Приложение 7. Методика определения нитратов и нитритов в кормах, продуктах питания и биологических жидкостях организма

Приложение 7

Методика
определения нитратов и нитритов в кормах, продуктах питания и биологических жидкостях организма*

Принцип метода

Метод определения нитритов основан на экстрагировании нитритов 2%-ным раствором уксусной кислоты, очистке экстракта и фотометрическом измерении интенсивности окраски, образующейся при взаимодействии нитрит-иона () с ароматическими аминами.

Реакция специфична для нитритов и протекает в две стадии: а) диазотирование нитрит-иона в кислой среде сульфаниловой кислотой, б) взаимодействие диазосоединения с нафтиламинами и образование окрашенного азосоединения, по уравнениям реакций:

Нижний предел обнаружения нитрит-иона в колориметрируемом растворе - 0,02 , нижний предел надежного определения в анализируемой пробе - 0,5 мг/кг.

Метод определения нитратов основан на экстрагировании их 2%-ным раствором уксусной кислоты, очистке экстракта, количественном восстановлении нитратов в нитриты металлическим цинком в уксуснокислом растворе и с последующим фотометрическим измерением интенсивности окраски азосоединения, образующегося при взаимодействии нитрит-иона с ароматическими аминами.

Нижний предел обнаружения нитрат-иона в колориметрируемом растворе , нижний предел надежного определения в анализируемой пробе - .

Данные методические указания предназначены для количественного определения нитратов и нитритов в кормах, продуктах питания и различных биологических жидкостях организма.

Осаждение белков в биологических жидкостях /кровь, молозиво, молоко, плодовые воды, моча/ проводить по Самоджи, для чего к определенному количеству жидкости последовательно прибавляют такие же количества 5%-ного раствора цинка сульфата /тщательно перемешивая стеклянной палочкой/ и 0,3N раствора гидрата окиси бария.

Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр и прозрачный безбелковый фильтрат используют для проведения дальнейших анализов.

В безбелковых фильтратах сначала определяли уровень нитрит-ионов с реактивом Грисса, а затем - сумму нитрит- и нитрат-ионов с помощью реактива Грисса, цинковой пыли /сернокислый марганец и цинковая пыль 10:1/. Интенсивность полученной окраски определяли на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре N 6 /длина волны 536 ммк/, в кюветах с шириной рабочих граней 10 мм, раствор для сравнения - безбелковый фильтрат.

Применяемая методика дает возможность одновременно определить в одной и той же пробе фильтрата нитраты и нитриты. При этом для определения количества ионов необходимо вычесть количество ионов, которое устанавливается с помощью только одного реактива Грисса /без цинковой пыли/, по следующей формуле:

где где X - к-во нитрат-ионов в анализируемом образце, мг/кг или мг/л;

- к-во нитрат-ионов /сумма и /, установленное с помощью реактива Грисса и цинковой пыли, мг/кг или мг/л;

- к-во нитрит-ионов, установленное по методике с реактивом Грисса мг/кг или мг/л;

1,3 - коэффициент пересчета нитрит-ионов в нитрат-ионы.

1. Отбор и подготовка проб.

1.1. Пробы молока и молочных продуктов отбирают по ГОСТ 26809-86, ГОСТ 13928.84.

1.1.1. Пробы растительного происхождения по ГОСТ 13496.0-80, ГОСТ 13586.3-83, ГОСТ 13979.0-68, ГОСТ 17681-82, ГОСТ 4808-75, ГОСТ 23637-79, ГОСТ 23638-79.

1.1.2. Пробы патматериала, биологических жидкостей организма согласно требований ветеринарного законодательства.

1.2. Пробы к анализу готовят следующим образом:

1.2.1. Пробы молока, жидких заменителей цельного молока, сливок отбирают в количестве с точностью до в коническую колбу вместимостью .

1.2.2. Пробы сыра твердого, сыра плавленного, сметаны, творога в количестве 20 г с точностью до 0,01 г /предварительно измельчив с помощью терки или мясорубки/ в коническую колбу вместимостью , добавляют до теплой /50-55°С/ дистиллированной воды тщательно перемешивают стеклянной палочкой.

1.2.3. Пробы сухих молочных продуктов, сухих заменителей молока, сухих молочных смесей для детского питания отбирают в количестве 10 г с точностью до 0,01 г в коническую колбу вместимостью , добавляют до теплой /50-55°С/ дистиллированной воды и тщательно перемешивают до однородного состояния.

ГАРАНТ:

Нумерация подпунктов приводится в соответствии с источником

1.2.3. Пробы крови отбирают в количестве с точностью до 1 в сахарные пробирки /вместимостью до /, добавляют теплой дистиллированной воды и тщательно перемешивают до однородного состояния.

1.2.4. Пробы животного материала /различные органы и ткани/ отбирают /после измельчения на гомогенизаторе/ в количестве 20 г с точностью до 0,01 г и помещает в мерные колбы на и заливают 2%-ным раствором уксусной кислоты до и выдерживают в течение часа при комнатной температуре, периодически помешивая.

1.2.5. Пробы растительного происхождения измельчают на лабораторной мельнице /можно ножницами/, отбирают 2 - 10 г с точностью до 0,01 г и помещают в конические колбы на и заливают 2%-ным раствором уксусной кислоты до и выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре периодически перемешивая.

2. Аппаратура, материалы, реактивы.

Мясорубка или терка, лабораторная электрическая мельница, гомогенизатор. Весы лабораторные ВЛТР-500 или другие лабораторные весы общего назначения 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104-80.

Весы АДВ-200 или другие весы /лабораторные/ общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80.

Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр различных марок.

Колбы конические по ГОСТ 10394-72, вместимостью 50, 200, 250 .

Колбы мерные по ГОСТ 1770-74, вместимостью 50, 100, 500, 1000 .

Цилиндры мерные по ГОСТ 1770-74, вместимостью 25, 50, 100, 250 .

Пипетки /бюретки, дозаторы/ по ГОСТ 20292-74, вместимостью 1, 5, 10, 20 .

Воронки стеклянные по ГОСТ 8613-75.

Палочки стеклянные.

Фильтры обеззоленные по ТУ 6-09-1678-77 /Перед употреблением фильтры необходимо промыть не менее 5 раз дистиллированной водой и высушить в сушильном шкафу в течение 0,5 часа при 70-80°С/.

Активированный уголь марки БАУ-2, ОУ-А.

Кислота уксусная ледяная / / по ГОСТ 61-75, хч/плотность 0,96 .

Цинка сульфат // по ГОСТ 4174-77, хч.

Бария гидроокись // по ГОСТ 4107-78, ч.

Марганец сернокислый // по ГОСТ 435-77, чда

Порошок цинковый марки ПЦ-2 по ГОСТ 12601-67.

Натрия нитрит // по ГОСТ 4197-74, чда.

Калия нитрат // по ГОСТ 4217-74, чда.

Сульфаниловая кислота по ГОСТ 5821-78

L - нафтиламин // по ГОСТ 8827-74, хч.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

3. Подготовка к анализу:

3.1. Приготовление растворов для осаждения белков.

3.1.1. Приготовление 5%-ного раствора цинка сульфата: 89 цинка сульфата // растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью и доводят объем раствора до метки.

3.1.2. Приготовление 0,3 Н раствора бария гидроокиси:

47,48 г бария гидроокись // растворяют дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 1 , доводя объем раствора до метки.

3.2. Приготовление цинковой пыли: в фарфоровую ступку помещают высушенные до постоянного веса при температуре 105°С 10 г марганца сернокислого и 1 г порошок цинковый. Содержимое ступки тщательно растирают пестиком и перемешивают до создания однородной массы в гомогенизаторе. Смесь хранят в банке из темного стекла с притертой пробкой.

3.3. Приготовление реактива Грисса.

а/ 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 150 12%-ного раствора уксусной кислоты;

б/ 0,1 г альфа-нафтиламина растворяют при кипячении в 20 мл дистиллированной воды, затем фильтруют и через фильтр добавляют 150 горячего /60 - 70°/ 12%-ного раствора уксусной кислоты. Оба раствора хранят в холодильнике в плотно закрытой посуде из темного стекла не более 2-х месяцев со дня приготовления. Перед употреблением одну часть раствора "а" смешивают с равной по объему частью раствора "б".

3.4. Приготовление 2%-ного раствора уксусной кислоты: 20,8 уксусной кислоты / плотностью 0,96 / вносят в мерную колбу вместимостью 1 и добавляют дистиллированную воду до метки.

3.5. Приготовление 12%-ного раствора уксусной кислоты: 125 уксусной кислоты / плотностью 0,96 / вносят в мерную колбу вместимостью 1 и добавляют дистиллированную воду до метки.

3.6. Приготовление 10%-ного раствора уксусной кислоты: 104 уксусной кислоты / плотностью 0,96 / вносят в мерную колбу вместимостью 1 и добавляют дистиллированную воду до метки.

3.7. Приготовление основного стандартного раствора нитритов: 0,5 г перекристаллизованного из воды и высушенного при температуре 110 - 120°С до постоянной массы натрия нитрита // взвешенного с точностью до 0,001 г помещают в мерную колбу вместимостью 1 , растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до метки. В 1 мл стандартного раствора содержится 0,8 мг нитрит-иона //. Раствор хранят в склянке с притертой пробкой в холодильнике в течение недели.

3.7.1. Приготовление рабочего раствора нитритов:

25 мл основного стандартного раствора нитритов /3.7./ помещают в мерную колбу вместимостью 500 и доводят дистиллированной водой объем до метки. 1 этого раствора содержит 0,015 мг нитрит-иона //. Раствор готовят в день проведения анализа.

3.8. Приготовление основного стандартного раствора нитратов: 4,890 г перекристаллизованного из воды и высушенного при температуре 110 - 120°С до постоянной массы калия нитрат // взвешивают с точностью до 0,001 г, помещают в мерную колбу вместимостью 1 , растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до метки. В 1 мл стандартного раствора содержится 3 мг нитрат-иона //. Раствор хранят в склянке с притертой крышкой в холодильнике в течение 1 месяца.

3.8.1. Приготовление рабочего раствора нитратов:

20 мл основного стандартного раствора калия нитрата /3.8./ помещают в мерную колбу вместимостью 100 и доводят дистиллированной водой объем до метки. В 1 этого раствора содержится 600 мкг нитрат-иона //. Раствор хранят в склянке с притертой пробкой в холодильнике в течение недели.

4. Построение калибровочного графика на нитриты.

В мерную колбу вместимостью 100 вносят 20 мл рабочего раствора нитритов /3.7.1/, затем добавляют 20 мл 5%-ного раствора цинка сульфата /3.1.1/ тщательно перемешивают, после этого прибавляют 20 мл 0,3 Н р-ра гидрата окиси бария /3.1.2/. Спустя 10 - 15 мин. после тщательного перемешивания фильтруют через обеззоленный фильтр. В 1 мл полученного фильтрата содержится 5 мкг нитрит-иона. Затем в химически чистые пробирки емкостью 20 вносят 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 мл фильтрата рабочего раствора и доводят 2%-ным раствором уксусной кислоты /3.4/ до 5 мл. Рабочие растворы в пробе содержали соответственно 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 мкг //.

В каждую пробирку с 5 мл анализируемого фильтрата добавляли 0,5 мл реактива Грисса, тщательно перемешивали, а через 15 минут колориметрировали на ФЭК при зеленом светофильтре N 6, в кюветах шириной рабочих граней 10 мм. Раствор для сравнения, такое же количество фильтрата, как и в опытной пробе с последовательным добавлением всех реактивов, только вместо реактива Грисса - дистиллированная вода.

По средним из трех определений показаний прибора строили калибровочный график, где по оси ординат откладываем значения оптической плотности, а по оси абсцисс значение концентрации нитрит-иона.

5. Построение градуировочного графика для определения нитратов:

В мерную колбу вместимостью 100 вносят 20 мл рабочего раствора нитратов /3.8.1/, затем добавляют 20 мл 5%-ного раствора цинка сульфата /3.1.1/ тщательно перемешивают, после этого прибавляют 20 мл 0,3 Н р-ра гидрата окиси бария /3.1.2/. Спустя 10 - 15 мин. после тщательного перемешивания фильтруют через обеззоленный фильтр. В 1 мл полученного фильтрата содержится 200 мкг нитрат-иона //. Полученный фильтрат для построения градуировочного графика должен быть только свежеприготовленным.

Затем в химически чистые пробирки емкостью 200 вносят 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 мл фильтрата и доводят до 6 мл 2%-ным раствором уксусной кислоты /3.4/. Рабочие растворы при этом содержат 20; 40; 60; 80; 100; 120; 140 мкг нитрат-иона //. В каждую пробирку с 6 мл анализируемого фильтрата добавляют по 2 мл 10%-ной уксусной кислоты /3.6/ и вносят на кончике скальпеля /15 - 20 мг/ цинковой пыли /3.2/. После тщательного встряхивания в течение 3 мин. в каждую пробирку приливают 1 мл реактива Грисса и снова перемешивают содержимое, а через 10 - 15 мин. колориметрируют анализируемый раствор на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре N 6, в кюветах шириной рабочих граней 10 мм. Раствор для сравнения готовят из такого же количества фильтрата, как и в опытной пробе с последовательным добавлением всех реактивов, только вместо реактива Грисса бралась дистиллированная вода.

По средним из трех определений прибора строят градуировочный график, откладывая по оси ординат значения оптической плотности, а по оси абсцисс значения концентрации нитрат-иона //.

6. Получение безбелковых фильтратов.

Для получения безбелковых фильтратов из подготовленных проб /1.2/ отбирают в пробирки 10 - 20 фильтрата /в зависимости от концентрации и / и добавляют соответственно 5%-ный раствор цинка сульфата /3.8.1/ тщательно перемешивают стеклянной палочкой 5 - 10 мин., затем прибавляют такое же количество 0,3 Н р-ра гидрата окиси бария /3.1.2/. Содержимое после перемешивания в течение 10 - 15 мин. фильтруют через обеззоленный фильтр /фильтрат 1/. Фильтрат 1 служит для определения нитратов и нитритов.

7. Ход анализа.

В пробирки емкостью 20 мл для определения нитратов вносят 6 мл, а нитритов 5 мл фильтрата 1, дальнейший ход анализа осуществляется в таких же условиях, как и при построении градуировочных графиков на нитраты /5/, нитриты /4/. Если в исследуемом фильтрате оптическая плотность окрашенного раствора превышает максимальное значение оптической плотности по градуировочному графику, то цветную реакцию повторяют с меньшими объемам исследуемой воды или фильтрата. Ориентировочную оценку содержания нитратов перед его количественным определением можно провести при помощи индикаторной бумаги.

Примечание I. При плохой фильтрации пробу можно центрифугировать. Если фильтрат имеет окраску, то в фильтрат добавляют активированный уголь /предварительно промытый дистиллированной водой/ и фильтруют повторно через обеззоленный фильтр.

Примечание II. Перед началом анализа необходимо оценить наличие нитратов и нитритов во всех используемых реактивах /холостая проба/, для чего проводят все операции по п. 7 без внесения продукта, а используют дистиллированную воду. Если содержание нитратов и нитритов в "холостой пробе" превышает 0,03 , то используемые в опыте реактивы следует подвергнуть дополнительной очистке /перегонке, перекристаллизации/ или заменить.

Обработка результатов.

1. Определение количества исследуемого материала в анализируемом фильтрате, для нитратов в 6 мл фильтрата, нитритов - в 5 мл фильтрата.

где:

- к-во исследуемого материала в анализируемом фильтрате;

m - объем образца, взятый для анализа, или г;

- объем фильтрата 1, взятый на цветную реакцию , ;

- общий объем экстракта, .

Принимая m=10 г, /для // и 5 для //, = 100 , то

то есть в 6 мл фильтрата для определения // находится 0,6 г анализируемого материала.

2. Определение содержания нитратов // выраженное в мг/л; или мг/кг /в пересчете на нитрат-ион/ вычисляют по формуле:

где:

С - концентрация нитрат-иона в колориметрируемом растворе, найденное по градуируемому графику;

- количество исследуемого материала в анализируемом фильтрате;

1000 - пересчет на литр или кг.

Принимая с = 20 мкг, , то

.

Нитриты рассчитывают аналогично нитратам, только определение исследуемого материала в анализируемом фильтрате берут из расчета 5 мл, которое идет для анализа.