Приложение 7.5 (Справочное). Использование полимеразной цепной реакции

Приложение 7.5
(Справочное)

Использование полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в условиях работы СПЭБ используется для:

- идентификации выделенных культур чумы, холеры, сибирской язвы и других возбудителей опасных инфекционных заболеваний;

- оценки эпидемиологической значимости возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы.

Идентификация культур осуществляется по наличию специфичных для определенных видов микроорганизмов нуклеотидных последовательностей. Эпидемиологическая значимость определяется по наличию нуклеотидных последовательностей, детерминирующих признаки патогенности бактерий. В организационном и методическом плане следует руководствоваться в целом "Методическими указаниями по детекции патогенной микрофлоры в клиническом материале, пищевых продуктах, объектах внешней среды и выполнению идентификации клеток с помощью полимеразной цепной реакции" (М., 1996). Учитывая полевые условия работы, под данные исследования следует выделить два помещения: в первом приготавливаются реакционные смеси и ставится ПЦР, а во втором осуществляется детекция продуктов амплификации.

Подготовка проб

При исследовании чистой культуры используется метод кипячения в дистиллированной воде.

С этой целью делают суспензию исследуемого штамма в дистиллированной воде в концентрации мк кл/мл. Суспензию прогревают на водяной бане при 100°С в течение 10-15 мин. Смесь объемом 0,5 мл переносят в микроцентрифужные пробирки и центрифугируют при 12000 об./мин в течение 5 минут. Супернатант используют для постановки ПЦР. Ткани биопробных животных с места введения растирают в фарфоровой ступке с дистиллированной водой. Отбирают 200-300 мкл надосадочной жидкости. Выделение плазмидной ДНК осуществляют методом щелочного лизиса взвеси с последующей депротеинизацией фенолхлороформной смесью и переосаждением ДНК в этаноле.

Проведение ПЦР осуществляют в соответствии с инструкцией фирмы изготовителя набора диагностического для выявления ДНК возбудителя чумы, холеры и т.п. методом ПЦР. Для подготовки проб сибиреязвенного микроба также может быть использован метод кипящей взвеси штаммов после подращивания в питательном бульоне. С этой целью исследуемая колония засевается в среду BHI и инкубируется в течение 2,5 час. при 37°С с аэрацией, затем добавляется пенициллин из расчета 1000 ед./мл, посев инкубируется еще 20 минут, после чего пробу кипятят 20 минут в водяной бане и 5-7 мкл используют для постановки реакции.

Учет результатов методом гельэлектрофореза

Продукты ПЦР анализируют с помощью электрофореза в 2% агаровом геле в ТАЕ буфере, содержащем бромистый этидий (0,5 мкг/мл). Смесь 10 мкл ПЦР-продукта и 1 мкл буфера для нанесения образца вносят в лунки агарозного геля. Электрофорез ДНК проводят при напряжении электрического тока 5-10 в/см. Фрагменты анализируемой ДНК выявляют под ультрафиолетом на трансиллюминаторе.

Результаты учитывают по наличию полос ДНК, расположенных на том же уровне, что и в положительном контроле.

Оборудование, реактивы и материалы

Программируемый термоциклер (амплификатор), аппарат для ДНК электрофореза, источник постоянного тока, ультрафиолетовый трансиллюминатор, холодильник - морозильная камера (до - 20°С).

Микродозаторы (1-20, 20-200, 200-1000 мкл), микроцентрифужные пробирки - виалы (0,5-1,5 мл), наконечники для варипипеток, центрифуга настольная на 12000 об./мин, фотоаппарат "Зенит", фотопленка "Микрат-300" или "Тасма" (132 ед.), оранжевый светофильтр на объектив, фотобачок, водяная баня, иономер (рН-метр).

Реактивы: наборы диагностические для выявления ДНК возбудителя (холеры, чумы, сибирской язвы и т.д.) методом амплификации ("Ниармедик" Москва, "Микроб" Саратов, "Литех" Москва), электрофорезный буфер ТАЕ (0,05 М трисацетат, рН 8,0, и 0,002 М ЭДТА), этидий бромистый, 10 кратный буфер для нанесения образца (0,25% бромфенолового синего, 25% (объем/вес) фикол в ), агароза для ДНК электрофореза (Sigma, Chomapol), фотореактивы.