Приложение A (справочное). Пример А - Коровье молоко и сухие молочные смеси для детей раннего возраста. Одновременное количественное определение меламина и циануровой кислоты методом жидкостной хроматографии с ионизацией электрораспылением и тандемной масс-спектрометрии

Приложение A
(справочное)

Пример А - Коровье молоко и сухие молочные смеси для детей раннего возраста. Одновременное количественное определение меламина и циануровой кислоты методом жидкостной хроматографии с ионизацией электрораспылением и тандемной масс-спектрометрии

А.1 Область применения

В данном приложении установлен подтвержденный внутри лаборатории метод количественного определения меламина и циануровой кислоты в коровьем молоке и сухих молочных смесей для детей раннего возраста методом жидкостной хроматографии с ионизацией электрораспылением и тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS) с использованием режима мониторинга выбранных реакций.

Положительная идентификация меламина и циануровой кислоты в пробе проводится согласно критериям подтверждения по [1].

Количественное определение осуществляют с помощью изотопного разбавления, используя меченый (, )-меламин и меченую (, )-циануровую кислоту в качестве внутренних

стандартов (IS). Дополнительные технические подробности можно найти в данных валидации и результатах квалификационных испытаний, см. ссылку [3].

Метод позволяет осуществить точное количественное определение при следующих сообщаемых пределах, и более:

a) содержание меламина и циануровой кислоты в коровьем молоке при массовой концентрации от 0,05 до 0,10 мг/кг соответственно;

содержание меламина и циануровой кислоты в молочных смесях для детей раннего возраста при массовой концентрации от 0,05 мг/кг до 0,10 мг/кг, соответственно;

b) содержание меламина и циануровой кислоты в молочных смесях для детей раннего возраста при массовой концентрации 1,00 мг/кг.

А.2 Термины и определения

См. раздел 3.

А.3 Сущность метода

Методика анализа включает разбавление пробы в водном растворе ацетонитрила, что приводит к осаждению. После центрифугирования надосадочную жидкость анализируют методом LC-MS/MS в режиме SRM, работая как в режиме ионизации с получением положительных ионов, так и в режиме ионизации с получением отрицательных ионов. Переключение полярности выполняется в рамках одного опыта.

А.4 Реактивы

Используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если нет иных указаний, и дистиллированную или деминерализованную воду или воду равноценной чистоты.

Примечание - Номера по CAS приведены для каждого реактива.

Перед использованием химических веществ см. соответствующие справочники или перечни безопасности, утвержденные в установленном порядке.

А.4.1 Вода для хроматографического анализа (CAS No. 7732-18-5).

А.4.2 Ацетонитрил (), градиентной чистоты для хроматографического анализа (CAS No. 75-05-8).

А.4.3 Ацетат аммония (), GR для анализа (CAS No. 631-61-8).

А.4.4 Циануровая кислота , массовая доля >98% (CAS No. 108-80-5).

А.4.4.1 Исходный стандартный раствор циануровой кислоты, массовой концентрацией 0,25 мг циануровой кислоты на кубический сантиметр.

Берут навеску с точностью до 0,1 мг, 63,8 мг циануровой кислоты (А.4.4) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 250  (А.5.12), сделав соответствующую поправку на примеси согласно результатам анализа, приведенным в сертификате. Растворяют и доводят до метки водой (А.4.1). Примерно в течение 15 мин воздействуют ультразвуком до полного растворения.

Хранят исходный стандартный раствор циануровой кислоты при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий исходный стандартный раствор готовят еженедельно.

A.4.4.2 Рабочий раствор циануровой кислоты I, соответствующий массовой концентрации 20 мкг циануровой кислоты на кубический сантиметр.

Пипеткой добавляют 4  исходного стандартного раствора циануровой кислоты (А.4.4.1) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50  (А.5.12). Доводят до метки водой (А.4.1) и перемешивают. Рабочий раствор I циануровой кислоты хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий рабочий раствор I готовят еженедельно.

А.4.4.3 Рабочий раствор циануровой кислоты II, соответствующий массовой концентрации 2 мкг циануровой кислоты на миллилитр.

Пипеткой добавляют 1  рабочего раствора 1 циануровой кислоты (А.4.4.2) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 10  (А.5.12). Доводят до метки водой (А.4.1) и перемешивают. Рабочий раствор II циануровой кислоты хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий рабочий раствор II готовят еженедельно.

А.4.4.4 Рабочий раствор циануровой кислоты III, соответствующий 200 нг циануровой кислоты на кубический сантиметр.

Пипеткой добавляют 0,5  рабочего раствора циануровой кислоты I (А.4.4.2) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50  (А.5.12). Доводят до метки водой (А.4.1) и перемешивают. Рабочий раствор III циануровой кислоты хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий рабочий раствор III готовят еженедельно.

А.4.5 Меченая циануровая кислота (), изотопная чистота: = 99%; кольцо > 98%; химическая чистота 90% по массе, 100  в воде - 1,2 .

А.4.5.1 Исходный стандартный раствор меченой циануровой кислоты, соответствующий массовой концентрации 100 мкг меченой циануровой кислоты на кубический сантиметр.

Готовый к применению исходный стандартный раствор меченой циануровой кислоты имеется в продаже. Хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте.

Необходимо использовать IS (внутренний стандарт) одной и той же партии для приготовления стандартных градуировочных растворов, описанных в А.6.2, и введения в экстракты в соответствии с методикой экстракции, описанной в А.9.1.

А.4.5.2 Рабочий раствор меченой циануровой кислоты I, соответствующий массовой концентрации 20 мкг меченой циануровой кислоты на миллилитр.

Пипеткой добавляют 1  от исходного стандартного раствора меченой циануровой кислоты (А.4.5.1) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 5  (А.5.12). Доводят до метки водой (А.4.1) и перемешивают. Рабочий раствор меченой циануровой кислоты I хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте.

А.4.5.3 Рабочий раствор меченой циануровой кислоты II, соответствующий массовой концентрации 2 мкг меченой циануровой кислоты на кубический сантиметр.

Пипеткой добавляют 0,5  рабочего раствора меченой циануровой кислоты I (А.4.5.2) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 5  (А.5.12). Доводят до метки водой (А.4.1) и перемешивают. Рабочий раствор меченой циануровой кислоты II хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте.

А.4.5.4 Рабочий раствор меченой циануровой кислоты III, соответствующий массовой концентрации 200 нг меченой циануровой кислоты на миллилитр.

Пипеткой добавляют 0,5  рабочего раствора меченой циануровой кислоты I (А.4.5.2) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50  (А.5.12). Доводят до метки водой (А.4.1) и перемешивают. Рабочий раствор меченой циануровой кислоты III хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте.

А.4.6 Меламин (), > 99% по массе (CAS No. 108-78-1).

А.4.6.1 Исходный стандартный раствор меламина, соответствующий массовой концентрации 0,25 мг меламина на кубический сантиметр.

Взвешивают с точностью до 0,1 мг 62,5 мг меламина (А.4.6) и помещают в мерную колбу с одной меткой вместимостью 250  (А.5.12). Растворяют и доводят до метки водой (А.4.1). Обрабатывают ультразвуком в течение не менее 15 мин до полного растворения. Хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий исходный раствор готовят еженедельно.

А.4.6.2 Рабочий раствор меламина I, соответствующий массовой концентрации 20 мкг меламина на миллилитр.

Пипеткой добавляют 4 исходного стандартного раствора меламина (А.4.6.1) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50  (А.5.12). Доводят до метки водой (А.4.1) и перемешивают. Хранят рабочий раствор меламина I при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий рабочий раствор меламина I готовят еженедельно.

А.4.6.3 Рабочий раствор меламина II, соответствующий массовой концентрации 2 мкг меламина на кубический сантиметр.

Пипеткой добавляют 1  рабочего раствора меламина I (А.4.6.2) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 10  (А.5.12). Доводят до метки водой (А.4.1) и перемешивают. Хранят рабочий раствор меламина II при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий рабочий раствор меламина II готовят еженедельно.

А.4.6.4 Рабочий раствор меламина III, соответствующий массовой концентрации 200 нг меламина на кубический сантиметр.

Пипеткой добавляют 0,5  рабочего раствора меламина I (А.4.6.2) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50  (А.5.12). Доводят до метки водой (А.4.1) и перемешивают. Хранят рабочий раствор меламина III при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий рабочий раствор меламина III готовят еженедельно.

А.4.7 Меченый меламин [], изотопная чистота: = 99%; амино- = 98%; химическая чистота 98% по массе, 100  в воде - 1,2 , например, CNLM-8150-1.2*(1).

А.4.7.1 Исходный раствор меченого меламина, соответствующий концентрации 10 мкг меченого меламина на кубический сантиметр.

Хранят раствор при комнатной температуре в защищенном от света месте. Необходимо использовать IS (внутренний стандарт) одной и той же партии для приготовления стандартных градуировочных растворов в А.6.2 и введения в экстракты в соответствии с методикой экстракции, описанной в А.9.1.

А.4.7.2 Рабочий раствор меченого меламина I, соответствующий массовой концентрации 20 мкг меченого меламина на кубический сантиметр.

Пипеткой добавляют 1  исходного раствора меченого меламина (А.4.7.1) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 5  (А.5.12). Доводят до метки водой (А.4.1) и перемешивают. Хранят рабочий раствор меченого меламина I при комнатной температуре в защищенном от света месте.

А.4.7.3 Рабочий раствор меченого меламина II, соответствующий массовой концентрации 2 мкг меченого меламина на кубический сантиметр.

Пипеткой добавляют 0,5  рабочего раствора меченого меламина I (А.4.7.2) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 5  (А.5.12). Доводят до метки водой (А.4.1) и перемешивают. Хранят рабочий раствор меченого меламина II при комнатной температуре в защищенном от света месте.

А.4.7.4 Рабочий раствор меченого меламина III, соответствующий массовой концентрации 200 нг меченого меламина на кубический сантиметр.

Пипеткой добавляют 0,5  рабочего раствора меченого меламина I (А.4.7.2) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50  (А.5.12). Доводят до метки водой (А.4.1) и перемешивают. Хранят рабочий раствор меченого меламина III при комнатной температуре в защищенном от света месте.

А.5 Аппаратура

Стеклянная посуда (например мерные колбы, А.5.12), используемая для приготовления стандартных исходных и рабочих растворов, может загрязниться, особенно меламином, и требует очистки и промывки следующим образом:

a) стеклянную посуду моют вручную теплой водопроводной водой с лабораторным моющим средством;

b) стеклянную посуду вручную моют лабораторным ершиком;

c) тщательно споласкивают все стекло, включая стеклянные пробки теплой водопроводной водой, затем дистиллированной водой три раза;

d) споласкивают стеклянную посуду этиловым спиртом А и дают просохнуть на воздухе.

Используют обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.

А.5.1 Конические пробирки из полипропилена, вместимостью 50 .

А.5.2 Центрифуга, оснащенная ротором, приспособленная под пробирки вместимостью 50 , с ускорением 4000 g.

А.5.3 Мерные пипетки вместимостью 0,5, 1 и 4 , по ISO 835 [4], класс А (или AS).

А.5.4 Автоматическая микропипетка по ISO 8655-2 [5], точная, прецизионная, калиброванная пользователем.

A.5.5 Нейлоновый шприцевой фильтр, пористость 0,22 мкм.

А.5.6 Система дегазации (если она не является частью оборудования для LC-MS/MS).

А.5.7 Аналитические весы, обеспечивающие считывания с точностью до 0,1 мг.

А.5.8 Устройство для ультразвуковой обработки.

А.5.9 Пробирки.

А.5.10 Оборудование для LC-MS/MS.

HPLC Agilent 1100*(2) в сочетании с масс-спектрометром 4000 QTrap*(3) с тремя квадрупольными линзами, оснащенный источником ионизации Turbolon Spray*(3).

А.5.11 Колонка HPLC, TSKgel Amide-80*(4), диаметр 2,0 мм, длина 250 мм, ВД 5 мкм.

А.5.12 Мерные колбы с одной меткой, вместимостью 5, 10, 50, 100, 250 и 1000  по ISO 1042 [6], класс А.

А.6 Подготовка реактивов

А.6.1 Водный раствор ацетонитрила [соотношение 70 (ацетонитрил) + 30 (вода)]

С помощью мерных цилиндров переносят 70  ацетонитрила (А.4.2) и 30  воды (А.4.1) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 100  (А.5.12) и перемешивают. Хранят при комнатной температуре в течение не более одной недели.

А.6.2 Калибровочные кривые для меламина и циануровой кислоты

А.6.2.1 Стандартные растворы меламина и циануровой кислоты (от 0 до 2,00 ) с соответствующими IS (внутренними стандартами) (при уровне 1,00 )

Готовят по отдельности пять смешанных стандартных растворов, каждый в мерной колбе с одной меткой вместимостью 5  (А.5.12) в диапазоне концентраций от 0 до 2,00  и добавляют соответствующий IS (внутренний стандарт) на уровне 1,00 , как показано в таблице А.1.

Хранят пять полученных стандартных растворов при температуре 4°С в защищенном от света месте.

Таблица А.1 - Стандартные смеси меламина и циануровой кислоты в соотношении 1 : 5

Наименование показателя	Стандартный раствор
	1	2	3	4	5
Рабочий раствор меламина II (А.4.6.3), мкл	0	25	50	75	100
Рабочий раствор циануровой кислоты II (А.4.4.3), мкл	0	25	50	75	100
Рабочий раствор меченого меламина II (А.4.7.3), мкл	50	50	50	50	50
Рабочий раствор меченой циануровой кислоты II (А.4.5.3), мкл	50	50	50	50	50
Раствор ацетонитрил-вода (А.6.1), мкл	4 900	4 850	4 800	4 750	4 700
Это соответствует:
концентрации аналитов в сумме, концентрации IS в сумме, содержанию аналитов (эквивалентно пробе), мг/кг	0	10	20	30	40
	20	20	20	20	20
	0,00	0,50	1,00	1,50	2,00
содержанию IS (эквивалентно пробе), мг/кг	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00

A.6.2.2 Стандартные растворы меламина (от 0 до 0,20 ) и циануровой кислоты (от 0 до 0,30 ) с соответствующими IS (внутренними стандартами) (на уровне 0,10 )

Готовят по отдельности пять смешанных стандартных растворов, каждый в мерной колбе с одной меткой вместимостью 5  (А.5.12), в диапазоне концентраций меламина от 0 до 0,20  и в диапазоне массовых концентраций циануровой кислоты от 0 до 0,30  с соответствующим IS (внутренний стандарт) для обоих аналитов, добавленных при концентрации 0,10 , как показано в таблице А.2.

Хранят полученные стандартные растворы при температуре 4°С в защищенном от света месте.

Таблица А.2 - Стандартные смеси меламина и циануровой кислоты в соотношении 6 :10

Наименование показателя	Стандартные растворы
	6	7	8	9	10
Рабочий раствор меламина III (А.4.6.4), мкл	0	25	50	75	100
Рабочий раствор циануровой кислоты III (А.4.4.4), мкл	0	50	75	100	150
Рабочий раствор меченого меламина III (А.4.7.4), мкл	50	50	50	50	50
Рабочий раствор меченой циануровой кислоты III (А.4.5.4), мкл	50	50	50	50	50
Раствор ацетонитрил-вода (А.6.1), мкл	4 900	4 825	4 775	4 725	4 650
Это соответствует: концентрации меламина, концентрации циануровой кислоты, концентрации IS (меламина или циануровой кислоты), содержанию меламина (эквивалентно пробе), мг/кг содержанию циануровой кислоты (эквивалентно пробе), мг/кг содержанию IS (меламин и циануровая кислота, эквивалентно пробе), мг/кг	0	1	2	3	4
	0	2	3	4	6
	2	2	2	2	2
	0,00	0,05	0,10	0,15	0,20
	0,00	0,10	0,15	0,20	0,30
	0,10	0,10	0,10	0,10	0,10

А.6.3 Растворы для жидкостной хроматографии

А.6.3.1 Подвижная фаза А: водный раствор ацетата аммония, 10 .

Переносят 0,77 г ацетата аммония (А.4.3) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 1 000 (А.5.12). Растворяют в ~50  воды (А.4.1). Доводят до метки водой и перемешивают. Фильтруют раствор через фильтр пористостью 0,22 мкм.

А.6.3.2 Подвижная фаза В: ацетонитрил.

Используют ацетонитрил специальной марки для хроматографии (HPLC) (А.4.2).

А.7 Отбор проб

Отбор проб не является частью метода, установленного в данном приложении. Рекомендуемый метод отбора проб описан в ISO 707/IDF 50 [2].

Важно, чтобы в лаборатории была получена репрезентативная проба, которая не претерпела повреждений и изменений в процессе транспортирования и хранения.

Сырое молоко хранят при температуре 4°С или в замороженном состоянии, если анализ не будет проводиться непосредственно по получении.

А.8 Подготовка проб для анализа

А.8.1 Сухая молочная смесь для детей раннего возраста

Готовят гомогенную лабораторную пробу путем переноса ее в емкость для пробы вместимостью, в два раза превышающей объем лабораторной пробы. Немедленно закрывают емкость.

Тщательно перемешивают, многократно встряхивая и переворачивая емкость.

А.8.2 Коровье молоко

Доводят пробу до комнатной температуры. Перед тем, как взять навеску для анализа, убеждаются, что проба гомогенная осторожным перевертыванием емкости несколько раз.

А.9 Проведение анализа

А.9.1 Методика экстракции

Взвешивают с точностью до 0,01 г, 1 г коровьего молока (А.8.2) или сухой молочной смеси (А.8.1) в конической пробирке вместимостью 50  (А.5.1).

а) Вплоть до концентрации 2 мг/кг долей меламина и циануровой кислоты с тем и другим внутренними стандартами, добавленными в концентрации 1 мг/кг, вносят в навеску для анализа 50 мкл рабочего раствора меченого меламина I (А.4.7.2) и 50 мкл рабочего раствора меченой циануровой кислоты I (А.4.5.2). Тщательно перемешивают, пока внесенные объемы полностью не абсорбируются матрицей.

b) Для уровней содержания меламина до 0,2 мг/кг и циануровой кислоты до 0,3 мг/кг с тем и другим внутренними стандартами, добавленными в концентрации 0,1 мг/кг вносят в пробу для анализа 50 мкл рабочего раствора меченого меламина II (А.4.7.3) и 50 мкл рабочего раствора меченой циануровой кислоты II (А.4.5.3). Тщательно перемешивают, пока внесенные объемы полностью не абсорбируются матрицей.

Затем добавляют 5  воды (А.4.1) в коническую пробирку, подготовленную либо как в а), либо как в b). Перемешивают, так чтобы в пробе не оставалось сгустков. Добавляют 5  ацетонитрила (А.4.2). Энергично встряхивают в течение не менее 1 мин.

Добавляют 30  ацетонитрила (А.4.2) и 10  воды (А.4.1). Энергично встряхивают в течение не менее 5 мин, так чтобы в пробе не оставалось сгустков. В идеале лучше использовать автоматический шейкер. Центрифугируют полученный раствор при ускорении 4000 g при комнатной температуре в течение 10 мин, чтобы получить прозрачную надосадочную жидкость.

Если надосадочная жидкость не будет прозрачной, переносят аликвотное количество жидкости в другую пробирку и снова центрифугируют при 8500g при комнатной температуре в течение не менее 10 мин, используя настольную центрифугу.

Переносят от 0,5 до 1  прозрачной надосадочной жидкости в пробирку для хроматографического анализа. Продолжают анализ LC-MS/MS (А.9.3).

А.9.2 Холостой опыт

Чтобы компенсировать, при необходимости, загрязнение меламином и циануровой кислотой в процессе подготовки пробы, используют холостую пробу, подготовленную без добавления матрицы. Анализируют холостую пробу наряду с каждой серией обычных проб.

А.9.3 Анализ LC-MS/MS

А.9.3.1 Условия HPLC (ВЭЖХ)

	Подвижная фаза А:		раствор ацетата аммония (А.6.3.1);
	подвижная фаза В:		ацетонитрил (А.6.3.2);
	вводимый объем:		5 мкл;
	колонка:		TOSOH TSKgel Amide-80, диаметр 2,0 мм, длина 250 мм, внутренний диаметр 5 мкм;
	температура:		комнатная температура;
	скорость потока:		0,25 ;
	градиент:		градиент LC как описано в таблице А.3;
	отводный клапан:		поток HPLC направляется на детектор масс-спектрометра в течение от 3,0 до 13,5 мин

Таблица А.3 - Градиент LC, используемый для анализа меламина и циануровой кислоты

Время, мин	А, %	B, %
0	10	90
8	10	90
13	65	35
14	90	10
15	90	10
15,5	10	90
25	10	90

В таких условиях время удерживания циануровой кислоты составляет ~ 6,4 мин, а время удерживания меламина 11,5 мин (см. рисунки А.1 - А.3).

А.9.3.2 Параметры MS (масс-спектрометрии)

Параметры MS получают посредством ввода шприцем со скоростью 5 мкл/мин по отдельности рабочий раствор меламина I (А.4.6.2) и рабочий раствор циануровой кислоты I (А.4.4.2), оба в концентрации 20 , в поток HPLC со скоростью 0,25 , используя Т-образный соединитель. Поток HPLC составляет 50% подвижной фазы А (А.6.3.1) и 50% подвижной фазы В (А.6.3.2). Таблицы А.4 - А.6 дают рабочие условия приборов для анализа меламина и циануровой кислоты.

Таблица А.4 - Типичные параметры MS для меламина

Параметр	Применяемый прибор Biosystems Sciex 4000 QTrap
Тип ионизации	Электрораспыление (ESI)
Напряжение электрораспыления	3,5 кВ
Полярность	Положительные ионы
Температура блока источника ионизации	500 С
Газ	Защитный газ: 69 кПа (10 psl (фунтов на дюйм); газ источника ионов 1: 207 л3кПа (30 фунтов на дюйм); газ источника ионов 2: 207 кПа (30 фунтов на дюйм)
Потенциал декластеризации (DP)	60 В
Потенциал на входе (ЕР)	10 В
Потенциал столкновений на выходе (СХР)	15 А
Давление газа CID (SRM)	0,8 Па (6 мTorr), азот
Ширина пика (для каждого перехода)	0,5 Th
Разрешение	Единица (обе квадрупольные линзы)
Время сканирования (для каждого перехода)	100 мс
Переключение положительный/отрицательный в тройнике Т	8 мин

Таблица А.5 - Типичные параметры MS для циануровой кислоты

Параметр	Применяемый прибор Biosystems Sciex 4000 QTrap
Тип ионизации	Электрораспыление (ESI)
Напряжение электрораспыления	3,5 кВ
Полярность	Отрицательные ионы
Температура блока источника ионизации	500°С
Газ	Защитный газ: 69 кПа (10 фунтов на дюйм); газ источника ионов 1: 207 кПа (30 фунтов на дюйм); газ источника ионов 2: 207 кПа (30 фунтов на дюйм)
Потенциал декластеризации (DP)	40 В
Потенциал на входе (ЕР)	10 В
Потенциал столкновений на выходе (СХР)	15 В
Давление газа CID (SRM)	0,8 Па (6 мТорр, азот)
Ширина пика (для каждого перехода)	0,7 Th
Разрешение	Единица (обе квадрупольные линзы)
Время сканирования (для каждого перехода)	100 мс
Переключение положительный/отрицательный в тройнике Т	8 мин

Таблица А.6 - Реакции перехода, наблюдаемые для анализа меламина и циануровой кислоты и их соответствующих внутренних стандартов (IS) и соотношения площадей пиков с допустимым пределом приемки по [1]

Аналит	Реакции перехода (m/z)(a) для:		Отношение площадей пиков предел (%)
	количественного определения	подтверждения аналита
Меламин	127,085,1 (26)	127,068,0 (45)	0,28 25
Меченый меламин [] (IS)	133,089,1 (26)	133,071,1 (45)	0,1925
Циануровая кислота	128,042,1 (30)	128,085,2 (14)	0,55 20
Меченая циануровая кислота () (IS)	134,0 44,1 (30)	134,088,9 (14)	0,5220
(а) Энергия столкновений (в электрон-вольтах) приведена в скобках.

Примечание - В зависимости от используемого детектора MS, соотношения площадей пиков по диагностическим реакциям перехода могут отличаться от приведенных в таблице А.6.

А.9.3.3 Тест-контроль прибора

Необходимо убедиться, что аппаратура LC-MS/MS работает в таких условиях, в которых метод остается соответствующим назначению. Это включает ввод калибранта низкой концентрации (например, стандартного раствора 7, таблица А.2) для проверки адекватности чувствительности прибора.

А 9.4 Калибровка и анализ проб

Количественно меламин и циануровая кислота определяют с помощью внешней калибровки. Вводят стандартные растворы (А.6.2.1 или А.6.2.2) в каждой серии обычных проб.

А 9.5 Подтверждение

Меламин и циануровая кислота считаются идентифицированными в пробе, если выполняются все критерии подтверждения а) - с) строго в соответствии с определениями по [1]

a) Сигнал обнаруживается при двух диагностических реакциях перехода, выбранных для каждого аналита и при двух диагностических реакциях перехода, выбранных для их соответствующих внутренних стандартов (IS). Отношение сигнал-шум для каждого диагностического иона должно быть 3:1;

b) Отношение хроматографического времени удерживания аналита к времени удерживания соответствующего внутреннего стандарта, т.е. относительное время удерживания аналита, соответствует отношению усредненного времени удерживания градуировочных растворов в пределах 2,5% допуска;

c) Соотношение площадей пиков от различных реакций перехода, записанных для каждого аналита находится в пределах допусков, установленных критериями по [1], приведенными в таблице А.6.

А.10 Расчеты и обработка результатов

А.10.1 Расчеты

Соответствующее программное обеспечение облегчает построение шаблона на заказ, который затем служит для проверки линейности градуировочных кривых, чтобы рассчитать отношения площадей пиков, полученных по различным реакциям перехода (как определено в Таблице А.6), чтобы подтвердить присутствие или отсутствие аналитов, и дать окончательные результаты, выраженные в миллиграммах на килограмм.

Примечание - Градуировочная кривая будет такого типа:

,

где - отношение площадей;

- наклон;

- массовая доля;

- отсекаемый отрезок.

Рассчитывают содержание аналита , мг/кг (где аналитом является меламин, = ; где аналитом является циануровая кислота, = ), используя следующее уравнение:

,

где - площадь пика аналита в пробе;

- площадь пика внутреннего стандарта (IS) в пробе;

- отсекаемый отрезок линии регрессии для реакции перехода, используемой для количественного определения;

- наклон линии регрессии для реакции перехода, используемой для количественного определения;

- масса, в нанограммах, внутреннего стандарта (IS), добавленного в пробу для анализа (А.9.1);

- масса, в граммах, пробы для анализа (А.9.1).

А.10.2 Обработка результатов

Результаты выражают для аналита(ов) с точностью до второго знака после запятой.

A.11 Показатели точности метода

А.11.1 Линейность

Тестируемые диапазоны линейности представлены в перечислениях а) и b):

a) меламин: от 0 до 0,20 мг/кг и от 0 до 2,00 мг/кг (эквивалентно содержанию в пробах) соответственно;

b) циануровая кислота: от 0 до 0,30 мг/кг и от 0 до 2,00 мг/кг (эквивалентно содержанию в пробах) соответственно.

Калибровка следует линейной модели, остатки равномерно распределены, а коэффициенты отклика стабильны в рассматриваемых диапазонах массовых долей.

А.11.2 Пределы обнаружения

LoD (отношение сигнал-шум, равное 3) составляют 0,03 мг/кг для меламина и 0,05 мг/кг для циануровой кислоты соответственно, как в коровьем молоке, так и в сухой молочной смеси.

А.11.3 Предел квантификации

LoQ составляют 0,05 мг/кг для меламина и 0,10 мг/кг для циануровой кислоты, соответственно, как в коровьем молоке, так и в сухой молочной смеси.

А.11.4 Пределы принятия решения и возможности выявления в сухой молочной смеси (PIF)

Предполагая, что максимальный предел (ML) составляет 1 мг/кг в PIF, пределы принятия решения, , и возможности выявления, , представлены в перечислениях а) и b):

a) для меламина: = 1,03 мг/кг, = 1,05 мг/кг;

b) для циануровой кислоты: = 1,04 мг/кг, = 1,09 мг/кг.

А.11.5 Эффективность

Как для меламина, так и для циануровой кислоты, эффективность, скорректированная по внутренним стандартам, была в диапазоне от 99% до 116%.

А.11.6 Прецизионность

Значения для предела относительной повторяемости и предела относительной внутрилабораторной воспроизводимости были получены в ходе небольшого межлабораторного исследования на базе ISO 5725-1 и ISO 5725-2 [7], но не соответствовали всем требованиям.

А.11.6.1 Предел относительной повторяемости

Типичные значения относительной повторяемости, полученные методом, описанным в настоящем стандарте, приведены в таблице А.7.

Таблица А.7 - Типичные значения относительной повторяемости

Аналит	Матрица	Относительное значение повторяемости, %	Диапазон содержания, мг/кг
Меламин	СМ	6	От 0,05 до 0,15
	PIF	12	От 0,05 до 0,15
	PIF	4	От 0,5 до 1,5
Циануровая кислота	СМ	8	От 0,1 до 0,2
	PIF	11	От 0,1 до 0,2
	PIF	5	От 0,5 до 1,5

А.11.6.2 Предел относительной внутрилабораторной воспроизводимости

Типичные значения относительной внутрилабораторной воспроизводимости, полученные методом, описанном в настоящем стандарте, приведены в таблице А.8.

Таблица А.8 - Типичные значения относительной внутрилабораторной воспроизводимости

Аналит	Матрица	Относительная внутрилабораторная воспроизводимость, %	Диапазон содержания, мг/кг
Меламин	СМ	13	От 0,05 до 0,15
	PIF	15	От 0,05 до 0,15
	PIF	6	От 0,5 до 1,5
Циануровая кислота	СМ	10	От 0,1 до 0,2
	PIF	31	От 0,1 до 0,2
	PIF	13	От 0,5 до 1,5

A.12 Примеры хроматограмм

"Рисунок А.1 - Пример хроматограмм LC-MS/MS меламина (MEL) и циануровой кислоты (СА) из экстракта коровьего молока, меченого изотопами, при концентрации меток: MEL = 0,05 мг/кг (IS = 1,0 мг/кг); СА = 0,10 мг/кг (IS = 1,0 мг/кг)"

"Рисунок А.2 - Пример хроматограмм LC-MS/MS меламина (MEL) и циануровой кислоты (СА) из экстракта меченой сухой молочной смеси для детей раннего возраста при концентрации меток: MEL 0,05 мг/кг (IS 0,1 мг/кг); СА 0,10 мг/кг (IS 0,1 мг/кг)"

"Рисунок А.3 - Пример хроматограмм LC-MS/MS меламина (MEL) и циануровой кислоты (СА) из экстракта меченой сухой молочной смеси для детей раннего возраста при концентрации меток: MEL 0,50 мг/кг (IS 1,0 мг/кг); СА 0,50 мг/кг (IS 1,0 мг/кг)"

А.13 Протокол испытания

Протокол испытания методом А должен включать по крайней мере следующую информацию:

a) все сведения, необходимые для полной идентификации пробы;

b) использованный метод отбора проб, если он известен;

c) использованный метод испытания со ссылкой на данное приложение (ISO/TS 15495/IDF/RM 230:2010, приложение А);

d) подробное описание процедур, не установленных в данном приложении или рассматриваемых, как дополнительные, напряду# с описанием всех случайностей, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;

e) полученный результат(ы) испытания;

f) если проверялась повторяемость (сходимость), то конечный результат.

_____________________________

*(1) CNLM-8150-1.2 - это торговая марка продукции, поставляемой лабораториями изотопов при Кембридже. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящим стандартом и не свидетельствует о предпочтении в отношении данного продукта. Можно использовать аналогичные продукты, при условии получения равноценных результатов.

*(2) HPLC Agilent 1100 это торговое наименование прибора, поставляемого Agilent. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящим стандартом и не свидетельствует о предпочтении в отношении данной продукции. Можно использовать аналогичную продукцию при условии получения равноценных результатов.

*(3) 4000 QTrap и Turbulon Spray это торговые наименования приборов, поставляемых Applied Biosystems. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящим стандартом и не свидетельствует о предпочтении со стороны ISO или IDF в отношении данной продукции. Можно использовать аналогичную продукцию при условии получения равноценных результатов.

*(4) TSKgel Amide-80 это торговое наименование прибора, поставляемого Tosoh Bioscience. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящим стандартом и не свидетельствует о предпочтении в отношении данной продукции. Можно использовать аналогичную продукцию при условии получения равноценных результатов.