Приложение 7.3 (Справочное). Использование магноиммуносорбентов для исследования на особо опасные и другие инфекции

Приложение 7.3
(Справочное)

Использование магноиммуносорбентов для исследования на особо опасные и другие инфекции

Для выделения и концентрирования антигенного материала различной природы находят широкое применение в практике иммуносорбционные методы. Усовершенствование сорбентов связано с включением в них магнитного материала, что позволяет значительно расширить возможности применения сорбента и ускорить манипуляции на всех этапах его использования. Магноиммуносорбенты (МИС) могут быть применены при поиске антигенов различной природы (микроорганизмов, вирусов, биологически активных веществ белковой природы животного и растительного происхождения) в объектах внешней среды (суспензия почвы, пищевые продукты, вода открытых водоемов, воздух и т.д.), в патологическом материале от больных или умерших людей, в органах и тканях животных. Особое значение имеют МИС при исследовании сильно загрязненных объектов, например, канализационных стоков. Объем исследуемых проб практически неограничен. МИС могут быть использованы в бактериологическом и иммунобиологических методах исследования (иммуноферментном, иммунофлуоресцентном и др.). Чувствительность этих методов с применением магноиммуносорбентов повышается на несколько порядков и достигает микробных клеток. Работу с магноиммуносорбентами осуществляют с помощью созданных технических устройств, размещенных в компактной укладке, легко транспортируемой ручным способом. Укладка позволяет производить исследования как в лабораторных, так и в полевых условиях.

В состав укладки входят:

1) пульт "ЭЛЕКТРОНИКА" с гребенкой для проведения иммуноферментного анализа;

2) дозатор;

3) пенал держателя цангового и стержней, который представляет собой стерилизатор с 15-ю стержнями для сбора магносорбента и одного цангового держателя для крепления стержня;

4) пенал магнитной палочки, который состоит из трубчатого пенала с 10-ю стеклянными чехлами и двумя магнитными палочками;

5) пенал контейнеров, который представляет собой стерилизатор с 15-ю контейнерами для транспортировки проб;

6) пенал ловушек с магнитными пробками, состоящий из стерилизатора с 10-ю ловушками "конус" и 5-ю ловушками "проточная";

7) леска рыболовная длиной 100 м, предназначенная для крепления ловушек "конус" при взятии проб;

8) постоянный магнит.

В контейнер для магнитной ловушки наливают 5-10 мл физиологического раствора. На магнитную пробку наносят с помощью дозатора 0,2 мл 10% суспензии диагностикума магноиммуносорбентного. Далее:

- включают пульт "ЭЛЕКТРОНИКА" в сеть, подключают разъемный штекер дозатора к гнезду пульта "ДОЗАТОР";

- погружают рабочую поверхность дозатора в суспензию магноиммуносорбентов, нажимают на кнопку дозатора и переносят диагностикум на магнитную пробку ловушки, отпуская кнопку дозатора.

Магнитную пробку с магноиммуносорбентами помещают в контейнер с физиологическим раствором и транспортируют до места забора проб.

На месте постановки ловушки магнитную пробку достают из контейнера и помещают в ловушку. Заряженную магноиммуносорбентом магнитную ловушку "конус" с помощью прикрепленной к ней лески нужной длины опускают в исследуемый объект внешней среды (водоем, канализационный сток и др.) и фиксируют её. "Проточную" ловушку подсоединяют с помощью шлангов к водопроводному крану, цистерне и т.п. Контакт МИС с исследуемым объектом - до 24 часов. По окончании этого срока магнитную пробку вынимают из ловушки и переносят её в контейнер с физиологическим раствором для доставки проб в лабораторию. Ловушки помещают в герметичный пенал для последующего обеззараживания (3-5% раствор хлорамина, 6% раствор перекиси водорода, 3% раствор лизола).

В лаборатории все работы с исследуемыми пробами проводят как с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний.

Подготовку проб к проведению бактериологического анализа осуществляют следующим образом:

- готовят ряд пробирок (5-7 шт.) с физиологическим раствором по 5-7 мл в каждой и мерную пробирку объемом 10 мл с 0,8-1,0 мл физиологического раствора;

- устанавливают стержень из мягкомагнитного материала в цанговый держатель;

- открывают контейнер;

- с помощью стержня в цанговом держателе переносят исследуемую пробу с магнитной пробки в первую пробирку с физиологическим раствором (для каждой пробы используют новый стержень);

- устанавливают магнитную палочку в стеклянный чехол;

- помещают магнитную палочку с чехлом в первую пробирку с пробой;

- опускают магнитную палочку в чехол до упора, при этом гранулы магноиммуносорбента фиксируются на чехле;

- в этом положении вынимают магнитную палочку с чехлом из первой пробирки и переносят во вторую;

- выдвигают магнитную палочку из чехла, при этом гранулы магноиммуносорбента отпадают на дно пробирки;

- отмывание гранул магноиммуносорбента осуществляют путем последовательного переноса пробы из первой до последней пробирки (5-7 шт.);

- после внесения пробы в мерную пробирку доводят объем физиологического раствора в ней до 2 мл, получая 10% суспензию магноиммуносорбента;

- обеззараживают все предметы, контактировавшие с пробой.

Исследуемую пробу высевают на соответствующие питательные среды согласно схеме проведения бактериологического анализа на ту или иную инфекцию следующим образом:

- магноиммуносорбент переносят с помощью магнитной палочки на плотную селективную питательную среду и рассевают этой же палочкой; в жидкие питательные среды магносорбент вносят так же, как при отмывании в физиологическом растворе;

- пробу с МИС вносят в 0,75-1,5 М раствор роданида натрия, рН 5,0-5,5, экспозиция 1-5 минут (в этом растворе происходит диссоциация комплекса "антиген-антитело", и живые клетки отделяются от МИС); надосадочную жидкость с десорбированными микробными клетками высевают на селективные среды.

Проведение иммуноферментного анализа

Иммуноферментный анализ проводят с использованием полистироловых микропланшет (предварительной сенсибилизации не требуется) и пульта "ЭЛЕКТРОНИКА", входящего в укладку, по следующей схеме:

- пробу (почву, фекалии и т.п. суспендируют в 3-30 мл физиологического раствора), обеззараживают прогреванием, добавлением формалина, мертиолата и пр.);

- в пробу вносят 0,5 мл 10% взвеси диагностикума магноиммуносорбентного, экспозиция 1-2 часа при температуре при перемешивании;

- по истечении времени контакта гранулы магноиммуносорбента собирают на стеклянном чехле магнитной палочки и переносят в пробирки с физиологическим раствором для последовательного отмывания (5-7 раз);

- в лунки первого ряда микропланшета вносят 100 мкл рабочего разведения иммунопероксидазного конъюгата и 100 мкл магноиммуносорбента с пробой; две последние лунки ряда - контрольные, в них вносят магноиммуносорбент не контактировавший с пробой;

- в лунки 2-го, 3-го, 4-го рядов вносят по 200 мкл фосфатно-солевого буфера для отмывания от несвязавшегося конъюгата.

Подготовленный планшет устанавливают на проволочную рамку пульта и помещают в рабочую ячейку на верхней панели прибора. Операции проводят в следующей последовательности:

- включают прибор в сеть, нажимают клавишу СЕТЬ, загорается красная индикаторная лампочка СЕТЬ; дважды нажимают на кнопку ТАЙМЕР, на цифровом табло появляются показания "55-55" (Внимание! При нажатии на любую кнопку прибора удерживать ее не менее 2 сек.).

- выставляют время инкубации 20 мин нажатием кнопки МИН;

- нажимают кнопку АВТ, при этом запускается счетчик времени и происходит автоматическое перемешивание в первом ряду планшета;

- нажимают кнопку РУЧНОЙ и переносят гребенкой магноиммуносорбенты в лунки второго ряда;

- нажимают на кнопку СБРОС, удаляют гребенку, выставляют время отмывания кнопкой МИН (2-3 мин), нажимают кнопку АВТ, при появлении звукового сигнала нажимают кнопку ТАЙМЕР; отмывание в третьем и четвертом ряду проводят аналогично;

- для реагирования с субстрат-индикаторным раствором, который готовят ex tempore, магноиммуносорбенты из четвертого ряда переносят в лунки пятого ряда микропланшета, как описано выше (инкубация 1-2 мин).

После развития цветной реакции магноиммуносорбент с фиксированным на нем ферментом удаляют гребенкой из лунок 5-го ряда. Учет результатов проводят визуально относительно контроля. Положительными считаются пробы, цвет которых достоверно отличается от цвета контроля. Учет результатов лучше проводить с помощью прибора-анализатора колориметрического иммуноферментного типа АКИ-Ц-01.

Примечание: пробу, доставленную на магнитной ловушке, снимают стержнем в цанговом держателе, отмывают 5-7 раз в физиологическом растворе, обеззараживают и проводят исследование по описанной выше схеме.