Национальный стандарт РФ ГОСТ Р ЕН 14105-2008 "Производные жиров и масел. Метиловые эфиры жирных кислот (FAME). Определение содержания свободного и общего глицерина, моно-, ди-, триглицеридов (метод сравнения)" (утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 25 декабря 2008 г. N 691-ст)

Fat and oil derivatives. Fatty acid methyl esters (FAME). Determination of free and total glycerol and mono-, di-, triglyceride contents (reference method)

Дата введения - 1 января 2010 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

1 Область применения

1.1 Настоящий стандарт устанавливает метод определения свободного глицерина и моно-, ди-, триглицеридов, содержащихся в метиловых эфирах жирных кислот (FAME), предназначенных для добавления к минеральным маслам, и распространяется на FAME из рапсового, подсолнечного и соевого масел. Общее содержание глицерина рассчитывают из полученных результатов содержания свободного глицерина и моно-, ди-, триглицеридов.

Для FAME, произведенных из кокосового и пальмового масел, из-за частичного перекрывания пиков, настоящий метод непригоден.

Предупреждение - Применение настоящего стандарта связано с использованием в процессе определения опасных материалов, операций и оборудования. В настоящем стандарте не предусмотрено рассмотрение всех вопросов обеспечения безопасности, связанных с его использованием. Пользователь настоящего стандарта несет ответственность за установление соответствующих правил по технике безопасности и охране здоровья персонала, а также определяет целесообразность применения законодательных ограничений перед его использованием.

2 Сущность метода

Настоящий метод заключается в превращении глицерина, моно-, ди-, триглицеридов в более летучие силильные производные в присутствии пиридина и N-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамида (MSTFA).

Анализ силильных производных осуществляют методом газовой хроматографии на короткой капиллярной колонке с тонким слоем неподвижной фазы, с инжектором ввода образца в колонку с пламенно-ионизационным детектором или на аналогичном оборудовании.

После проведения процедуры калибровки испытание образца выполняют в присутствии двух внутренних стандартов:

- 1,2,4-бутантриола, предназначенного для определения свободного глицерина;

- 1,2,3-трикапроилглицерина (трикаприна), предназначенного для определения моно-, ди- и триглицеридов.

3 Реактивы и материалы

Следует использовать реактивы только высоких классов чистоты, за исключением специально оговоренных.

3.1 N-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамид (MSTFA).

3.2 Пиридин, который следует хранить над молекулярным ситом.

3.3 н-Гептан.

3.4 1,2,4-Бутантриол (внутренний стандарт N 1).

3.5 1,2,3-Трикапроилглицерин (трикаприн) (внутренний стандарт N 2).

3.6 Стандартные образцы: глицерин, 1-моноолеоилглицерин (моноолеин), 1,3-диолеоилглицерин (диолеин), 1,2,3-триолеоилглицерин (триолеин) со степенью чистоты, отвечающей требованиям газожидкостной хроматографии (GLC).

3.7 Внутренний стандарт N 1, исходный раствор концентрацией 1 .

Аккуратно взвешивают приблизительно 50 мг (с точностью до 0,1 мг) 1,2,4-бутантриола (3.4) в мерной колбе вместимостью 50  (4.4) и доводят до метки пиридином (3.2).

3.8 Внутренний стандарт N 2, исходный раствор концентрацией 8 .

Аккуратно взвешивают приблизительно 80 мг (с точностью до 0,1 мг) 1,2,3-трикапроилглицерина (3.5) в мерной колбе вместимостью 10  (4.5) и доводят до метки пиридином (3.2).

3.9 Исходный раствор глицерина концентрацией 0,5 .

Взвешивают 50 мг (с точностью до 0,1 мг) глицерина (3.6) в мерной колбе вместимостью 10  (4.5) и доводят до метки пиридином (3.2). Используя пипетку (4.7), переносят 1  этого раствора в мерную колбу вместимостью 10  (4.5) и доводят до метки пиридином (3.2).

3.10 Исходные растворы глицеридов концентрацией 5 .

Взвешивают 50 мг (с точностью не менее 0,1 мг) каждого стандартного глицерида - моно-, ди- и триолеина (3.6) в мерные колбы вместимостью 10  (4.5) и доводят до метки пиридином (3.2).

3.11 Моноглицериды1), товарная смесь.

В этой смеси монопальмитоилглицерин (монопальмитин), моностеароилглицерин (моностеарин) и моноолеоилглицерин (моноолеин) присутствуют в равных по массе количествах.

Готовят исходный раствор этой смеси, взвешивая приблизительно 100 мг в мерной колбе вместимостью 10 (4.5), и доводят до метки пиридином (3.2).

3.12 Калибровочные растворы

Готовят ежедневно четыре калибровочных раствора, помещая с помощью микрошприцев (4.8 и 4.9) в ампулы (4.6) объемы исходных растворов стандартных образцов (3.9 и 3.10) и внутренних стандартов (3.7 и 3.8), указанные в таблице 1. Выбор подходящих шприцев должен быть сделан в соответствии с таблицей 1. Не следует максимально заполнять шприцы, следует переносить необходимый объем в два приема (т.е. в случае перенесения 100 мкл используют шприц вместимостью 100 мкл, загружая его дважды по 50 мкл). Следует убедиться, что игла и сам шприц свободны от пузырьков воздуха, а объемы измеряют только по разности (например, когда готовят 80 мкл, то заполняют шприц до 100 мкл и сливают раствор до метки 20 мкл).

Примечание - Стандартные растворы силильных производных стабильны в течение суток.

Таблица 1 - Приготовление калибровочных растворов

Калибровочный раствор	1	2	3	4	Вместимость шприца, мкл
Глицерин, мкл	10	40	70	100	100
Моноолеин, мкл	50	120	190	250	500
Диолеин, мкл	10	40	70	100	100
Триолеин, мкл	10	30	60	80	100
Внутренний стандарт N 1, мкл	80	80	80	80	100
Внутренний стандарт N 2, мкл	100	100	100	100	500

3.13 Газ-носитель: водород или гелий.

3.14 Вспомогательные газы:

- воздух;

- водород.

4 Аппаратура

Стандартное лабораторное оборудование:

4.1 Газовый хроматограф, снабженный инжектором ввода образца в колонку или аналогичным устройством, термостатом с программированием температуры и пламенно-ионизационным детектором.

4.2 Капиллярная колонка, которую можно программировать до 400°С (высокотемпературного типа), со следующими характеристиками:

- неподвижная фаза - 100% диметилполисилоксан или смесь 95% диметилполисилоксана с 5% дифенилполисилоксана;

- длина - 10 м;

- внутренний диаметр - 0,32 мм;

- толщина пленки неподвижной фазы - 0,1 мкм.

4.3 Условия проведения анализа

Условия хроматографического анализа выбирают с учетом характеристики используемой колонки и типа газа-носителя (водорода или гелия). Для обеспечения элюирования триглицеридов рекомендуемое время анализа должно быть не менее 30 мин.

Ниже приведены в качестве примера ориентировочные условия проведения анализа:

температура колонки - 50°С поддерживают в течение 1 мин;

затем нагревают до 180°С со скоростью 15°С/мин;

затем нагревают до 230°С со скоростью 7°С/мин;

затем нагревают до 370°С со скоростью 10°С/мин;

конечную температуру поддерживают в течение 5 мин;

температура детектора - 380°С;

давление газа-носителя (водорода) - 80 кПа;

объем вводимой пробы - 1 мкл.

4.4 Мерная колба вместимостью 50 .

4.5 Мерная колба вместимостью 10 .

4.6 Ампула (виала) с завинчивающейся пробкой с прокладкой, покрытой политетрафторэтиленом (PTFE), вместимостью 10 .

4.7 Поверенная пипетка вместимостью 1 .

4.8 Микрошприц вместимостью 100 мкл.

4.9 Микрошприц вместимостью 500 мкл.

4.10 Микрошприц вместимостью 1 мкл, предназначенный для ввода пробы в колонку.

4.11 Мерный цилиндр вместимостью 10 .

4.12 Аналитические весы с погрешностью взвешивания (0,1) мг.

5 Проведение испытания

5.1 Приготовление и анализ калибровочных растворов

Используя микрошприц (4.8), добавляют 100 мкл MSTFA (3.1) в каждый из четырех калибровочных растворов (3.12), закрывают герметично ампулы и энергично встряхивают, при этом избегают контакта с влагой. Выдерживают 15 мин при комнатной температуре, затем добавляют 8  н-гептана (3.3), используя мерный цилиндр (4.11). Анализируют 1 мкл каждой реакционной смеси методом газовой хроматографии при условиях, указанных в 4.3. Каждую реакционную смесь анализируют дважды. Образцы стабильны в течение нескольких часов после завершения реакции.

5.2 Приготовление и анализ товарной смеси моноглицеридов

Используя микрошприцы (4.8 и 4.9), переносят 200 мкл товарной смеси моноглицеридов, растворенной в пиридине (3.11), и 100 мкл MSTFA (3.1) в ампулу вместимостью 10  (4.6). Избегают контакта с влагой. Закрывают герметично ампулу и энергично встряхивают. Выдерживают 15 мин при комнатной температуре, затем добавляют 8  н-гептана (3.3). Анализируют 1 мкл смеси методом газовой хроматографии при условиях, указанных в 4.3.

5.3 Отбор проб

В настоящем стандарте не описан метод отбора проб. Отбор проб рекомендуется проводить в соответствии со стандартом [1].

5.4 Приготовление и анализ образцов

Взвешивают приблизительно 100 мг гомогенизированного образца, помещают в ампулу вместимостью 10  (4.6). Используя микрошприцы (4.8 и 4.9), добавляют 80 мкл внутреннего исходного стандартного раствора N 1 (3.7), 100 мкл внутреннего исходного стандартного раствора N 2 (3.8) и 100 мкл MSTFA (3.1). Избегают контакта с влагой. Закрывают герметично ампулу и энергично встряхивают. Раствор выдерживают 15 мин при комнатной температуре, затем добавляют 8  н-гептана (3.3). Анализируют 1 мкл реакционной смеси методом газовой хроматографии при условиях по 4.3.

Для анализа берут две порции образца, каждую порцию анализируют методом газовой хроматографии. Порции образцов стабильны в течение нескольких часов после завершения реакции.

5.5 Идентификация

Анализ калибровочных растворов при тех же условиях, что были использованы для анализа образца, позволяет идентифицировать пики путем сравнения времени удерживания. За счет перекрывания зон элюирования метиловых эфиров и моноглицеридов рекомендуется для идентификации пиков моноглицеридов ввести товарную смесь, содержащую монопальмитин, моностеарин и моноолеин (3.11), анализ которой был проведен в 5.2.

Хроматограмма образца метилового эфира рапсового масла, полученная при условиях анализа, описанных в 4.3 и 5.4, представлена в приложении С (рисунки С.1 - С.4). Относительные времена удерживания, соответствующие различным пикам, площади которых были суммированы, приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Относительные времена удерживания (RRT) глицерина и глицеридов

Соединение	Относительное время удерживания/внутренний стандарт N 1(RRT/IS 1)	Относительное время удерживания/внутренний стандарт N 2(RRT/IS 2)
Глицерин	0,75	-
1,2,4-бутантриол (внутренний стандарт N 1 - IS 1)	1,00	-
Монопальмитин	-	0,61
Моноолеин, монолинолеин, монолиноленин	-	0,68
Моностеарин	-	0,69
Трикаприн (внутренний стандарт N 2 - IS 2)	-	1,00
Диглицериды	-	От 1,19 до 1,30
Триглицериды	-	От 1,56 до 1,65

5.6 Построение калибровочных кривых

Анализ изменения соотношений масс в зависимости от соотношения площадей пиков дает возможность проверить линейность сигнала и построить калибровочную кривую для каждого стандартного вещества (моноолеин, диолеин и триолеин).

6 Обработка результатов

6.1 Суммирование площадей пиков

Приведенные ниже калибровочные уравнения (6.2 и 6.3) могут быть использованы только для диапазонов содержания соединений, указанных в таблице 3.

Таблица 3 - Диапазоны содержания соединений

Соединение	Соотношение масс соединений (m/ )	Содержание соединения, % масс.
Глицерин	От 0,06 до 0,62	От 0,005 до 0,05
Моноглицериды	От 0,31 до 1,56	От 0,25 до 1,25
Диглицериды	От 0,06 до 0,62	От 0,05 до 0,5
Триглицериды	От 0,06 до 0,50	От 0,05 до 0,4

На хроматограмме каждой группы глицеридов присутствуют небольшие пики (приложение С), которые должны быть суммированы и для которых калибровочные уравнения не могут быть применены из-за их диапазонов, не соответствующих таблице 3. Настоящий метод позволяет рассчитать массовую долю моно-, ди- и триглицеридов (6.5) путем суммирования площадей пиков для каждой группы соединений, теоретически же метод позволяет, при необходимости, рассчитать процентное содержание каждого пика глицерида, взятого индивидуально.

Рассмотрение площадей двух пиков по отдельности может вызвать количественные ошибки, поэтому при расчете результата два пика основной группы диглицеридов, содержащих 36 атомов углерода, целесообразно суммировать. Такая же процедура может быть применена для пиков диглицерида, содержащих 34 атома углерода и для пиков диглицеридов, содержащих 38 атомов углерода.

При наличии двойных пиков в области времени удерживания глицерина необходимо проверить протекание реакции силилирования, которая может быть не завершена (из-за присутствия воды в образцах).

6.2 Калибровочная функция глицерина

Калибровочную функцию рассчитывают по следующей формуле, полученной из экспериментальных данных при использовании метода линейной регрессии (приложение А)

,

(1)

где - масса глицерина, мг;

- масса внутреннего стандарта N 1, мг;

и - константы регрессионной зависимости для глицерина;

- площадь пика глицерина;

- площадь пика внутреннего стандарта N 1.

Калибровочная функция считается приемлемой только в том случае, если коэффициент корреляции, рассчитанный в соответствии с приложением А, равен или больше 0,95.

6.3 Калибровочные функции глицеридов

Калибровочные функции рассчитывают на основе следующих формул, полученных из экспериментальных данных при использовании метода линейной регрессии (см. приложение А для обработки данных):

;

(2)

;

(3)

,

(4)

где , , - массы соответственно моноолеина, диолеина, триолеина, мг;

- масса внутреннего стандарта N 2, мг;

и - константы регрессионной зависимости для моноглицерина;

и - константы регрессионной зависимости для диглицерина;

и - константы регрессионной зависимости для триглицерина;

- площадь пика внутреннего стандарта N 2.

Калибровочные функции могут быть рассмотрены как допустимые, если коэффициент корреляции, рассчитанный в соответствии с приложением А, равен или больше 0,95.

6.4 Расчет массовой доли свободного глицерина

Рассчитывают массовую долю, % масс, свободного глицерина в образце по формуле

,

(5)

где - массовая доля свободного глицерина в образце, % масс;

и -константы, полученные методом регрессии для глицерина;

- площадь пика глицерина, ;

- площадь пика внутреннего стандарта N 1, ;

- масса внутреннего стандарта N 1, мг;

- масса образца, мг.

6.5 Расчет массовой доли глицеридов

Рассчитывают массовую долю, % масс, моно-, ди- и триглицеридов по формулам:

;

(6)

;

(7)

,

(8)

где , , - массовые доли соответственно моно-, ди-, три-глицеридов в образце, % масс.;

и - константы регрессионной зависимости для моноглицерина;

и - константы регрессионной зависимости для диглицерина;

- константы регрессионной зависимости для григлицерина;

, , - суммы площадей пиков соответственно моно-, ди, триглицеридов, ;

- площадь пика внутреннего стандарта N 2, мг;

- масса внутреннего стандарта N 2, мг;

- масса образца, мг.

6.6 Расчет массовой доли общего глицерина

Рассчитывают массовую долю общего глицерина в образце, % масс., по формуле

,

(9)

где GT - массовая доля общего глицерина (свободного и связанного) в образце, % масс;

G - массовая доля свободного глицерина в образце, % масс;

М - массовая доля моноглицеридов в образце, % масс;

D - массовая доля диглицеридов в образце, % масс;

Т - массовая доля триглицеридов в образце, % масс

6.7 Запись результатов

Все полученные значения массовых долей выражают в процентах с точностью до 0,01%.

7 Прецизионность

7.1 Межлабораторные испытания

Во время межлабораторных испытаний, проведенных в 1988 г. с участием 11 лабораторий европейских стран, в каждой из которых проведено по два испытания каждого образца, были получены статистические результаты, приведенные в приложении D.

7.2 Повторяемость (сходимость)

Расхождение между двумя независимыми единичными результатами испытания, полученными при использовании одного и того же метода испытания на идентичном испытуемом материале в одной и той же лаборатории одним и тем же оператором с использованием одного и того же оборудования в короткий промежуток времени, не должно превышать значений, представленных в таблице 4, более чем в одном случае из двадцати.

Таблица 4 - Значения повторяемости

Соединение	Повторяемость (сходимость) г, % масс.
Свободный глицерин	0,0538Х + 0,0014
Моноглицериды	0,119Х + 0,004
Диглицериды	0,060Х + 0,004
Триглицериды	0,1565Х + 0,004
Общий глицерин	0,0687Х + 0,004
Примечание - X - среднее значение двух результатов испытаний.

7.3 Воспроизводимость

Расхождение между двумя единичными результатами испытания, полученными при использовании одного и того же метода испытания на идентичном испытуемом материале в разных лабораториях разными операторами с использованием разного оборудования, не должно превышать значений, представленных в таблице 5, более чем в одном случае из двадцати.

Таблица 5 - Значения воспроизводимости

Соединение	Воспроизводимость R, % масс.
Свободный глицерин	0,5983Х + 0,003
Моноглицериды	0,124Х + 0,133
Диглицериды	0,192Х + 0,025
Триглицериды	0,2099Х + 0,0641
Общий глицерин	0,4472Х - 0,01
Примечание - X - среднее значение двух результатов испытаний.

8 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен включать:

- всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;

- используемый метод отбора проб, если известен;

- используемый метод испытания со ссылками на настоящий стандарт;

- все детали операции, не описанные в настоящем стандарте или считаемые незначительными, вместе с подробностями любых случайностей, которые могут повлиять на результаты испытания;

- полученные результаты испытания или, если проверена повторяемость, то конечный полученный результат.

________________

1) Продукты поставляются, например, компанией SIGMA, номер по каталогу - 178-8. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.