Методические рекомендации МР 02.032-08 "Идентификация микроорганизмов и определение их чувствительности к антибиотикам с применением автоматического микробиологического анализатора VITEK 2 Compact" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 30 июня 2008 г.)

1. Область применения

Настоящие методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях организаций, независимо от форм собственности, осуществляющих бактериологические исследования с целью выделения и идентификации патогенных биологических агентов (ПБА) бактериальной этиологии (бактерий, грибов) из клинического материала, объектов окружающей среды, а также определения их чувствительности к антимикробным препаратам.

2. Нормативные ссылки

2.1. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

2.2. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IY группы патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

2.3. СанПиН 2.1.7.728-99 "Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений".

2.4. "Временные рекомендации (правила) по охране труда при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Минздрава России". - М., 2002.

2.5. "Инструкция по мерам профилактики распространения инфекционных заболеваний при работе в клинико-диагностических лабораториях лечебных и профилактических учреждений". - М., 1991.

3. Общие положения

Идентификация основана на анализе изменения биохимических субстратов под действием микроорганизмов. Определение чувствительности производится на основании подавления роста микроорганизмов под действием различных концентраций антибиотиков. При этом определяются минимальные ингибирующие концентрации (МИК) антибиотиков, которые выражаются в мг/л и интерпретируются в виде категорий "устойчив", "чувствителен", "умеренно-устойчив".

4. Сущность метода

Работа в анализаторе VITEK 2 Compact проводится с чистой культурой микроорганизма. В качестве расходных материалов используются пластиковые карты, содержащие биохимические субстраты (ID-карты, карты для идентификации) или антибиотики в различных концентрациях (AST-карты, карты для определения чувствительности). Карты под вакуумом, создаваемом анализатором, в автоматическом режиме заполняются суспензией чистой культуры микроорганизмов, запаиваются и помещаются в карусель, где они инкубируются и регулярно (каждые 15 минут) сканируются оптической системой анализатора. При этом для считывания ID-карт используется колориметрия (анализатор содержит 2 оптических модуля и использует волны 660, 428 и 568 нанометров), для считывания AST-карт - турбидиметрия (фиксируются изменение плотности микробной суспензии под влиянием антибиотика). Результаты сканирования подвергаются компьютерной обработке. По завершении идентификации анализатор найдет в базе данных соответствие тестируемому микроорганизму или проведет определение чувствительности к антибиотикам, после чего карта сбрасывается в специальный приемник.

5. Методы отбора и подготовки проб

Исследуемый материал инокулируется на питательные среды согласно методам микробиологических исследований, утвержденных в установленном порядке. Чашки инкубируются 18-24 (48) ч до получения изолированных колоний. Колонии микроорганизмов для исследования на VITEK 2 Compact рекомендуется брать с неселективных питательных сред. Используется только чистая культура микроорганизмов.

6. Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды

Анализатор Vitek 2 Compact

Суспензиальный раствор (0,45% раствор хлорида натрия)

Диспенсер суспензиального раствора

Пластиковые пробирки для анализатора Vitek 2 Compact

Карты для идентификации

Карты для определения чувствительности

Петли бактериологические

Тампоны стерильные

Денситометр

7. Подготовка к испытанию

Перед началом работы необходимо, следуя инструкциям программного обеспечения, ввести информацию об используемых AST-картах, а также произвести ряд общих настроек: настроить печать (автоматическая или по требованию) и прочие параметры, следуя инструкции пользователя по программному обеспечению.

Чистая культура (материал одной или нескольких изолированных колоний) с помощью бактериологической петли или тампона вносится в пластиковую пробирку с суспензиальным раствором и гомогенизируется там до достижения требуемой плотности бактериальной суспензии*:

для грамположительных и грамотрицательных бактерий: 0,5-0,63 McF**,

для прихотливых бактерий: 2,7-3,3 McF,

для бацилл 1,8-2,2 McF,

для грибов: 1,8-2,2 McF.

Выбор карты для исследования производится на основании окраски по Граму или пробы с КОН, позволяющей разделить бактерии на грамположительные и грамотрицательные. При этом следует использовать карты VITEK 2 GP (грам-положительные) или VITEK 2 GN (грамотрицательные) соответственно. Микроорганизмы, прихотливые к условиям культивирования (нейссерии, гемофилы и прочие***) идентифицируются при помощи карт VITEK 2 NH, грибы - карт VITEK 2 YST. Карты VITEK 2 BCL предназначены для идентификации микроорганизмов рода Bacillus.

Пробирки с суспензиями устанавливаются в кассету, напротив них в специальные прорези (слоты) устанавливаются соответствующие карты, так, чтобы относящаяся к карте пластаковая трубочка была погружена в пробирку.

8. Проведение испытания

8.1. Работа в режиме виртуальной кассеты

Виртуальная кассета создается согласно инструкции по программному обеспечению. В соответствующие ячейки образовавшейся таблицы вводится номер штрих-кода (путем считывания штрих-код ридером), рядом с которым проставляются лабораторные номера. Затем созданную "виртуальную кассету" необходимо сохранить в памяти компьютера. (Время от момента сохранения "виртуальной кассеты" до момента загрузки собственно кассеты с картами в прибор не должно превышать 30 минут)

Далее следует приступить к загрузке кассеты с картами в вакуумную камеру анализатора. Перед тем как загружать кассету в камеру следует убедиться (это отображено на маленьком собственном мониторе анализатора), что статус прибора "ok", вакуумная камера готова к работе и в карусели имеется достаточное количество свободных мест. В том случае, если все эти условия соблюдены, можно отрыть дверцу вакуумной камеры, поместить туда кассету с картами, плотно закрыть дверцу и нажать на клавишу "Начать заполнение".

В процессе заполнения карт суспензией в вакуумной камере рекомендуется не отходить от анализатора и, дождавшись (ожидание занимает 70 секунд), когда раздастся сигнал и замигает стрелка индикатора, открыть камеру. При этом разблокируется дверца загрузочного модуля, которую следует открыть и переставить кассету с заполненными картами из одной камеры в другую. Затем дверцы анализатора следует закрыть в произвольной последовательности. Если кассета не будет перенесена из вакуумной камеры в загрузочный модуль в течение 10 минут, прибор не примет ее для дальнейшего исследования.

После помещения кассеты в загрузочный модуль рекомендуется дождаться окончания процесса считывания штрих-кодов (занимает примерно 1 минуту), не отходя от анализатора. Мелодичный сигнал говорит о нормально прошедшем процессе считывания. Грубый звук сигнализирует об имеющихся ошибках. В последнем случае следует установить причину ошибок, вызвав их описание на дисплее анализатора. После нормально прошедшей загрузки индикатор загрузочного модуля будет показывать мигающую синюю стрелку. Кассету с оставшимися пробирками из этой камеры прибора можно извлечь сразу или в другое время (например, при загрузке следующей кассеты).

8.2. Работа в режиме постановки тестов с последующим описанием

При данном режиме работы кассета с картами помещается в вакуумную камеру и дальше - в загрузочный модуль без предварительного этапа внесения данных в компьютер. В этом случае результаты обработки карт в окне результатов изолята появятся только после внесения необходимой информации (лабораторного номера) в таблицу окна постановки тестов с последующим описанием.

8.3. Внесение данных об образце

Внести данные об образце (если эта функция активирована) можно как до момента загрузки карт в анализатор, так и после завершения обработки карт. При этом нужно иметь в виду, что результаты анализов с отсутствующей информацией об образце не будут переноситься в архив.

9. Обработка результатов

После считывания карт полученные результаты анализируются программным обеспечением.

Результаты исследования карт можно просмотреть (распечатать) в соответствующем окне интерфейса.

10. Ограничение метода

Корректная идентификация и определение чувствительности с использованием анализатора VITEK 2 Compact возможны только для микроорганизмов, имеющих клиническое значение.

_____________________________

* Работа с ПБА I-II должна проводиться в соответствии с СП 1.3.1285-03

** Стандарт 1 McF (мутности по МакФарланду) соответствует 300 миллионам бактериальных клеток в мл.

*** Перечень микроорганизмов, идентифицируемых на различных картах, см. в приложении.