Приложение В (справочное). Пример В - Количественный анализ меламина и циануровой кислоты в сухой молочной смеси для детей раннего возраста и коровьем молоке методом жидкостной хроматографии с использованием линейной масс-спектрометрии с ионной ловушкой

Приложение В
(справочное)

Пример В - Количественный анализ меламина и циануровой кислоты в сухой молочной смеси для детей раннего возраста и коровьем молоке методом жидкостной хроматографии с использованием линейной масс-спектрометрии с ионной ловушкой

B.1 Область применения

Данное приложение устанавливает метод, включающий определение меламина и циануровой кислоты в сухой молочной смеси для детей раннего возраста и в коровьем молоке с использованием метода линейной тандемной масс-спектрометрии с ионной ловушкой (LC-MS/MS), с источником ионизации электрораспылением в режиме мониторинга выбранных реакций (SRM). Количественное определение выполняется с помощью изотопного разбавления, используя меченые (, )-меламин и меченую (, )-циануровую кислоту в качестве внутренних стандартов (IS).

B.2 Термины и определения

См. раздел 3.

B.3 Сущность метода

Меланин и циануровую кислоту одновременно экстрагируют в ацетонитрил, осаждая белки. После центрифугирования надосадочную жидкость берут для последующего анализа LC-MS/MS с ионной ловушкой в режиме SRM. Меламин и циануровую кислоту анализируют отдельно в положительном и отрицательном режимах соответственно.

B.4 Реактивы

Используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если нет иных указаний, и дистиллированную или деминерализованную воду или воду аналогичной чистоты.

Примечание - Номера по CAS приведены для каждого реактива.

Перед использованием химических веществ см. соответствующие справочники или перечни безопасности, утвержденные местными органами.

B.4.1 Вода, для хроматографического анализа (CAS No. 7732-18-5).

B.4.2 Ацетонитрил (), градиентной чистоты для хроматографического анализа (CAS No. 75-05-8).

B.4.3 Ацетат аммония (), GR для анализа (CAS No. 631-61-8).

B.4.4 Раствор муравьиной кислоты (), соответствующий 1% кислоты по объему (CAS No. 64-18-6).

Пипеткой добавляют 10  муравьиной кислоты (CAS No. 64-18-6, марки ACS) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 1000  (В.5.8). Доводят до метки водой (В.4.1) и перемешивают.

B.4.5 Циануровая кислота , массовая доля, > 98% (CAS No. 108-80-5).

B.4.5.1 Исходный стандартный раствор циануровой кислоты, соответствующий массовой концентрации 0,1 мг циануровой кислоты на кубический сантиметр.

Берут навеску с точностью до 0,1 мг, 20 мг циануровой кислоты (В.4.5) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 200  (В.5.8). Растворяют и доводят до метки раствором муравьиной кислоты (В.4.4). Обрабатывают ультразвуком до полного растворения в течение 10 мин.

Исходный стандартный раствор циануровой кислоты можно хранить до 10 сут при температуре 4°С. Свежий исходный стандартный раствор готовят каждые 10 дней.

B.4.5.2 Рабочий раствор циануровой кислоты, соответствующий концентрации 10 мкг циануровой кислоты на кубический сантиметр.

Пипеткой приливают 10  исходного стандартного раствора циануровой кислоты (В.4.5.1) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 100  (В.5.8). Доводят до метки раствором муравьиной кислоты (В.4.4). Обрабатывают ультразвуком до полного растворения в течение не менее 10 мин.

Рабочий раствор циануровой кислоты можно хранить до 10 сут при температуре 4°С. Свежий исходный стандартный раствор готовят каждые 10 дней.

B.4.6 Меченая циануровая кислота (), изотопная чистота: = 99%; кольцо > 98%; химическая чистота 90% по массе, 100  в воде - 1,2 .

B.4.6.1 Исходный стандартный раствор меченой циануровой кислоты, соответствующий концентрации 100 мкг меченой циануровой кислоты на кубический сантиметр.

Исходный стандартный раствор меченой циануровой кислоты можно купить в готовом для использования виде в Лаборатории Изотопов при Кембридже (Cambridge Isotope Laboratories)*(1) (чистота 90% по массе). Хранят этот исходный раствор при комнатной температуре в защищенном от света месте.

В.4.6.2 Рабочий раствор меченой циануровой кислоты, соответствующий массовой концентрации 10 мкг меченой циануровой кислоты на кубический сантиметр.

Пипеткой приливают 1,1  исходного стандартного раствора меченой циануровой кислоты (В.4.6.1) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 10  (В.5.8). Доводят до метки раствором муравьиной кислоты (В.4.4) и перемешивают.

Рабочий раствор меченой циануровой кислоты используют в качестве внутреннего стандарта IS. Хранят раствор при температуре 4°С.

B.4.7 Меламин (), массовая доля > 98% (CAS No. 108-78-1).

B.4.7.1 Исходный стандартный раствор меламина, соответствующий массовой концентрации 0,1 мг меламина на кубический сантиметр.

Взвешивают с точностью до 0,1 мг, 20 мг меламина (Б.4.7) и переносят в мерную колбу с одной меткой вместимостью 200 мл (Б.5.8). Растворяют и доводят до метки раствором муравьиной кислоты (Б.4.4). Обрабатывают ультразвуком до полного растворения в течение не менее 10 мин.

Исходный стандартный раствор меламина можно хранить до 10 сут при температуре 4°С. Готовят свежий исходный стандартный раствор каждые 10 дней.

B.4.7.2 Рабочий раствор меламина I, соответствующий массовой концентрации 10 мкг меламина на кубический сантиметр.

Пипеткой приливают 10  исходного стандартного раствора меламина (В.4.7.1) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 100  (В.5.8). Доводят до метки раствором муравьиной кислоты (В.4.4). Обрабатывают ультразвуком до полного растворения в течение не менее 10 мин.

Рабочий раствор меламина I можно хранить до 10 сут при температуре 4°С. Готовят свежий рабочий раствор I каждые 10 дней.

B.4.7.3 Рабочий раствор меламина II, соответствующий массовой концентрации 1 мкг меламина на кубический сантиметр.

Пипеткой приливают 1  исходного стандартного раствора меламина I (В.4.7.2) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 10  (В.5.8). Доводят до метки раствором муравьиной кислоты (В.4.4). Обрабатывают ультразвуком до полного растворения в течение не менее 10 мин.

Рабочий раствор меламина II можно хранить до 10 сут при температуре 4°С. Готовят свежий рабочий раствор II каждые 10 дней.

B.4.8 Меченый меламин [], изотопная чистота: = 99%; амино- = 98%; химическая чистота 98% по массе, 100  в воде - 1,2 .

B.4.8.1 Исходный стандартный раствор меченого меламина, соответствующий массовой концентрации 100 мкг меченого меламина на кубический сантиметр.

Исходный раствор изотопа имеется в продаже. Хранят исходный стандартный раствор при комнатной температуре в защищенном от света месте.

B.4.8.2 Рабочий раствор меченого меламина, соответствующий концентрации 10 мкг меченого меламина на кубический сантиметр.

Пипеткой приливают 1  исходного стандартного раствора меченого меламина (В.4.8.1) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 10  (В.5.8). Доводят до метки раствором муравьиной кислоты (В.4.4).

Рабочий раствор меченого меламина используется в качестве внутреннего стандарта (IS). Хранят раствор при температуре 4°С.

В.5 Аппаратура

Стеклянная посуда (например, мерные колбы, В.5.8) используемая для приготовления стандартных исходных и рабочих растворов, может загрязниться, особенно меламином. Поэтому всю стеклянную посуду следует мыть лабораторным детергентом, споласкивать дистиллированной водой и затем сушить на воздухе.

Используют обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.

B.5.1 Центрифужные пробирки, конические, из полипропилена, вместимостью 50 , например, 21008-169*(2).

B.5.2 Центрифуга, оснащенная ротором, приспособленная под пробирки вместимостью 50 , с ускорением 4 000g, например, RC6*(3)

B.5.3 Колонка HPLC, ZIC-HILIC*(4), 2,1 мм х 150 мм, 5 мкм, 20 нм.

B.5.4 Пластиковые шприцы, вместимостью 3  , Norm-Ject*(2).

B.5.5 Шприцевые фильтры, Acrodisc 13 мм, мембрана из нейлона 0,2 мкм, например, 28143-985*(2).

B.5.6 Насос HPLC Surveyor MS*(5) соединенный с линейным масс-спектрометром LTQ-XL*(5) с ионной ловушкой, оснащенный источником ионизации электрораспылением.

B.5.7 Аналитические весы, обеспечивающие считывания с точностью до 0,1 мг.

B.5.8 Мерные колбы с одной меткой вместимостью 10, 100, 200 и 1000 , ISO 1042 [6], класс А.

В.6 Приготовление реактивов

В.6.1 Градуировочная кривая для меламина и циануровой кислоты

В.6.1.1 Стандартные растворы для меламина (от 0 до 5 ) с соответствующим внутренним стандартом меламина IS (при концентрации 100 )

Готовят стандартные растворы меламина в шести отдельных мерных колбах с одной меткой вместимостью 10 см (В.5.8) в соответствии с таблицей В.1. Хранят стандартные растворы меламина при температуре 4°С.

Таблица A.9 - Стандартные растворы меламина

Наименование показателя	Стандартный раствор
	1	2		3		4	5	6
Рабочий раствор меламина I (В.4.7.2), мкл	0		0		100	200	450		700
Рабочий раствор меламина II (В.4.7.3), мкл	0		150		0	0	0		0
Рабочий раствор меченого меламина (IS) (В.4.8.2), мкл	150		150		150	150	150		150
Ацетонитрил (В.4.2), мкл	9850		9700		9750	9650	9400		9150
Это соответствует: концентрации меламина,	0		15		100	200	450		700
концентрации меченого меламина (IS), содержанию меламина (эквивалентно пробе), мг/кг содержанию меламина IS (эквивалентно пробе), мг/кг	150		150		150	150	150		150
	0,00		0,10		0,66	1,33	3,00		4,66
	1,00		1,00		1,00	1,00	1,00		1,00

В.6.1.2 Стандартные растворы для циануровой кислоты (от 0 до 5 ) с соответствующим внутренним стандартом циануровой кислоты (IS) (при концентрации 0,66 )

Готовят смешанные стандартные растворы циануровой кислоты в шести отдельных мерных колбах с одной меткой вместимостью 10  (В.5.8) в соответствии с таблицей В.2. Хранят стандартные растворы циануровой кислоты при температуре 4°С.

Таблица А.10 - Стандартные растворы циануровой кислоты

Наименование показателя	Стандартный раствор
	1	2	3	4	5	6
Рабочий раствор циануровой кислоты (Б.4.5.2), мкл	0	25	100	200	550	700
Рабочий раствор меченой циануровой кислоты IS (Б.4.6.2), мкл	100	100	100	100	100	100
Ацетонитрил (Б.4.2), мкл	9900	9875	9800	9700	9350	9200
Это соответствует: концентрации циануровой кислоты,	0	25	100	200	550	700
концентрации циануровой кислоты IS, содержанию циануровой кислоты (эквивалентно пробе), мг/кг содержанию циануровой кислоты IS (эквивалентно пробе), мг/кг	100	100	100	100	100	100
	0,00	0,17	0,66	1,33	3,66	4,66
	0,66	0,66	0,66	0,66	0,66	0,66

В.6.2 Растворы для жидкостной хроматографии

В.6.2.1 Подвижная фаза А, водный раствор ацетата аммония, 10 в 1+1 смеси ацетонитрила с водой.

Переносят 0,77 г ацетата аммония в мерную колбу с одной меткой вместимостью 1000  (В.5.8). Добавляют 500  воды (В.4.1) и растворяют ацетат аммония. Доводят до метки ацетонитрилом (В.4.2) и перемешивают. Фильтруют раствор через фильтр пористостью 0,2 мкм (В.5.5).

В.6.2.2 Подвижная фаза В, ацетонитрил.

Используют ацетонитрил (В.4.2).

В.7 Отбор проб

Отбор проб не является частью метода, установленного в данном приложении. Рекомендуемый метод отбора проб - по ISO 707/IDF 50 [2].

Важно, чтобы в лаборатории была получена действительно репрезентативная проба, которая не претерпела повреждений и изменений в процессе транспортирования и хранения.

Сырое молоко хранят при температуре 4°С или в замороженном состоянии, если анализ не будет проводиться непосредственно по получении.

В.8 Подготовка проб для анализа

В.8.1 Сухая молочная смесь для детей раннего возраста

Готовят гомогенную лабораторную пробу путем переноса ее в емкость для пробы вместимостью, в два раза превышающей объем лабораторной пробы. Немедленно закрывают емкость. Тщательно перемешивают, многократно встряхивая и переворачивая емкость

B.8.2 Коровье молоко

Доводят пробу до комнатной температуры. Перед тем, как взять навеску для анализа, убеждаются, что проба гомогенная осторожным перевертыванием емкости несколько раз.

В.9 Проведение

B.9.1 Методика экстракции

Взвешивают с точностью до 0,01 г 3,00 г молочной смеси для детей раннего возраста (В.8.1) или коровьего молока (В.8.2) в центрифужную пробирку вместимостью 50  (В.5.1). Добавляют 300 мкл рабочего раствора меченого меламина (IS) (В.4.8.2). Добавляют 200 мкл рабочего раствора меченой циануровой кислоты (IS) (В.4.6.2). Затем добавляют 19,5  ацетонитрила (В.4.2) и энергично встряхивают, пока не убедятся в отсутствии сгустков.

Анализируемый раствор обрабатывают ультразвуком в течение 5 мин, затем перемешивают в течение 5 мин. Центрифугируют раствор для анализа при 4000 g при комнатной температуре в течение 10 мин. Отбирают примерно 2  надосадочной жидкости пластиковым шприцем и фильтруют через шприцевой фильтр (В.5.5) в пробирку для анализа HPLC.

B.9.2 Анализ LC-MS/MS

Вводят раствор в хроматограф/масс-спектрометр (LC/MS) для анализа.

Примечание - Меламин и циануровую кислоту обнаруживают по отдельности в разных прогонах на LC/MS.

В.9.2.1 Условия HPLC

Подвижная фаза А:	раствор ацетата аммония (В.6.2.1);
подвижная фаза В:	ацетонитрил (В.6.2.2);
вводимый объем:	10 мкл;
колонка:	ZIC-HILIC, 2,1 х 150 мм, 5 мкм, 20 нм;
температура:	комнатная температура
скорость потока:	0,4 ;
градиент:	См. таблицу В.3;
отводный клапан:	поток HPLC направляется на детектор течение 4 - 9 мин.

Таблица А.11 - Градиент LC, используемый при анализе меламина или циануровой кислоты

Время, мин	А, %	В, %
0	3	97
2	3	97
2,5	20	80
11	20	80
11,5	3	97
16	3	97

Условия HPLC для анализа меламина и циануровой кислоты идентичны. В таких условиях время удерживания как для меламина, так и для циануровой кислоты составляет ~ 5 мин.

В.9.2.2 Параметры MS

Настройка на анализируемое вещество выполняется посредством впрыскивания шприцем по отдельности стандартного раствора меламина и стандартного раствора циануровой кислоты в концентрации 10 . Скорость впрыскивания шприцем поддерживают постоянной на уровне 5 мкл/мин, используя тройник при скорости потока HPLC, равной 0,4 мл/мин. Поток HPLC выдерживают в соотношении 20% А и 80% В. Условия работы прибора для анализа меламина и циануровой кислоты приведены в таблицах В.4 - В.6.

Таблица А.12 - Типичные параметры MS для меламина

Параметры	Линейная ионная ловушка LTQ-XL
Тип ионизации	Электрораспыление (ESI)
Напряжение электрораспыления	5 кВ
Полярность	Положительные ионы
Температура передаточной трубки	350°С
Газ	Защитный газ: 60 условных единиц.; вспомогательный газ: 20 условных единиц.; продувочный газ: 0
Ток распыления	5,6 мкА
Напряжение капилляра	20 В
Максимальное время ввода	100 мс

Таблица A.13 - Типичные параметры MS для циануровой кислоты

Параметры	Линейная ионная ловушка LTQ-XL
Тип ионизации	Электрораспыление(ESI)
Напряжение электрораспыления	4 кВ
Полярность	Отрицательные ионы
Температура передаточной трубки	400°С
Газ	Защитный газ: 60 условных единиц; вспомогательный газ: 20 условных единиц.; продувочный газ: 0
Ток распыления	4,3 мкА
Напряжение капилляра	14 В
Максимальное время ввода	100 мс

Таблица А.14 - Реакции перехода, наблюдаемые в ионной ловушке в процессе анализа меламина, циануровой кислоты и их соответствующих внутренних стандартов

Аналит	Реакции перехода (m/z)(а)
Меламин	127,185,1 (24)
Меченый меламин [] (IS)	133,189,1 (24)
Циануровая кислота	128,085,0 (24)
Меченая циануровая кислота () (IS)	134,088,9 (24)
(а) Энергии столкновений (в электрон-вольтах приведены в скобках.

В.10 Расчет и обработка результатов

В.10.1 Расчеты

Примечание - Градуировочная кривая типа

,

где - соотношение площадей;

- наклон;

- массовая доля;

- отсекаемый отрезок.

Рассчитывают содержание аналита, , в миллиграммах на килограмм (если определяют меламин, = ; если определяют циануровую кислоту, = ), с использованием следующего уравнения:

,

где - отсекаемый отрезок линии регрессии;

- наклон линии регрессии;

- масса, в граммах, анализируемой пробы (В.9.1).

В.10.2 Обработка результатов

Результаты для аналита(ов) выражают с точностью до двух знаков после запятой.

В.11 Рабочие характеристики

B.11.1 Линейность

Градуировочная кривая для меламина линейна в диапазоне концентраций от 0 до 5 мг/кг (эквивалент содержания в пробе). Для циануровой кислоты кривая линейна на участке от 0 до 7 мг/кг (эквивалент содержания в пробе).

B.11.2 Выход аналита

В 16 проб молочной смеси для детей раннего возраста добавили меламин и циануровую кислоту в количестве, кратном 0,1; 0,5; 1,0 и 1,5 от максимального уровня (ML).

Средний выход меламина составил 99%, а циануровой кислоты - 105%.

B.11.3 Пределы обнаружения

LoD (отношение сигнал-шум составляет 3) для определения содержания меламина равны 0,08 мг/кг в молочных смесях для детей раннего возраста и 0,07 мг/кг в коровьем молоке, соответственно.

LoD для определения содержания циануровой кислоты равны 0,10 мг/кг в молочных смесях для детей раннего возраста и 0,07 мг/кг в коровьем молоке соответственно.

B.11.4 Пределы количественного анализа

LoQ (самый низкий достоверный уровень) для определения содержания меламина равны 0,11 мг/кг в молочных смесях для детей раннего возраста и 0,10 мг/кг в коровьем молоке соответственно.

LoQ для определения содержания циануровой кислоты равны 0,13 мг/кг в молочных смесях для детей раннего возраста и 0,10 мг/кг в коровьем молоке соответственно.

B.11.5 Пределы принятия решения и возможности детектирования в молочной смеси для детей раннего возраста для меламина и циануровой кислоты

Учитывая, что максимальный предел (ML) составляет 1 мг/кг в молочной смеси, пределы принятия решения и возможности детектирования были рассчитаны после повышения концентрации 20 проб молочной смеси при ML, равном 1 мг/кг; результаты приведены в а) и b).

g)	Для меламина: = 1,06 мг/кг; = 1,16 мг/кг;
h)	Для циануровой кислоты:	= 1,11 мг/кг; = 1,19 мг/кг.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Эти значения получены в условиях повторяемости и должны быть проверены в условиях воспроизводимости, прежде чем пользоваться ими.

B.11.6 Прецизионность

B.11.6.1 Повторяемость

Типичные значения повторяемости, полученные одним и тем же оператором в одной и той же лаборатории с помощью данного метода, следующие:

i) для меламина: 8% в интервале содержания от 0,5 до 1,5 мг/кг;

j) для циануровой кислоты: 9% в интервале содержания от 0,5 до 1,5 мг/кг.

Примечание - Эти значения были рассчитаны как коэффициент вариации и повторяемости для серии анализов. Три серии анализов были выполнены при концентрациях 0,5, 1,0 и 1,5 мг/кг. В этих трех случаях для каждой серии составило 8% для меламина и 9% для циануровой кислоты.

B.11.6.2 Воспроизводимость

Не определялась.

В.12 Результаты анализа проб в рисунках

См. Рисунки В.1 и В.2.

"Рисунок В.1 - Хроматограмма LC-MS/MS меламина (MEL) из экстракта детской молочной смеси NIST при концентрации введенного вещества: MEL = 0,50 мг/кг"

"Рисунок В.2 - Хроматограмма LC-MS/MS циануровой кислоты (СА) из экстракта детской молочной смеси NIST при концентрации введенного вещества: СА = 0,50 мг/кг"

В.13 Протокол испытания

Протокол испытания должен включать, как минимум, следующую информацию:

k) все сведения, необходимые для полной идентификации пробы;

I) использованный метод отбора проб, если известен;

m) использованный метод анализа, со ссылкой на данное приложение (ISO/TS 15495/IDF/RM 230:2010, приложение В);

n) все детали операций, не установленные в данном приложении или рассматриваемые как необязательные, наряду с описанием случайностей, которые могли повлиять на результат(ы) анализа;

о) полученные результаты испытания;

р) если проверена повторяемость, то конечный полученный результат.

_____________________________

*(1) Лаборатории изотопов при Кембридже являются примером подходящего поставщика. Эта информация приведена только для удобства пользователей данного документа и не свидетельствует о предпочтении в отношении данного реактива. Можно использовать аналогичные продукты, при условии получения равноценных результатов.

*(2) 21008-169, Norm-Ject (53548-014) и 281343-985 - это торговые наименования продукции, поставляемой VWR. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о предпочтении в отношении данного продукта. Можно использовать аналогичные продукты, при условии получения равноценных результатов.

*(3) RC6 - это торговое наименование продукции, поставляемой Sorvall. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о предпочтении в отношении данного продукта. Можно использовать аналогичные продукты, при условии получения равноценных результатов.

*(4) ZIC-HILIC - это торговое наименование продукции, поставляемой Merck и имеющейся в Nest Group, article Q150454. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о предпочтении в отношении данного продукта. Можно использовать аналогичные продукты, при условии получения равноценных результатов.

*(5) Surveyor MS и LTQ-XL - это торговые наименования продукции, поставляемой ThermoElectron. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о предпочтении в отношении данного продукта. Можно использовать аналогичные продукты, при условии получения равноценных результатов.