Приложение Б (обязательное). Состав и приготовление питательных сред и реактивов

Приложение Б
(обязательное)

Состав и приготовление питательных сред и реактивов

Б.1 Селективные среды первичного обогащения

Б.1.1 Полуконцентрированный бульон Фразера (Half Fraser broth)

Б.1.1.1 Основа среды

Состав:
мясной пептон (пептический перевар животной ткани)	5,0 г
триптон (ферментативный гидролизат казеина)	5,0 г
мясной экстракт	5,0 г
дрожжевой экстракт	5,0 г
хлорид натрия	20,0 г
натрий фосфорнокислый двухзамещенный	12,0 г
калий фосфорнокислый однозамещенный	1,35 г
эскулин	1,0 г
дистиллированная вода	1000

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости.

Устанавливают рН среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,20,2) ед. рН при температуре 25°С. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема в количестве необходимом для проведения анализа (см. 10.1) и стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 15 мин.

Примечание - Раствор хлорида лития и раствор налидиксовой кислоты могут быть добавлены в основу до стерилизации.

Б.1.1.2 Растворы селективных добавок

Б.1.1.2.1 Раствор хлорида лития

Состав:
хлорид лития	3,0 г
дистиллированная вода	10,0

Приготовление:

Хлорид лития растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.

Предупреждение - Необходимо принимать все меры предосторожности при растворении хлорида лития в воде, так как реакция является экзотермической. Раствор хлорида лития раздражает слизистую оболочку.

Б.1.1.2.2 Раствор натриевой соли налидиксовой кислоты

Состав:
натриевая соль налидиксовой кислоты	0,1 г
0,05 раствор гидроксида натрия	10,0

Приготовление:

Натриевую соль налидиксовой кислоты растворяют в растворе гидроксида натрия и стерилизуют раствор путем фильтрования.

Б.1.1.2.3 Раствор акрифлавина гидрохлорида

Состав:
акрифлавин гидрохлорида	0,25 г
дистиллированная вода	100

Приготовление:

Акрифлавин гидрохлорида растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.

Б.1.1.2.4 Раствор цитрата аммонийного железа (III)

Состав:
цитрат аммонийного железа (III)	5,0 г
дистиллированная вода	100

Приготовление

Цитрат аммонийного железа (III) растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.

Б.1.1.3 Готовая среда

Состав среды:
основа среды (см. Б.1.1.1)	100
раствор хлорида лития (см. Б.1.1.2.1)	1,0
раствор натриевой соли налидиксовой кислоты (см. Б.1.1.2.2)	0,1
раствор акрифлавина гидрохлорида (см. Б.1.1.2.3)	0,5
раствор цитрата аммонийного железа (III) (см. Б.1.1.2.4)	1,0

Приготовление:

В основу среды добавляют четыре раствора селективных добавок непосредственно перед использованием.

Б.1.2 Селективный накопительный бульон (UVM)

Состав среды:
триптоза	10,0 г
мясной экстракт	5,0 г
дрожжевой экстракт	5,0 г
хлористый натрий	20,0 г
фосфорнокислый натрий двузамещенный	12,0 г
калий фосфорнокислый однозамещенный	1,35 г
эскулин	1,0 г
налидиксовая кислота	20,0 мг
акрифлавин гидрохлорида	12,0 мг
дистиллированная вода	1000,0

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде нагревая при необходимости.

Устанавливают рН среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,20,2) ед. рН. Разливают среду в колбы или во флаконы соответствующего объема в количестве 225 и стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 15 мин.

Б.1.3 Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ I)

Б.1.3.1 Основа среды

Состав:
гидролизат казеина ферментативный	10,0 г
пептон мясной ферментативный	15,0 г
гидролизат дрожжей автолизованных	2,0 г
хлорид натрия	3,5 г
хлорид лития	3,0 г
дистиллированная вода	1000,0

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости.

Устанавливают рН среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,00,2) ед. рН при температуре 25°С. Разливают среду в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 15 мин.

Б.1.3.2 Раствор селективной добавки

Состав:

Состав:
налидиксовая кислота	10 мг
акрифлавин	5 мг
полимиксин В сульфат	5 мг
стерильная дистиллированная вода	10

Приготовление:

Налидиксовую кислоту, акрифлавин и полимиксин В сульфат растворяют в стерильной дистиллированной воде.

Б.1.3.3 Готовая среда

Состав среды:
основа среды (см. Б.1.3.1)	1000
раствор селективной добавки (см. Б.1.3.2)	4,44

Приготовление:

В основу среды добавляют раствор селективной добавки. Среду хранят не более двух суток в защищенном от света месте при температуре не выше 8°С.

Б.2 Селективные среды вторичного обогащения

Б.2.1 Бульон Фразера (Fraser broth)

Б.2.1.1 Основа среды

Состав:
мясной пептон (пептический перевар животной ткани)	5,0 г
триптон (ферментативный гидролизат казеина)	5,0 г
мясной экстракт	5,0 г
дрожжевой экстракт	5,0 г
хлорид натрия	20,0 г
натрий фосфорнокислый двухзамещенный	12,0 г
калий фосфорнокислый однозамещенный	1,35 г
эскулин	1,0 г
хлорид лития	3,0 г
натриевая соль налидиксовой кислоты	0,1 г
дистиллированная вода	1000

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая ее при необходимости.

Устанавливают рН среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,20,2) ед. рН при температуре 25°С. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема в количестве необходимом для проведения анализа и стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 15 мин.

Б.2.1.2 Растворы селективных добавок

Б.2.1.2.1 Раствор акрифлавина гидрохлорида

Согласно Б.1.1.2.3.

Б.2.1.2.2 Раствор цитрата аммонийного железа (III)

Согласно Б.1.1.2.4.

Б.2.1.3 Готовая среда

Приготовление:

В пробирки с 10 основой среды (см. Б.2.1.1) добавляют по 0,1 раствора акрифлавина гидрохлорида (см. Б.2.1.2.1) и раствор цитрата аммонийного железа (III) (см. Б.2.1.2.2) непосредственно перед использованием.

Б.2.2 Селективный накопительный бульон (UVM II)

Б.2.2.1 Основа среды

Согласно Б.1.2.

Б.2.2.2 Раствор акрифлавина гидрохлорида

Состав:
акрифлавин гидрохлорида	13 мг
стерильная дистиллированная вода	10

Приготовление:

Акрифлавин гидрохлорида растворяют в стерильной дистиллированной воде.

Б.2.2.3 Готовая среда

Состав среды:
основа среды (см. Б.2.2.1)	1000
раствор акрифлавина гидрохлорида (см. Б.2.2.2)	4,44

Приготовление:

К 1000,0 основы среды (см. Б.2.2.1) добавляют раствор акрифлавина гидрохлорида (см. Б.2.2.2).

Б.2.3 Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ II)

Б.2.3.1 Основа среды

Согласно Б.1.3.

Б.2.3.2 Раствор селективной добавки

Состав:
налидиксовая кислота	10 мг
акрифлавин гидрохлорида	5 мг
полимиксин В сульфат	5 мг
стерильная дистиллированная вода	5

Приготовление:

Налидиксовую кислоту, акрифлавин гидрохлорида и полимиксин В сульфат растворяют в стерильной дистиллированной воде.

Б.2.3.3 Готовая среда

Состав среды:
основа среды (см. Б.2.3.1)	1000
раствор селективной добавки (см. Б.2.3.2)	4,44

Приготовление:

В основу среды (см. Б.2.3.1) добавляют раствор селективной добавки (см. Б.2.3.2) и разливают в стерильные пробирки по 10 . Среду хранят не более 22 сут в защищенном от света месте при температуре не выше 8°С.

Б.3 Селективные плотные среды для пересева

Б.3.1 Первая среда

Б.3.1.1 Агар Listeria по Оттавиани и Агости (ALOA)

Б.3.1.1.1 Основа среды

Состав:
ферментативный перевар животного белка	18,0 г
панкреатический гидролизат казеина	6,0 г
дрожжевой экстракт	10,0 г
пируват натрия	2,0 г
глюкоза	2,0 г
глицерофосфат магния	1,0 г
сульфат магния (безводный)	0,5 г
хлорид натрия	5,0 г
хлорид лития	10,0 г
натрий фосфорнокислый двузамещенный (безводный)	2,5 г
5-бромо-4-хлоро-3-индолил--D-глюкопиранозид	0,05 г
агар	12,0-18,0 г
дистиллированная вода	930 *

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют при нагревании в дистиллированной воде.

Устанавливают рН среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,20,2). Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 15 мин.

Б.3.1.1.2 Растворы селективных добавок

Б.3.1.1.2.1 Раствор налидиксовой кислоты

Состав:
натриевая соль налидиксовой кислоты	0,02 г
0,05 раствор гидроксида натрия	5,0

Приготовление:

Натриевую соль налидиксовой кислоты растворяют в 5 0,05 раствора гидроксида натрия и стерилизуют раствор путем фильтрования.

Б.3.1.1.2.2 Раствор цефтазидима

Состав:
цефтазидим	0,02 г
дистиллированная вода	5,0

Приготовление

Цефтазидим растворяют в 5 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Б.3.1.1.2.3 Раствор полимиксина В сульфат

Состав:
полимиксина В сульфат	76700,0 е.а.
дистиллированная вода	5,0

Приготовление:

* 925 , если используют раствор амфотерицина В.

Полимиксин В сульфат растворяют в 5 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Б.3.1.1.3 Растворы антибиотиков

Б.3.1.1.3.1 Раствор циклогексимида

Состав:
циклогексимид	0,05 г
этанол	2,5
дистиллированная вода	2,5

Приготовление

Циклогексимид растворяют в 2,5 этанола, затем добавляют 2,5 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Б.3.1.1.3.2 Раствор амфотерицина В (используется, как альтернатива для раствора циклогексимида)

Состав:
амфотерицин В	0,01 г
соляная кислота (HCI) (1 )	2,5
диметилформамид (DMF)	7,5

Приготовление:

Амфотерицин растворяют в растворе соляной кислоты (HCI) и диметилформамида (DMF) и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Предупреждение - Раствор HCI и диметилформамид (DMF) очень токсичен. Обращаться с осторожностью.

Б.3.1.1.4 Дифференциальная добавка

Состав:
L--фосфатидилинозитал (Sigma P )	2,0 г
холодная дистиллированная вода	50

Приготовление:

L--фосфатидилинозитал (Sigma P ) растворяют в холодной дистиллированной воде. Раствор перемешивают в течение 30 мин до получения гомогенной суспензии. Автоклавируют при температуре 121°С в течение 15 мин с последующим охлаждением до температуры (472)°С.

Б.3.1.1.5 Готовая среда

Состав среды:
основа среды (см. Б.3.1.1.1)	930,0 ()*
раствор налидиксовой кислоты (см. Б.3.1.1.2.1)	5,0
раствор цефтазидима (см. Б.3.1.1.2.2)	5,0
раствор полимиксина В сульфата (см. Б.3.1.1.2.3)	5,0
раствор циклогексимида (см. Б.3.1.1.3.1)	5,0
или амфотерицина В (см. Б.3.1.1.3.2)	10,0
дифференциальная добавка (см. Б.3.1.1.4)	50,0

______________________________

* 925 , если используют раствор амфотерицина В.

Приготовление:

В расплавленную и охлажденную на водяной бане до температуры (472)°С основу среды, добавляют, тщательно перемешивая после каждого добавления, растворы ингибиторов, антибиотиков и добавок.

рН готовой среды должен составлять (7,20,2) ед. рН.

Готовая среда должна быть гомогенной и непрозрачной.

В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15 - 20 и дают агару затвердеть.

Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133-1.

Б.3.1.2 Бриллианс Listeria агар (BRILLIANCE LISTERIA agar)

Б.3.1.2.1 Основа среды

Состав:
пептон	18,5 г
дрожжевой экстракт	4,0 г
хлорид натрия	9,5 г
пируват натрия	2,0 г
хлорид лития	15,0 г
мальтоза	4,0 г
5-бромо-4-хлоро-3-индолил--D-глюкопиранозид	0,2 г
агар	14,0 г
дистиллированная вода	930

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют при нагревании в дистиллированной воде.

Устанавливают рН среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,20,2) ед. рН. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 15 мин.

Б.3.1.2.2 Растворы селективных добавок

Б.3.1.2.2.1 Раствор налидиксовой кислоты

Состав:
натриевая соль налидиксовой кислоты	0,02 г
0,05 раствор гидроксида натрия	5,0

Приготовление:

Натриевую соль налидиксовой кислоты растворяют в 5 0,05 раствора гидроксида натрия и стерилизуют раствор путем фильтрования.

Б.3.1.2.2.2 Раствор цефтазидима

Состав:
цефтазидим	0,02 г
дистиллированная вода	5,0

Приготовление:

Цефтазидим растворяют в 5 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Б.3.1.2.2.3 Раствор полимиксина В сульфат

Состав:
полимиксина В сульфат	76700,0 е.а.
дистиллированная вода	5,0

Приготовление:

Полимиксин В сульфат растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Б.3.1.2.3 Растворы антибиотиков

Б.3.1.2.3.1 Раствор циклогексимида

Состав:
циклогексимид	0,05 г
этанол	2,5
дистиллированная вода	2,5

Приготовление:

Циклогексимид растворяют в 2,5 этанола, затем добавляют 2,5 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Б.3.1.2.3.2 Раствор амфотерицина В (используют, как альтернативу для раствора циклогексимида)

Состав:
амфотерицин В	0,01 г
соляная кислота (HCI) 1	2,5
диметилформамид (DMF)	7,5

Приготовление:

Амфотерицин растворяют в растворе HCI и диметилформамида (DMF) и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Предупреждение - Раствор HCI и диметилформамид (DMF) очень токсичен. Обращаться с осторожностью.

Б.3.1.2.4 Дифференциальная добавка

Состав:
L--фосфатидилинозитал (Sigma P )*	2,0 г
холодная дистиллированная вода	50

Приготовление:

L--фосфатидилинозитал (Sigma P 6636R)* растворяют в холодной дистиллированной воде. Раствор перемешивают в течение 30 мин до получения гомогенной суспензии. Автоклавируют при температуре 121°С в течение 15 мин с последующим охлаждением до температуры (472)°С.

Б.3.1.2.5 Готовая среда

Состав среды:
основа среды (см. Б.3.1.2.1)	933,0 ()**
раствор налидиксовой кислоты (см. Б.3.1.2.2.1)	5,0
раствор цефтазидима (см. Б.3.1.2.2.2)	5,0
раствор полимиксина В сульфат (см. Б.3.1.2.2.3)	5,0
раствор циклогексимида (см. Б.3.1.2.3.1)	5,0
или амфотерицина В (см. Б.3.1.2.3.2)	10,0
дифференциальная добавка (см. Б.3.1.2.4)	50,0

______________________________

* Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

** 925 см, если используют раствор амфотерицина В.

Приготовление:

В расплавленную и охлажденную на водяной бане до температуры (472)°С основу среды (см. Б.3.1.2.1) добавляют растворы ингибиторов (см. Б.3.1.2.2.1, Б.3.1.2.2.2, Б.3.1.2.2.3), антибиотика (см. Б.3.1.2.3) и дифференциальную добавку (см. Б.3.1.2.4), тщательно перемешивая после каждого добавления.

рН готовой среды должен составлять (7,20,2) ед. рН.

Готовая среда должна быть гомогенной и непрозрачной.

В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15 - 20 см и дают агару затвердеть.

Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133-1.

Б.3.1.3 Оценка качества первой среды

Определение селективности и продуктивности питательной среды необходимо проводить согласно ГОСТ ISO 11133-2.

В таблице Б.1 приведены тесты для оценки качества первой среды.

Таблица Б.1

Функция	Инкубирование	Контрольные штаммы	Рекомендуемая среда	Метод контроля	Критерий	Характерная реакция
Продуктивность	37°С 48 ч	L. monocyt-ogenes 4b АТСС и/или L. monocyt-ogenes 1/2a АТСС 19111 (или другие эквивалентные штаммы в зарегистрированной коллекции микроорганизмов)	TSA	Количественный	Коэффициент продуктивности 0,5	Зелено-голубые колонии с непрозрачной зоной
Специфичность	37°С 48 ч	L. innocua АТСС 33090 (или другие эквивалентные штаммы в зарегистрированной коллекции микроорганизмов)		Качественный		Зелено-голубые колонии без непрозрачной зоной
Селективность	37°С 48 ч	Е. coli АТСС 25922 или и/или E. faecalis АТСС 29212 или 19433 (или другие эквивалентные штаммы в зарегистрированной коллекции микроорганизмов)		Качественный	Полное подавление	-
Примечание - Штаммы и используют производители питательных сред для контроля качества продукции, при этом штамм применяют только при проведении внутрилабораторного контроля.

Б.3.2 Вторая среда селективная среда для посева

Б.3.2.1 Оксфорд агар (Oxford agar)

Б.3.2.1.1 Основа среды

Состав:

Состав:
пептон	23,0 г
крахмал	1,0 г
хлорид натрия	5,0 г
эскулин	1,0 г
цитрат аммонийного железа (III)	0,5 г
хлорид лития	15,0 г
агар (в зависимости от плотности среды)	9,0 - 18,0 г
дистиллированная вода	1000,0

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде при нагревании. Устанавливают рН среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,00,2). Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 15 мин.

Б.3.2.1.2 Раствор селективной добавки

Состав:
циклогексимид	400,0 мг
сульфат колистина (полимиксин Е)	20,0 мг
гидрохлорид акрифлавина	5,0 мг
цефотетан	2,0 мг
фосфомицин	10,0 мг
этанол	5,0
дистиллированная вода	5,0

Приготовление:

Компоненты добавки растворяют в смеси этанола и воды. Стерилизуют раствор фильтрованием.

Б.3.2.1.3 Готовая среда

Приготовление:

В расплавленную и охлажденную на водяной бане до температуры (472)°С основу среды (см. Б.3.2.1.1) добавляют, тщательно перемешивая, раствор селективной добавки (см. Б.3.2.1.2).

В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15 - 20 и дают агару затвердеть.

Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133-1.

Б.3.2.2 Палкам агар (PALCAM agar)

Б.3.2.2.1 Основа среды

Состав:
пептон	23,0 г
крахмал	1,0 г
хлорид натрия	5,0 г
дрожжевой экстракт	3,0 г
D-глюкоза	0,5 г
D-маннитол	10,0 г
эскулин	0,8 г
цитрат аммонийного железа (III)	0,5 г
фенол красный	0,08 г
хлорид лития	15,0 г
агар	9,0-18,0 г*
дистиллированная вода	960,0

_____________________________

* В зависимости от плотности среды.

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде при нагревании.

Устанавливают рН среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,20,2). Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 15 мин.

Б.3.2.2.2 Раствор сульфата полимиксина В

Состав:
полимиксина В сульфат (100000 е.а.)	0,1 г
дистиллированная вода	100

Приготовление:

Растворяют полимиксина В сульфат в воде. Стерилизуют раствор фильтрованием.

Б.3.2.2.3 Раствор гидрохлорида акрифлавина

Состав:
акрифлавина гидрохлорид	0,05 г
дистиллированная вода	100

Приготовление:

Растворяют гидрохлорид акрифлавина в дистиллированной воде. Стерилизуют раствор фильтрованием.

Б.3.2.2.4 Раствор пентагидрата цефтазидима натрия

Состав:
пентагидрат цефтазидима натрия	0,116 г
дистиллированная вода	100

Приготовление:

Растворяют пентагидрат цефтазидим натрия в воде. Стерилизуют раствор фильтрованием.

Б.3.2.2.5 Готовая среда

Состав:
основа агара (В.3.3.1)	960,0
раствор сульфата полимиксина В (В.3.3.2)	10,0
раствор акрифлавина гидрохлорида (В.3.3.3)	10,0
раствор пентагидрата цефтазидима натрия (В.3.3.4)	20,0

Приготовление:

В расплавленную и охлажденную на водяной бане до (472)°С основу среды (см. Б.3.2.2.1), добавляют, тщательно перемешивая, растворы добавок (см. Б.3.2.2.2 - Б.3.2.2.3).

В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15 - 20 и дают агару затвердеть.

Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133-1.

Б.3.2.3 Питательный агар для выделения листерий (ПАЛ)

Б.3.2.3.1 Основа среды

Состав:
гидролизат казеина панкреатический	10,0 г
гидролизат рыбной муки панкреатический	15,0 г
гидролизат автолизованных дрожжей	2,0 г
хлорид натрия	3,5 г
хлорид лития	15,0 г
цитрат аммонийного железа	0,5 г
эскулин	0,8 г
агар	13,0 г
дистиллированная вода	до 1000,0

Приготовление:

Компоненты растворяют в дистиллированной воде при нагревании и тщательно перемешивают до полного растворения. Устанавливают рН (7,00,2) ед. рН и стерилизуют в автоклаве при температуре (1211)°С в течение 15 мин.

Б.3.2.3.2 Раствор селективной добавки

Состав:
налидиксовая кислота	20 мг
акрифлавин гидрохлорида	10 мг
полимиксин В сульфат	10 мг
стерильная дистиллированная вода	10

Приготовление:

Налидиксовую кислоту, акрифлавин и полимиксин В сульфат растворяют в стерильном физиологическом растворе.

Б.3.2.3.3 Готовая среда

Состав:
основа среды (см. Б.3.2.3.1)	1000
раствор селективной добавки (см. Б.3.2.3.2)	4,44

Приготовление:

К расплавленной основе среды добавляют с соблюдением правил асептики раствор селективной добавки. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят не более 22 сут в защищенном от света месте при температуре не выше 8°С.

Б.4 Питательные среды, используемые для изучения культурально-морфологических свойств

Б.4.1 Плотные питательные среды

Б.4.1.1 Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA)

Состав:
триптон или панкреатический гидролизат казеина	17,0 г
соевый пептон	3,0 г
хлорид натрия	5,0 г
калий фосфорнокислый двузамещенный	2,5 г
глюкоза	2,5 г
дрожжевой экстракт	6,0 г
агар	9,0-18,0 г*
дистиллированная вода	1000,0

_____________________________

* В зависимости от плотности среды

Приготовление:

Растворяют компоненты или сухую готовую среду в дистиллированной воде, нагревая. При необходимости установить рН так, чтобы после стерилизации его значение соответствовало (7,30,2) ед. рН при температуре 25°С. Среду необходимого объема разливают в пробирки. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течении 15 мин. Скашивают агар. Для приготовления чашек с агаром готовую среду разливают в стерильные чашки Петри в объеме, необходимом для проведения теста. Дают агару застыть.

Б.4.1.2 Трипказо-соевый агар (TSA)

Состав среды:
триптон	15,0 г
соевый пептон	5,0 г
хлорид натрия	5,0 г
агар	5,0 г
дистиллированная вода	1000,0

Приготовление:

Растворяют компоненты или сухую готовую среду в дистиллированной воде, нагревая. Устанавливают рН (7,30,2) ед. рН и стерилизуют при температуре (1211)°С в течение 15 мин.

Приготовленную среду разливают в чашки Петри и хранят в защищенном от света месте при температуре не выше 8°С.

Б.4.1.3 Мясопептонный агар (МПА)

В соответствии с ГОСТ 10444.1 (пункт 5.12).

Б.4.2 Жидкие питательные среды

Б.4.2.1 Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB)

Состав среды:
триптон или панкреатический гидролизат казеина	17,0 г
соевый пептон	3,0 г
хлорид натрия	5,0 г
калий фосфорнокислый двузамещенный	2,5 г
глюкоза	2,5 г
дрожжевой экстракт	6,0 г
дистиллированная вода	1000,0

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, при необходимости нагревая. Устанавливают рН (7,30,2) ед. рН. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (1211)°С в течение 15 мин.

Б.4.2.2 Трипказо-соевый бульон (TSB)

Состав среды:
триптон	17,0 г
соевый пептон	3,0 г
хлорид натрия	5,0 г
калия фосфат однозамещенный	2,5 г
декстроза	2,5 г
дистиллированная вода	1000,0

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, при необходимости нагревая. Устанавливают рН (7,30,2) ед. рН. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (1211)°С в течение 15 мин.

Приготовленную среду хранят в защищенном от света месте при температуре не выше 8°С.

Б.4.2.3 Мясопептонный бульон (МПБ)

В соответствии с ГОСТ 10444.1 (пункт 5.12).

Б.5 Среда для определения активности

Б.5.1 Кровяной агар

Б.5.1.1 Основа среды (вариант 1)

Состав:
мясной пептон	15,0 г
печеночный перевар	2,5 г
дрожжевой экстракт	5,0 г
хлорид натрия	5,0 г
агар	9,0-18,0 г*
дистиллированная вода	1000,0

______________________________

* В зависимости от плотности среды.

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая на водяной бане. При необходимости установить рН так, чтобы после стерилизации его значение соответствовало () ед. рН при температуре 25°С. Среду разливают в колбы и стерилизуют при температуре ()°С в течение 15 мин.

Б.5.1.2 Основа среды (вариант 2)

Состав и приготовление согласно ГОСТ 10444.1 (пункт 5.12).

Б.5.1.3 Дефибринированная кровь барана

Приготовление:

В стерильную колбу со стеклянными бусами вливают 8 только что взятой крови барана и непрерывно встряхивают в течение 10 - 15 мин, в результате чего находящийся в крови фибрин выпадает в осадок, обволакивая бусы. Дефибринированную кровь сливают в другую колбу или пробирку. Слитая дефибринированная кровь утрачивает способность свертываться и может храниться при температуре (41)°С в течение одной недели.

Б.5.1.4 Готовая среда

Состав среды:
основа среды (см. Б.5.1 или Б.5.2)	100
дефибринированная кровь барана	5,0-7,0

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо слов "(см. Б.5.1 или Б.5.2)" следует читать "(см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2)"

Приготовление:

В основу среды (см. Б.5.1 или Б.5.2), охлажденную на водяной бане до температуры (472)°С, добавляют дефибринированную кровь барана (см. Б.5.1.3). Среда должна иметь рН (7,20,2) ед. рН.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо слов "(см. Б.5.1 или Б.5.2)" следует читать "(см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2)"

Готовую среду осторожно перемешивают и разливают в чашки Петри (не более 10 на чашку) и после затвердения агара подсушивают его при температуре (472)°С в течение 30 мин или в ламинарном боксе в течение 1 - 2 ч или в других условиях, обеспечивающих испарение конденсационной влаги и исключающих микробное загрязнение.

Среду в чашках хранят при температуре (41)°С не более двух суток.

Слой агара в чашке Петри должен быть равномерно окрашен в красный цвет. Для посева должна использоваться подсушенная среда.

Б.6 Суспензия из эритроцитов барана для определения гемолитической активности

Приготовление:

Кровь из яремной вены барана отбирают в стерильную банку с бусами и дефибринируют (см. Б.5.1.3). Эритроциты трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия путем центрифугирования при 1000 - 2000 об/мин в течение 5 - 10 мин соответственно. После последнего центрифугирования надосадочная жидкость должна быть прозрачной. Красный цвет жидкости (гемолиз) свидетельствует о непригодности эритроцитов к применению. Отмытые эритроциты барана необходимо хранить при температуре (32)°С не более двух суток.

Если гемолиз эритроцитов барана не наблюдается, необходимо внести 2 кровяных телец в 98 фосфатио-солевого буфера (PBS) (см. Б.11).

Если гемолиз эритроцитов наблюдается, необходимо внести около 4 слоя кровяных телец в 10 фосфатно-солевого буфера (PBS) (см. Б.11) и осторожно перемешать, а затем центрифугировать. Если жидкость на поверхности стала четко красного цвета благодаря выраженному гемолизу, не допускается использование такой суспензии эритроцитов, она должна утилизироваться.

Суспензию эритроцитов барана необходимо хранить при температуре (32)°С не более пяти суток.

Б.7 Среды для определения ферментативных свойств

Б.7.1 Бульон с бромкрезоловым пурпурным

Б.7.1.1 Основа среды

Состав:
протеозный пептон	10,0 г
мясной экстракт	1,0 г
хлорид натрия	5,0 г
бромкрезоловый пурпурный	0,02 г
дистиллированная вода	1000,0

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде.

Устанавливают рН среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (6,80,2) ед. рН. Разливают среду в пробирки соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 15 мин.

Б.7.1.2 Растворы углеводов

Состав:
углевод*	5,0 г
дистиллированная вода	100

______________________________

* L-рамноза, D-ксилоза и альфа-метил D-маннозид (Methyl -D-mannopyranoside).

Приготовление:

Каждый из углеводов отдельно растворяют в 100 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования.

Б.7.1.3 Готовая среда

Состав:
основа среды (см. Б.7.1.1)	9,0
углевод (см. Б.7.1.2)	1,0

Приготовление:

В асептических условиях в основу среды (см. Б.7.1) перед применением добавляют раствор каждого углевода (см. Б.7.2) в отдельности.

Б.7.2 Среды Гисса

Состав и приготовление в соответствии ГОСТ 10444.1.

Углеводы: L-рамноза, D-ксилоза и альфа-метил D-маннозид (Methyl
-D-mannopyranoside).

Б.8 Агар для определения подвижности культуры микроорганизма

Состав среды:
ферментативный гидролизат казеина	20,0 г
пептон	6,1 г
агар-агар	3,5 г
дистиллированная вода	1000,0

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде при нагревании.

Устанавливают рН среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,30,2) ед. рН. Разливают среду в пробирки соответствующего объема в количестве 5 и стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 15 мин.

Б.9 Среды для проведения КАМП (CAMP) теста

Для проведения этого теста могут быть использованы чашки Петри с кровяным агаром (см. Б.5.1.4), но предпочтительнее использовать чашки с двойным слоем: среды (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2) и тонкого слоя кровяного агара (см. Б.5.1.4).

Среду (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2) разливают примерно по 10 в стерильные чашки Петри и дают застыть. Затем очень тонким слоем заливают кровяной агар (см. Б.5.1.4), но не более 3 на чашку. Дают агару застыть.

Если кровяной агар (см. Б.5.1.4) вносится в заранее приготовленные чашки со средой (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2), то перед тем, как внести ее, необходимо прогреть эти чашки в течение 20 мин в термостате при температуре 37°С.

Б.10 Среда для определения лецитиназной активности

Б.10.1 Лецитин-агар с активированным углем

Б.10.1.1 Основа среды

Состав:
панкреатический гидролизат рыбной муки	15,0 г
панкреатический гидролизат казеина	10,0 г
экстракт дрожжевой	2,0 г
натрий хлорид	3,5 г
глюкоза	1,0 г
агар	10,02,0 г
дистиллированная вода	1000

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, кипятят в течение 2 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в стерильные колбы и флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин.

Б.10.1.2 Активированный уголь

Активированный уголь растирают до порошкообразного состояния.

Б.10.1.3 Эмульсия яичного желтка

Поверхность яйца обрабатывают этиловым спиртом, стерильным пинцетом пробивают с двух сторон отверстия и через одно из них полностью удаляют белок. Желток выливают в стерильную колбу.

Для приготовления желточной эмульсии к одному желтку с соблюдением правил асептики добавляют 150 стерильного физиологического раствора и тщательно перемешивают до получения однородной массы.

Б.10.1.4 Готовая среда

Состав:
основа среды (см. Б.10.1)	100
активированный уголь (см. Б.10.2)	0,5 г
желточная эмульсия (см. Б.10.3)	5

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо слов "(см. Б.10.1)" следует читать "(см. Б.10.1.1)"

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо слов "(см. Б.10.2)" следует читать "(см. Б.10.1.2)"

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо слов "(см. Б.10.3)" следует читать "(см. Б.10.1.3)"

Приготовление:

Расплавленную основу среды (см. Б.10.1) охлаждают до температуры (472,0)°С, добавляют активированный уголь (см. Б.10.2) и желточную эмульсию (см. Б.10.3), тщательно перемешивают и разливают по (205) в стерильные чашки Петри и после застывания подсушивают в термостате при температуре (371)°С в течение (405) мин.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо слов "(см. Б.10.1)" следует читать "(см. Б.10.1.1)"

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо слов "(см. Б.10.2)" следует читать "(см. Б.10.1.2)"

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо слов "(см. Б.10.3)" следует читать "(см. Б.10.1.3)"

Б.10.2 Лецитин-агар без угля

Б.10.2.1 Основа среды

Состав:
панкреатический гидролизат рыбной муки	15,0 г
панкреатический гидролизат казеина	10,0 г
экстракт дрожжевой	2,0 г
натрий хлорид	3,5 г
глюкоза	1,0 г
агар	10,02,0 г
дистиллированная вода	1000

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, кипятят в течение 2 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в стерильные колбы и флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин.

Б.10.2.2 Эмульсия яичного желтка

Поверхность яйца обрабатывают этиловым спиртом, стерильным пинцетом пробивают с двух сторон отверстия и через одно из них полностью удаляют белок. Желток выливают в стерильную колбу.

Для приготовления желточной эмульсии к одному желтку с соблюдением правил асептики добавляют 150 стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) (см. Б.11) и тщательно перемешивают до получения однородной массы.

Б.10.2.3 Готовая среда

Состав среды:
основа среды (см. Б.10.2.1)	100
желточная эмульсия (см. Б.10.2.2)	5

Приготовление:

Расплавленную основу среды (см. Б.10.2.1) охлаждают до температуры (472,0)°С, добавляют желточную эмульсию (см. Б.10.2.2), тщательно перемешивают и разливают по (205) в стерильные чашки Петри и после застывания подсушивают в термостате при температуре (371)°С в течение (405) мин.

Б.11 Фосфатно-солевой буфер (PBS)

Состав среды:
натрий фосфорнокислый двухзамещенный	8,98 г
натрий фосфорнокислый однозамещенный	2,71 г
хлорид натрия	8,5 г
дистиллированная вода	1000,0

Приготовление:

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде. При необходимости установить рН так, чтобы после стерилизации его значение соответствовало (7,20,2) ед. рН при температуре 25°С. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 15 мин.