Приложение 7.4 (Справочное). Раннее обнаружение и идентификация возбудителей некоторых особо опасных инфекций в объектах, содержащих единичные клетки

Приложение 7.4
(Справочное)

Раннее обнаружение и идентификация возбудителей некоторых особо опасных инфекций в объектах, содержащих единичные клетки

Нахождение возбудителей чумы, сибирской язвы, бруцеллеза, туляремии в малых количествах в объектах, подлежащих исследованию, представляет достаточно распространенное явление. Малое количество микробных клеток может содержаться в материале от людей, в отношении которых начата антибиотикотерапия, в материале от трупов людей и животных, пролежавших в теплый период года более 6 часов, в пробах из различных объектов внешней среды. Зачастую количество микробных клеток в исследуемых объектах оказывается ниже порога чувствительности известных методов.

Излагаемый ниже методический прием позволяет в кратчайшие сроки обнаружить и идентифицировать указанные возбудители при их минимальном содержании в исследуемом материале.

Накопление микробов проводят в организме белых мышей, которым исследуемый материал в жидкой фазе вводят подкожно в область спины в смеси с гепаринизированной кровью морской свинки, желтком куриного яйца и кортизоном или гидрокортизоном.

Общеизвестным способом из сердца морской свинки берут кровь, стерильно переливают ее в пробирку, в которую предварительно добавляют антикоагулянт гепарин из расчета 0,2 мл на 5 мл крови. Такую гепаринизированную кровь можно использовать в течении суток

Для получения желтка свежие куриные яйца моют щеткой с мылом в теплой воде, обтирают спиртом, быстро обжигают на пламени горелки, разбивают, сливают желтки, тщательно отделяя их от белков, в стерильный сосуд и перемешивают стерильной стеклянной палочкой или пипеткой. Такие желтки можно использовать в течение недели.

Приготавливают смесь гепаринизированной крови морской свинки с желтком куриного яйца в соотношении 1:1. К исследуемому материалу в жидкой фазе добавляют равное количество указанной смеси и кортизон или гидрокортизон из расчета 5-7 мг на одно животное. Полученную суспензию набирают в шприц и вводят белым мышам подкожно в область спины. При этом помощник фиксирует животное, а экспериментатор пинцетом захватывает кожу в складку в области крестца и вводит иглу под контролем глаза так, чтобы срез иглы был на уровне лопаток. После этого плавным движением, надавливая на поршень, вводят нужное количество материала.

Животных, зараженных исследуемым материалом, вскрывают через 24 и 48 часов после заражения. Грызунов умерщвляют хлороформированием и прикрепляют приколышами спиной кверху. Кожу над крестцом животного захватывают хирургическим пинцетом, приподнимают вверх, делают маленький поперечный разрез ножницами, в образовавшееся "окошечко" вводят закругленную браншу ножниц и делают дугообразные разрезы кожи, обходя по бокам место введения. Образовавшийся лоскут кожи (в виде фартука) откидывают на голову грызуна. При этом легко обнаруживают место введения за счет пропитывания мягких тканей кровью. Место введения подвергают иммунофлуоресцентному, серологическому и бактериологическому исследованиям. Для этого, в соответствии с общепринятой схемой, проводят посев петлей на пластины элективной среды, затем изготавливают мазки-отпечатки для окраски по Граму и исследования методом флуоресцирующих антител. Затем ножницами тщательно срезают ткани места введения, пропитанные кровью, переносят их в стерильные фарфоровые ступки, в которые предварительно наливают 1,0 мл стерильного физиологического раствора, и тщательно растирают пестиком. По 0,2 мл полученной эмульсии вносят в чашки Петри с элективными средами и равномерно распределяют по поверхности агаровых пластин. После впитывания эмульсии в агар одну из чашек используют для постановки пробы с фагами, другую - для определения антибиотикочувствительности с помощью бумажных дисков. Оставшиеся грубые частицы тканей места введения в фарфоровых ступках вновь тщательно растирают в 1 мл стерильного физиологического раствора, полученный гомогенизат переносят в пробирки, обеззараживают по общепринятой методике и используют для постановки серологических реакций.