожных (интрадермальных) реакций"

Реакция	Оценка в баллах
Эритема и образование струпа
Отсутствие эритемы	0
Очень слабая эритема (едва заметная)	1
Хорошо различимая эритема	2
Умеренная эритема	3
Резко выраженная эритема (темно-красная) с образованием струпа	4
Образование отека
Отсутствие отека	0
Очень слабый отек (едва заметный)	1
Хорошо различимый отек	2
Умеренный отек (выступающий над поверхностью кожи около 1 мм)	3
Резко выраженный отек (распространенный, выступающий над поверхностью кожи более чем на 1 мм)	4
Максимально возможное число баллов	8
Примечание - Другие реакции, возникшие в месте инъекции, должны быть отмечены в отчете об исследовании.

В.2.7 Оценка результатов

После 72-часовой оценки, складывают все баллы эритемы и отека для каждого испытуемого образца и контрольного раствора. Делят каждую сумму на 12 (2 животных х 3 периода оценки х 2 оцениваемые категории), чтобы определить среднее значение для каждого испытуемого образца и соответствующего контрольного раствора. Требования испытания выполнены, если разница между средним значением в опытной группе и соответствующим контролем меньше или равна 1,0.

Если в любой период наблюдения средняя реакция на испытуемый образец больше, чем средняя реакция на контроль растворителя, повторяют исследование, используя трех дополнительных кроликов. Требования испытания выполнены, если разница между средним значением в опытной группе и соответствующим контролем меньше или равна 1,0.

В.2.8 Протокол исследований

Протокол исследований должен включать:

a) описание испытуемых образцов;

b) предполагаемый способ применения материала или изделия;

c) подробное описание подготовки образцов к исследованиям;

d) описание экспериментальных животных;

e) метод инъекции;

f) описание процедуры снятия показаний;

g) ведение наблюдений и их регистрацию;

h) оценку результатов.

В.3 Исследование глазного раздражающего действия

В.3.1 Общие положения

Исследование глазного раздражающего действия проводят, только если данные по безопасности не могут быть получены другими средствами, и только для материалов, которые контактируют с глазами или веками.

Примечание - Тест-системы in vitro находятся в стадии разработки. Когда эти методы будут валидированы, их можно будет применять взамен этого in vivo метода.

B.3.2 Принцип метода

Исследование проводят для определения потенциальной возможности материала оказывать раздражающий эффект на ткани глаза.

B.3.3 Исключение из исследования

Материал и/или готовый продукт, вызывающий явную коррозию и сильное раздражение кожи не подвергают исследованию на глазах. Любой материал, вызывающий раздражение кожи, или материал, рН которого 2 или 11,5, исследованиям не подвергают и признают потенциальным раздражителем глаз.

B.3.4 Исследуемый материал

Если исследуемый материал представляет собой жидкость, закапывают 0,1 мл в нижний отдел конъюнктивального мешка глаза.

Твердый или гранулированный продукт измельчают до пылеобразного состояния и затем, слегка уплотнив, аккуратно вводят в нижний отдел конъюнктивального мешка глаза такое количество материала, которое занимает объем 0,1 мл, но не более 100 мг.

Примечание - Некоторые материалы нельзя исследовать непосредственно на слизистой глаза, так как возникают механические повреждения.

Если исследуемый материал находится в баллоне под давлением, получают некоторое количество этого вещества и вводят 0,1 мл также, как для жидких веществ. Материал в аэрозольной упаковке:

a) разбрызгивают в течение 1 с с расстояния 10 см непосредственно на поверхность открытого глаза или

b) впрыскивают в охлажденную емкость и наносят также, как жидкие продукты.

Если исследованиям подвергают экстракт из образцов, его приготавливают в соответствии с приложением А. Закапывают 0,1 мл экстракта в нижний отдел конъюнктивального мешка глаза.

В идентичных условиях готовят контроль с использованием полярных и неполярных растворителей в отсутствии испытуемого вещества.

B.3.5 Экспериментальные животные и их содержание

Используют здоровых молодых половозрелых кроликов-альбиносов одной линии, любого пола, массой от 2 до 3 кг.

Акклиматизацию и содержание животных осуществляют в соответствии с ISO 10993-2.

Для предварительной оценки исследуемого материала используют одно животное.

Если никакой реакции не ожидается, предварительная оценка может быть проведена на трех животных.

При выраженной реакции (см. таблицу В.2), полученной при предварительной оценке на одном животном, дальнейшие исследования не проводят.

Если при исследованиях твердых или жидких материалов не наблюдается выраженной реакции, далее используют не менее двух животных, а при исследовании экстрактов из материалов - не менее двух животных на каждый экстракт.

Если результаты исследований, полученные не менее чем на трех животных, сомнительны или неясны, дополнительные исследования обосновывают.

B.3.6 Процедура исследований

За 24 ч до начала испытания визуально проверяют оба глаза каждого кролика на предмет обнаружения отклонений от нормы.

Если обнаружится отклонение от нормы любого глаза, то следует взять другое животное.

При осмотре можно использовать 2%-ный раствор флуоресцеина натрия (в соответствии с Британской фармакопеей) для более четкого выявления изменений роговицы. Рекомендуется использовать офтальмоскоп, ручную щелевую лампу или другие устройства.

Вводят исследуемый материал, как указано в В.3.4, в один глаз.

После инстилляции веки соединяют и держат в таком положении в течение 1 с.

Другой глаз каждого животного служит контрольным, на нем выполняют все процедуры, используя контрольный раствор.

Если в остром эксперименте исследуемый материал не проявил выраженной реакции, допускается проведение повторных процедур с перерывом в 72 ч.

Продолжительность исследования определяют в соответствии с продолжительностью воздействия материала или изделия на организм при его применении в медицинской практике.

B.3.7 Обследование животных

Оба глаза животного, которому однократно инстиллировали исследуемый материал, осматривают через 1, 24, 48 и 72 ч после воздействия.

Если имеются стойкие изменения, проводят постоянное наблюдение (но не более 21 сут) для оценки их прогрессирования и обратимости. При обнаружении тяжелых повреждений постоянные наблюдения не проводят

Примечание - FDA требует проведения исследование контактных линз в течение 21 сут по 8 ч в день. Это требование является исключением из настоящего стандарта.

Оценивают и регистрируют любые наблюдаемые реакции в соответствии с классификацией, представлен ной в таблице В.2.

Таблица В.2 - Система оценки повреждения глаза

Реакция	Оценка в баллах
1 Роговица
Степень помутнения (площадь поражения)
Отсутствие	0
Генерализованное или диффузное помутнение, детали радужной оболочки хорошо различимы	1*
Легко различимое полупрозрачное помутнение, детали радужной оболочки замутнены	2*
Опалесцирующее помутнение, детали радужной оболочки не различимы, размер зрачка определить невозможно	3*
Помутнение светонепроницаемо, радужная оболочка не видна	4*
Площадь пораженной роговицы
Одна четверть (или менее)	0
Более одной четверти, но меньше половины	1
Более половины, но меньше трех четвертей	2
Более трех четвертей и площадь всего глаза	3
2 Радужная оболочка
Нормальная	0
Складчатость выше нормы, заметное набухание, сосуды инъецированы (один или все указанные симптомы), радужная оболочка реагирует на свет (реакция положительная)	1*
Реакция на свет отсутствует, увеличение кровоизлияний (один или все симптомы)	2*
3 Конъюнктива
Краснота (относится к конъюнктиве век и глазного яблока, исключая роговицу и радужную оболочку)
Нормальные сосуды	0
Сосуды заметно инъецированы (выше нормы)	1
Более выраженная диффузная краснота, отдельные сосуды плохо различимы	2*
Диффузная резко выраженная краснота	3*
Хемоз (отек конъюнктивы)
Отсутствие отека	0
Слегка заметный отек (включая мигательную перепонку)	1
Выраженный отек с частичным выворотом век	2*
Отек с половинным закрытием века	3*
Отек с закрытием века от половинного до полного	4*
Выделения
Отсутствие выделений	0
Незначительные выделения, отличающиеся от нормальных (не учитывать наличие выделений во внутреннем углу глаза, наблюдаемое и у контрольных животных)	1
Выделения на веках и шерсти вокруг глаз	2
Выделения на веках, шерсти вокруг глаз и значительной площади мордочки	3
* Положительный результат

Животным, которым проводят многократные инстилляции, глаза осматривают до начала процедуры, непосредственно после нее и через 1 ч после каждой процедуры.

Если наблюдается выраженное раздражение после последней процедуры, наблюдение продолжают. Наблюдение продолжают в случае изменений роговицы или других признаков раздражения глаза для оценки прогрессирования и обратимости возникших патологических процессов.

Немедленный вывод животных из эксперимента проводят с использованием гуманных методов эвтаназии в следующих случаях:

a) тяжелые поражения глаз (такие, как изъязвление или образование струпа на конъюнктиве, перфорация на роговице, скопление крови и гноя в передней камере глаза) или

b) кровотечение или нагноение или

c) серьезные изъязвления роговицы.

Животное выводят из эксперимента при обнаружении максимального, в соответствии с системой оценки (см. таблица В.2), действия:

- отсутствия светового рефлекса (степень поражения 2 радужной оболочки) или помутнения роговицы (степень 4) без видимого улучшения в течение 24 ч;

- сильного воспаления конъюнктивы (хемоз степени 4 совместно с гиперемией степени 3) без видимого улучшения через 48 ч.

В.3.8 Оценка результатов

Выявленные различия в состоянии испытуемого и контрольного глаза описывают и объясняют, используя классификацию в таблице В.2.

а) Острое воздействие

Если при воздействии исследуемого материала в подопытном глазу более чем у одного животного обнаружены патологические изменения (оценка со знаком сноски в таблице В.2), считают, что материал обладает раздражающим действием, и дальнейшие исследования не проводят.

Если патологические изменения выявлены в подопытном глазу только одного из трех кроликов или при сомнительных результатах, исследования продолжают

Если при продолжении воздействия патологические изменения на опытных глазах (оценка со знаком сноски в таблице В.2) обнаруживаются более чем у половины кроликов на любой стадии обследования, считают, что материал обладает раздражающим действием.

При тяжелом поражении глаза даже у одного животного материал признают раздражителем.

b) Повторное воздействие

Если при повторном воздействии на глаз более чем у половины животных исследуемой группы возникают патологические изменения (оценка со знаком сноски в таблице В.2) на любой стадии обследования, признают ис следуемый материал раздражителем.

В.3.9 Протокол исследований

Протокол исследований должен содержать:

a) описание испытуемых образцов;

b) предполагаемый способ применения материала или изделия;

c) подробное описание подготовки образцов к исследованиям;

d) описание экспериментальных животных;

e) метод инъекции;

f) описание процедуры снятия показаний;

g) ведение наблюдений и их регистрации;

h) оценку результатов.

В.4 Исследование раздражающего действия на слизистую ротовой полости

B.4.1 Общие положения

Исследование раздражающего действия на слизистую ротовой полости проводят для материалов с контактом указанного вида, если данные по безопасности не могут быть получены другими средствами.

B.4.2 Принцип метода

Исследование проводят для определения потенциальной возможности материала оказывать раздражающий эффект на ткани ротовой полости.

B.4.3 Исключение из исследования

Любой материал, вызывающий раздражение кожи или глаз, или материал, значение рН которого менее или равно 2 или более или равно 11,5, исследованиям не подвергают и признают потенциальным раздражителем тканей ротовой полости.

B.4.4 Исследуемый материал

Подготовку исследуемых материалов проводят в соответствии с приложением А.

B.4.5 Экспериментальные животные и их содержание

Используют молодых здоровых половозрелых сирийских хомячков инбредной линии обоих полов.

Акклиматизацию и содержание животных осуществляют в соответствии с ISO 10993-2.

На шею каждого хомячка надевают воротник шириной 3 - 4 мм, располагающийся так, чтобы не мешать нормальному питанию и дыханию, но препятствовать выталкиванию шарика изо рта. Взвешивают животных ежедневно в течение 7 дней. Следят за массой каждого животного и, если необходимо, поправляют воротник. Если масса животного резко уменьшается, его исключают из опыта.

Для предварительной оценки исследуемого материала используют не менее трех хомячков.

Примечание - Дополнительно могут быть использованы животные, подвергаемые воздействию отрицательного контроля или контрольного раствора, при необходимости. Если результаты в предварительном испытании сомнительные, то проводят дополнительные исследования.

B.4.6 Процедура исследований

Снимают с каждого животного воротник и выворачивают защечный мешок. После промывания защечного мешка физиологическим раствором обследуют его слизистую на наличие любых изменений.

Твердые образцы в виде таблеток или шариков диаметром не более 5 мм помещают непосредственно в защечный мешок. Жидкими материалами или экстрактами пропитывают ватные шарики, регистрируют используемый при этом объем и помещают в один защечный мешок каждого животного. Вместо этого можно таким же объемом наполнить защечный мешок. Другой защечный мешок без образца является контролем. Все процедуры с контрольными животными проводят параллельно.

По необходимости снимают воротник и возвращают животных в клетку.

Продолжительность контакта с материалом зависит от реального времени воздействия изделия при применении в медицинской практике, но не должна быть менее 5 мин. После воздействия снимают воротник, удаляют ватный тампон и промывают защечный мешок физиологическим раствором, стараясь не загрязнить второй мешок.

При остром воздействии указанную процедуру повторяют каждый час в течение 4 ч.

При многократном воздействии число аппликаций, их продолжительность и интервалы между аппликациями зависят от особенностей применения изделия в медицинской практике.

В.4.7 Обследование животных

Макроскопическое исследование защечных мешков проводят после извлечения таблетки или шарика и непосредственно перед следующей аппликацией, если она необходима.

Оценивают состояние слизистой защечных мешков и степень реакции в соответствии с таблицей В.3 на каждый интервал времени наблюдения для каждого животного. Регистрируют результаты в отчете об исследовании.

Через 24 ч после последнего воздействия макроскопически исследуют защечные мешки, умерщвляют животных гуманными методами и берут образцы тканей с соответствующих участков защечного мешка. Помещают их в соответствующий фиксатор до обработки для гистологических исследований.

Таблица В.3 - Система оценки реакции тканей ротовой полости и пениса

Реакция	Оценка в баллах
Эритема и образование струпа
Отсутствие эритемы	0
Очень слабая эритема (едва заметная)	1
Хорошо различимая эритема	2
Умеренная эритема	3
Резко выраженная эритема (темно-красная) с образованием струпа	4
Примечание - Другие возникшие реакции в тканях должны быть отмечены в отчете об исследовании.

B.4.8 Оценка результатов

B.4.8.1 Макроскопическое исследование

Сравнивают состояние слизистой подопытных защечных мешков с защечными мешками на противоположной стороне и, если это предусмотрено, с защечными мешками животных контрольной группы.

Баллы (таблица В.3) каждого наблюдения складывают и делят на общее число наблюдений, чтобы получить среднее значение на одно животное.

Примечания

1 Эти наблюдения могут быть полезны для гистологической оценки.

2 Результаты предварительной оценки, проведенной до первой аппликации исследуемой пробы, не включают в подсчет баллов.

B.4.8.2 Гистологические исследования

Раздражающее действие исследуемого материала на ткани ротовой полости оценивают патоморфологи.

Определяют состояние тканей в соответствии с системой классификации, представленной в таблице В.4.

Баллы, полученные при микроскопическом исследовании всех животных в опытной группе, суммируют и делят на число наблюдений для определения среднего значения в группе. Те же вычисления повторяют для контрольной группы. Максимальное значение может достигать 16.

Общее число баллов больше девяти, полученное при микроскопическом исследовании контрольных защечных мешков в опытной группе, может указывать на скрытые патологические процессы, а у контрольных животных - на травмирование при дозировании. Такая ситуация может потребовать повторного исследования, если в других исследованиях или контрольных группах обнаружены высокие значения.

Разность средних баллов, полученных для опытной и контрольной групп, дает индекс раздражения (см. таблицу В.5).

При оценке результатов многократного воздействия таблицу В.4 модифицируют, чтобы учесть показатели реакции тканей, связанные с хроническим раздражением.

B.4.9 Протокол исследований

Протокол исследований должен содержать:

a) описание испытуемых образцов;

b) предполагаемый способ применения материала или изделия;

c) подробное описание подготовки образцов к исследованиям;

d) описание экспериментальных животных;

e) способ аппликации исследуемых образцов;

f) описание процедуры снятие показаний;

g) ведение наблюдений и их регистрации;

h) гистологическую оценку;

i) оценку результатов.

Таблица В.4 - Система оценки в микроскопическом исследовании реакции тканей ротовой полости, пениса, вагины

Реакция	Оценка в баллах
1 Эпителий
Нормальный, интактный	0
Клеточная дистрофия или уплощение	1
Метаплазия	2
Локальная эрозия	3
Генерализованная эрозия	4
2 Лейкоцитарная инфильтрация (на поле наблюдения)
Отсутствие	0
Минимальная - менее 25	1
Слабая - от 25 до 50	2
Средняя - от 50 до 100	3
Значительная - более 100	4
3 Закупорка сосудов
Отсутствие	0
Минимальная	1
Слабая	2
Средняя	3
Значительная с некрозом сосудов	4
4 Отек
Отсутствие	0
Минимальный	1
Слабый	2
Средний	3
Значительный	4

Таблица В.5 - Индекс раздражения

Индекс раздражения
Средний балл	Прилагаемое описание
0	Отсутствие
1 до 4	Минимальный
5 до 8	Слабый
9 до 11	Средний
12 до 16	Резко выраженный
Примечание 1 - Другие выявленные изменения в тканях должны быть зарегистрированы и учтены при оценке результатов. Примечание 2 - Система оценки при микроскопическом исследовании в таблице В.4 может быть применена ко всем перечисленным методам. "Индекс раздражения" был разработан для исследования вагинального раздражающего действия, но может применяться и в остальных случаях.

В.5 Исследование раздражающего действия на пенис

B.5.1 Общие положения

Исследование раздражающего действия на ткани пениса проводят для материалов с контактом указанного вида, если данные по безопасности не могут быть получены другими средствами.

B.5.2 Принцип метода

Исследование проводят для определения потенциальной возможности материала оказывать раздражающий эффект на пенис.

B.5.3 Исключение из исследования

B.5.4 Исследуемый материал

Если исследуемый материал является твердым или жидким, то подготовку пробы проводят в соответствии с приложением А.

B.5.5 Экспериментальные животные и их содержание

Используют молодых здоровых половозрелых самцов кроликов-альбиносов или морских свинок массой не менее 2 кг для кроликов и 300 - 500 г для морских свинок.

Акклиматизацию и содержание животных осуществляют в соответствии с ISO 10993-2.

Длина пениса должна быть не менее 1 см.

Так как существуют индивидуальные различия в пигментации, животных осматривают перед первой аппликацией исследуемого материала. Для оценки степени реакции используют систему оценки, приведенную в таблице В.3. Животных со значительными отклонениями от нормы или с эритемой степенью 2 балла или выше, исключают из эксперимента.

Для предварительной оценки исследуемого материала в опытную и контрольную группы берут по три особи.

B.5.6 Процедура исследований

Животных помещают на спину, фиксируют конечности.

Осторожно надавливая указательным и средним пальцами на генитальную область, извлекают пенис. Наносят достаточный объем (приблизительно 0,2 мл) испытуемой пробы так, чтобы пенис был покрыт полностью.

Позволяют органу втянуться обратно. Необходимо помешать животному облизывать испытуемый участок во избежание искажения проявления первичного раздражения вторичными факторами (например, следует применить елизаветинский воротник).

Другой возможный способ - помещение животного в специальное устройство, где оно остается в течение 1 ч после аппликации, а затем возвращение его в клетку.

В остром эксперименте эту процедуру повторяют каждый час в течение 4 ч.

В длительном эксперименте число аппликаций, их продолжительность и интервалы между аппликациями зависят от особенностей применения изделия в медицинской практике.

B.5.7 Обследование животных

При остром воздействии отмечают состояние кожи пениса через 1 ч после первой аппликации (т. е. непосредственно перед следующей) и далее после каждой следующей аппликации. Отмечают и регистрируют состояние кожи пениса через 1, 24 и 48 ч после последней аппликации.

При длительном многократном воздействии состояние пениса оценивают через 1 ч после первой аппликации и непосредственно перед каждым последующим воздействием.

Оценивают степень реакции поверхности кожи на наличие эритемы в соответствии с системой оценки, при веденной в таблице В.3, для каждого животного и каждого интервала времени наблюдения и регистрируют результаты в отчете об исследовании.

Если у какого-либо животного обнаружено покраснение до первой аппликации, то баллы, которыми оценено это состояние кожного покрова, вычитают из баллов эритемы возникшей в результате воздействия, чтобы определить баллы эритемы, появившейся только под воздействием материала.

B.5.8 Оценка результатов

B.5.8.1 Макроскопическое исследование

Сравнивают состояние пениса и его оболочки у экспериментальных и контрольных животных. Баллы (таблица В.3) каждого наблюдения суммируют и делят на общее число наблюдений, чтобы получить среднее значение на одно животное.

Примечания

1 Эти наблюдения могут быть полезны для гистологической оценки.

Через 48 ч после последней аппликации животных подвергают эвтаназии, используя гуманные методы. Дистальный участок пениса и оболочки иссекают и помещают в соответствующий фиксатор перед обработкой для гистологических исследований.

B.5.8.2 Гистологические исследования

Раздражающее действие на кожу пениса оценивают патоморфологи. Определяют состояние тканей в баллах в соответствии с системой оценки, представленной в таблице В.4.

Баллы, полученные при микроскопическом исследовании всех животных опытной группы, суммируют и делят на число наблюдений, чтобы определить средний балл в группе. Максимальное значение может достигать 16.

Те же вычисления повторяют для контрольной группы.

Общее число баллов большее девяти, полученное при микроскопическом исследовании у контрольных животных, свидетельствует о наличии травмы. Повторное исследование проводят, если другие исследования или контрольные животные дают такие же высокие баллы.

Разность средних баллов, полученных для опытных и контрольных групп, дает индекс раздражения (см. таблицу В.5).

B.5.9 Протокол исследований

Протокол исследований должен содержать:

a) описание испытуемых образцов;

b) предполагаемый способ применения материала или изделия;

c) подробное описание подготовки образцов к исследованиям;

d) описание экспериментальных животных;

e) способ аппликации исследуемых образцов;

f) описание процедуры снятия показаний;

g) ведение наблюдений и их регистрации;

h) гистологическую оценку;

i) оценку результатов.

В.6 Исследование ректального раздражающего действия

B.6.1 Общие положения

Исследование ректального раздражающего действия проводят для материалов с контактом указанного вида, если данные по безопасности не могут быть получены другими средствами.

B.6.2 Принцип метода

Исследование проводят для определения потенциальной возможности материала оказывать ректальный раздражающий эффект.

B.6.3 Исключение из исследования

B.6.4 Исследуемый материал

B.6.5 Экспериментальные животные и их содержание

Используют молодых здоровых половозрелых кроликов-альбиносов любого пола, одной линии, массой не менее 2 кг. Если используют другие виды, их выбор должен быть обоснован.

Акклиматизацию и содержание животных осуществляют в соответствии с ISO 10993-2.

Для предварительной оценки исследуемого материала в опытную и контрольную группы берут по три особи.

При неудовлетворительных или сомнительных результатах, полученных при предварительной оценке, проводят дополнительные исследования.

Животных перед экспериментом и перед каждым воздействием обследуют для выявления возможных повреждений прямой кишки: опухолей, раздражения, связанного с инфекционными заболеваниями, и т. д.

B.6.6 Процедура исследований

Короткий (6 см) мягкий катетер или канюлю с тупым концом присоединяют к шприцу объемом 1 мл и более и заполняют шприц с катетером таким образом, чтобы объем исследуемого материала не превышал 1 мл. Для каждого животного используют индивидуальный шприц с катетером.

Фиксируют животное с помощью удерживающего приспособления, которое обеспечивает свободный доступ к промежности, или при помощи лаборанта, осторожно удерживающего животное и фиксирующего его за задние конечности таким образом, чтобы открыть промежность.

Катетер перед введением смачивают контрольным раствором или подходящей смазкой для облегчения вво да в кишку.

Захватывают и поднимают хвост животного, открывая промежность. Мягко вводят катетер глубоко в прямую кишку и впрыскивают 1 мл жидкости из шприца, затем катетер вынимают.

Поскольку объем прямой кишки у животных неодинаков, исследуемый материал может частично выйти из нее во время или сразу после введения. Аккуратно удаляют остатки материала мягкой тканью.

Повторяют вышеописанную процедуру через 24 ч ежедневно в течение 5 сут

В длительном эксперименте число введений, их продолжительность и интервалы между ними зависят от особенностей применения изделия в медицинской практике.

B.6.7 Обследование животных

Через 24 ч после первой аппликации и непосредственно перед следующей отмечают и регистрируют изменения внешнего вида промежности, появление выделений, эритемы, раздражения. Животных, у которых обнаружены выраженные изменения, выделения или опухоли, не позволяющие повторить процедуру, подвергают эвтаназии, применяя гуманные методы, и исследуют ткани в соответствии с В.6.8.1.

Через 24 ч после последнего введения исследуемого материала животных подвергают эвтаназии с применением гуманных методов. Отсекают участок прямой кишки и дистальную часть толстой кишки, разрезают вдоль и обследуют, отмечая наличие раздражения, повреждений эпителиального слоя или некроза тканей. Прямую кишку и дистальную часть толстой кишки помещают в соответствующий фиксатор для дальнейших гистологических исследований.

B.6.8 Оценка результатов

B.6.8.1 Макроскопическое исследование

Через 24 ч после последнего введения исследуемого материала животных подвергают эвтаназии с применением гуманных методов.

Отсекают участок прямой кишки и дистальную часть толстой кишки, разрезают вдоль и обследуют, отмечая наличие раздражения, повреждений эпителиального слоя или некроза тканей.

Прямую кишку и дистальную часть толстой кишки помещают в соответствующий фиксатор для дальнейших гистологических исследований.

Сравнивают ректальные ткани в опытных и контрольных группах.

Регистрируют и описывают макроскопические изменения ректальных тканей каждого животного, отмечая различия между животными опытной и контрольной групп.

Примечание - Эти наблюдения могут быть полезны при гистологических исследованиях.

B.6.8.2 Гистологические исследования

Раздражающее действие на ректальные ткани проводят патоморфологи. Определяют состояние тканей в соответствии с системой оценки, представленной в таблице В.4.

Те же вычисления повторяют для контрольной группы.

Разность средних баллов, полученных для опытных и контрольных групп, дает индекс раздражения (см. таблицу В.5).

В.6.9 Протокол исследований

Протокол исследований должен содержать:

a) описание испытуемых образцов;

b) предполагаемый способ применения материала или изделия;

c) подробное описание подготовки образцов к исследованиям;

d) описание экспериментальных животных;

e) способ аппликации исследуемых образцов;

f) описание процедуры снятия показаний;

g) ведение наблюдений и их регистрации;

h) гистологическую оценку;

i) оценку результатов.

В.7 Исследование вагинального раздражающего действия

B.7.1 Общие положения

Исследование вагинального раздражающего действия проводят для материалов с контактом указанного вида, если данные по безопасности не могут быть получены другими средствами.

B.7.2 Принцип метода

Исследование проводят для определения потенциальной возможности материала оказывать вагинальный раздражающий эффект.

B.7.3 Исключение из исследования

B.7.4 Исследуемый материал

Если исследуемый материалов является твердым или жидким, то подготовку пробы проводят в соответствии с приложением А.

B.7.5 Экспериментальные животные и их содержание

Используют здоровых молодых половозрелых самок кроликов-альбиносов одной линии массой не менее 2 кг. Если используют другие виды, их выбор должен быть обоснован.

Акклиматизацию и содержание животных осуществляют в соответствии с ISO 10993-2.

Для предварительной оценки исследуемого материала в опытную и контрольную группы берут по три особи.

При неудовлетворительных или сомнительных результатах, полученных при предварительной оценке, проводят дополнительные исследования.

Животных перед экспериментом и перед каждым воздействием обследуют для выявления выделений, возможных повреждений влагалища: наличие опухолей, вагинальных инфекций, раздражения и т. д. Обследование проводят также для определения фазы овуляционного цикла, чтобы отличить реакцию тканей на возможное действие исследуемого материала от физиологических изменений.

B.7.6 Процедура исследований

Короткий (6 см) мягкий катетер или канюлю с тупым концом присоединяют к шприцу объемом 1 мл и более и заполняют шприц с катетером таким образом, чтобы объем испытуемого раствора не превышал 1 мл. Для каждого животного используют индивидуальный шприц с катетером.

Фиксируют животное с помощью удерживающего приспособления, которое обеспечивает свободный доступ к влагалищу, или при помощи лаборанта, осторожно удерживающего животное и фиксирующего его за задние конечности таким образом, чтобы открыть промежность.

Катетер перед введением смачивают контрольным раствором или подходящей смазкой для облегчения ввода во влагалище.

Захватывают и поднимают хвост животного, открывая вход во влагалище. Мягко вводят катетер глубоко во влагалище и впрыскивают 1 мл исследуемой пробы из шприца, вынимают катетер.

Поскольку объем влагалища у животных неодинаков, исследуемый материал может частично выйти из влагалища во время или сразу после введения. Аккуратно удаляют остатки материала мягкой тканью.

Повторяют вышеописанную процедуру через 24 ч ежедневно в течение 5 сут

В продолжительном эксперименте число введений, их продолжительность и интервалы между ними зависят от особенностей применения изделия в медицинской практике.

B.7.7 Обследование животных

Через 24 ч после первого введения и непосредственно перед следующей процедурой отмечают и регистрируют появление выделений, изменений внешнего вида входа во влагалище и промежности, эритемы, раздражения.

Животных, у которых обнаружены выраженные изменения или опухоли, не позволяющие повторить введение, подвергают эвтаназии, применяя гуманные методы, и исследуют ткани в соответствии с В.6.8.1.

B.7.8 Оценка результатов

B.7.8.1 Макроскопическое исследование

Через 24 ч после последнего введения исследуемого материала животных подвергают эвтаназии с применением гуманных методов. Отделяют влагалище, разрезают вдоль и осматривают, отмечая наличие раздражения, повреждений эпителиального слоя и некроза тканей.

Ткани влагалища помещают в соответствующий фиксатор для дальнейших гистологических исследований. Выделяют три кусочка из цервикальной, центральной и каудальной частей влагалища.

Сравнивают вагинальные ткани в опытных и контрольных группах.

Примечание - Эти наблюдения могут быть полезны в гистологических исследованиях.

B.7.8.2 Гистологические исследования

Раздражающее действие на вагинальные ткани проводят патоморфологи. Определяют состояние тканей в соответствии с системой оценки, представленной в таблице В.4.

Те же вычисления повторяют для контрольной группы.

Разность средних баллов, полученных для опытных и контрольных групп, дает индекс раздражения (см. таблицу В.5).

B.7.9 Протокол исследований

Протокол исследований должен содержать:

a) описание испытуемых образцов;

b) предполагаемый способ применения материала или изделия;

c) подробное описание подготовки образцов к исследованиям;

d) описание экспериментальных животных;

e) способ аппликации исследуемых образцов;

f) описание процедуры снятия показаний;

g) ведение наблюдений и их регистрации;

h) гистологическую оценку;

i) оценку результатов.

<< Приложение А (обязательное). Подготовка материалов для исследования раздражающего и сенсибилизирующего действия		Приложение >> С (справочное). Дополнительная информация
	Содержание Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 10993-10-2011 "Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий....

Приложение В (справочное). Дополнительные методы исследования раздражающего действия

Вы можете открыть актуальную версию документа прямо сейчас.