Приложение 7. Методика определения нитратов и нитритов в кормах, продуктах питания и биологических жидкостях организма

Приложение 7

Методика
определения нитратов и нитритов в кормах, продуктах питания и биологических жидкостях организма*

Принцип метода

Метод определения нитритов основан на экстрагировании нитритов 2%-ным раствором уксусной кислоты, очистке экстракта и фотометрическом измерении интенсивности окраски, образующейся при взаимодействии нитрит-иона () с ароматическими аминами.

Реакция специфична для нитритов и протекает в две стадии: а) диазотирование нитрит-иона в кислой среде сульфаниловой кислотой, б) взаимодействие диазосоединения с нафтиламинами и образование окрашенного азосоединения, по уравнениям реакций:

Нижний предел обнаружения нитрит-иона в колориметрируемом растворе - 0,02 , нижний предел надежного определения в анализируемой пробе - 0,5 мг/кг.

Метод определения нитратов основан на экстрагировании их 2%-ным раствором уксусной кислоты, очистке экстракта, количественном восстановлении нитратов в нитриты металлическим цинком в уксуснокислом растворе и с последующим фотометрическим измерением интенсивности окраски азосоединения, образующегося при взаимодействии нитрит-иона с ароматическими аминами.

Нижний предел обнаружения нитрат-иона в колориметрируемом растворе , нижний предел надежного определения в анализируемой пробе - .

Данные методические указания предназначены для количественного определения нитратов и нитритов в кормах, продуктах питания и различных биологических жидкостях организма.

Осаждение белков в биологических жидкостях /кровь, молозиво, молоко, плодовые воды, моча/ проводить по Самоджи, для чего к определенному количеству жидкости последовательно прибавляют такие же количества 5%-ного раствора цинка сульфата /тщательно перемешивая стеклянной палочкой/ и 0,3N раствора гидрата окиси бария.

Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр и прозрачный безбелковый фильтрат используют для проведения дальнейших анализов.

В безбелковых фильтратах сначала определяли уровень нитрит-ионов с реактивом Грисса, а затем - сумму нитрит- и нитрат-ионов с помощью реактива Грисса, цинковой пыли /сернокислый марганец и цинковая пыль 10:1/. Интенсивность полученной окраски определяли на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре N 6 /длина волны 536 ммк/, в кюветах с шириной рабочих граней 10 мм, раствор для сравнения - безбелковый фильтрат.

Применяемая методика дает возможность одновременно определить в одной и той же пробе фильтрата нитраты и нитриты. При этом для определения количества ионов необходимо вычесть количество ионов, которое устанавливается с помощью только одного реактива Грисса /без цинковой пыли/, по следующей формуле:

где где X - к-во нитрат-ионов в анализируемом образце, мг/кг или мг/л;

- к-во нитрат-ионов /сумма и /, установленное с помощью реактива Грисса и цинковой пыли, мг/кг или мг/л;

- к-во нитрит-ионов, установленное по методике с реактивом Грисса мг/кг или мг/л;

1,3 - коэффициент пересчета нитрит-ионов в нитрат-ионы.

1. Отбор и подготовка проб.

1.1. Пробы молока и молочных продуктов отбирают по ГОСТ 26809-86, ГОСТ 13928.84.

1.1.1. Пробы растительного происхождения по ГОСТ 13496.0-80, ГОСТ 13586.3-83, ГОСТ 13979.0-68, ГОСТ 17681-82, ГОСТ 4808-75, ГОСТ 23637-79, ГОСТ 23638-79.

1.1.2. Пробы патматериала, биологических жидкостей организма согласно требований ветеринарного законодательства.

1.2. Пробы к анализу готовят следующим образом:

1.2.1. Пробы молока, жидких заменителей цельного молока, сливок отбирают в количестве с точностью до в коническую колбу вместимостью .

1.2.2. Пробы сыра твердого, сыра плавленного, сметаны, творога в количестве 20 г с точностью до 0,01 г /предварительно измельчив с помощью терки или мясорубки/ в коническую колбу вместимостью , добавляют до теплой /50-55°С/ дистиллированной воды тщательно перемешивают стеклянной палочкой.

1.2.3. Пробы сухих молочных продуктов, сухих заменителей молока, сухих молочных смесей для детского питания отбирают в количестве 10 г с точностью до 0,01 г в коническую колбу вместимостью , добавляют до теплой /50-55°С/ дистиллированной воды и тщательно перемешивают до однородного состояния.

ГАРАНТ:

Нумерация подпунктов приводится в соответствии с источником

1.2.3. Пробы крови отбирают в количестве с точностью до 1 в сахарные пробирки /вместимостью до /, добавляют теплой дистиллированной воды и тщательно перемешивают до однородного состояния.

1.2.4. Пробы животного материала /различные органы и ткани/ отбирают /после измельчения на гомогенизаторе/ в количестве 20 г с точностью до 0,01 г и помещает в мерные колбы на и заливают 2%-ным раствором уксусной кислоты до и выдерживают в течение часа при комнатной температуре, периодически помешивая.

1.2.5. Пробы растительного происхождения измельчают на лабораторной мельнице /можно ножницами/, отбирают 2 - 10 г с точностью до 0,01 г и помещают в конические колбы на и заливают 2%-ным раствором уксусной кислоты до и выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре периодически перемешивая.

2. Аппаратура, материалы, реактивы.

Мясорубка или терка, лабораторная электрическая мельница, гомогенизатор. Весы лабораторные ВЛТР-500 или другие лабораторные весы общего назначения 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104-80.

Весы АДВ-200 или другие весы /лабораторные/ общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80.

Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр различных марок.

Колбы конические по ГОСТ 10394-72, вместимостью 50, 200, 250 .

Колбы мерные по ГОСТ 1770-74, вместимостью 50, 100, 500, 1000 .

Цилиндры мерные по ГОСТ 1770-74, вместимостью 25, 50, 100, 250 .

Пипетки /бюретки, дозаторы/ по ГОСТ 20292-74, вместимостью 1, 5, 10, 20 .

Воронки стеклянные по ГОСТ 8613-75.

Палочки стеклянные.

Фильтры обеззоленные по ТУ 6-09-1678-77 /Перед употреблением фильтры необходимо промыть не менее 5 раз дистиллированной водой и высушить в сушильном шкафу в течение 0,5 часа при 70-80°С/.

Активированный уголь марки БАУ-2, ОУ-А.

Кислота уксусная ледяная / / по ГОСТ 61-75, хч/плотность 0,96 .

Цинка сульфат // по ГОСТ 4174-77, хч.

Бария гидроокись // по ГОСТ 4107-78, ч.

Марганец сернокислый // по ГОСТ 435-77, чда

Порошок цинковый марки ПЦ-2 по ГОСТ 12601-67.

Натрия нитрит // по ГОСТ 4197-74, чда.

Калия нитрат // по ГОСТ 4217-74, чда.

Сульфаниловая кислота по ГОСТ 5821-78

L - нафтиламин // по ГОСТ 8827-74, хч.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

3. Подготовка к анализу:

3.1. Приготовление растворов для осаждения белков.

3.1.1. Приготовление 5%-ного раствора цинка сульфата: 89 цинка сульфата // растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью и доводят объем раствора до метки.

3.1.2. Приготовление 0,3 Н раствора бария гидроокиси:

47,48 г бария гидроокись // растворяют дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 1 , доводя объем раствора до метки.

3.2. Приготовление цинковой пыли: в фарфоровую ступку помещают высушенные до постоянного веса при температуре 105°С 10 г марганца сернокислого и 1 г порошок цинковый. Содержимое ступки тщательно растирают пестиком и перемешивают до создания однородной массы в гомогенизаторе. Смесь хранят в банке из темного стекла с притертой пробкой.

3.3. Приготовление реактива Грисса.

а/ 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 150 12%-ного раствора уксусной кислоты;

б/ 0,1 г альфа-нафтиламина растворяют при кипячении в 20 мл дистиллированной воды, затем фильтруют и через фильтр добавляют 150 горячего /60 - 70°/ 12%-ного раствора уксусной кислоты. Оба раствора хранят в холодильнике в плотно закрытой посуде из темного стекла не более 2-х месяцев со дня приготовления. Перед употреблением одну часть раствора "а" смешивают с равной по объему частью раствора "б".

3.4. Приготовление 2%-ного раствора уксусной кислоты: 20,8 уксусной кислоты / плотностью 0,96 / вносят в мерную колбу вместимостью 1 и добавляют дистиллированную воду до метки.

3.5. Приготовление 12%-ного раствора уксусной кислоты: 125 уксусной кислоты / плотностью 0,96 / вносят в мерную колбу вместимостью 1 и добавляют дистиллированную воду до метки.

3.6. Приготовление 10%-ного раствора уксусной кислоты: 104 уксусной кислоты / плотностью 0,96 / вносят в мерную колбу вместимостью 1 и добавляют дистиллированную воду до метки.

3.7. Приготовление основного стандартного раствора нитритов: 0,5 г перекристаллизованного из воды и высушенного при температуре 110 - 120°С до постоянной массы натрия нитрита // взвешенного с точностью до 0,001 г помещают в мерную колбу вместимостью 1 , растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до метки. В 1 мл стандартного раствора содержится 0,8 мг нитрит-иона //. Раствор хранят в склянке с притертой пробкой в холодильнике в течение недели.

3.7.1. Приготовление рабочего раствора нитритов:

25 мл основного стандартного раствора нитритов /3.7./ помещают в мерную колбу вместимостью 500 и доводят дистиллированной водой объем до метки. 1 этого раствора содержит 0,015 мг нитрит-иона //. Раствор готовят в день проведения анализа.

3.8. Приготовление основного стандартного раствора нитратов: 4,890 г перекристаллизованного из воды и высушенного при температуре 110 - 120°С до постоянной массы калия нитрат // взвешивают с точностью до 0,001 г, помещают в мерную колбу вместимостью 1 , растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до метки. В 1 мл стандартного раствора содержится 3 мг нитрат-иона //. Раствор хранят в склянке с притертой крышкой в холодильнике в течение 1 месяца.

3.8.1. Приготовление рабочего раствора нитратов:

20 мл основного стандартного раствора калия нитрата /3.8./ помещают в мерную колбу вместимостью 100 и доводят дистиллированной водой объем до метки. В 1 этого раствора содержится 600 мкг нитрат-иона //. Раствор хранят в склянке с притертой пробкой в холодильнике в течение недели.

4. Построение калибровочного графика на нитриты.

В мерную колбу вместимостью 100 вносят 20 мл рабочего раствора нитритов /3.7.1/, затем добавляют 20 мл 5%-ного раствора цинка сульфата /3.1.1/ тщательно перемешивают, после этого прибавляют 20 мл 0,3 Н р-ра гидрата окиси бария /3.1.2/. Спустя 10 - 15 мин. после тщательного перемешивания фильтруют через обеззоленный фильтр. В 1 мл полученного фильтрата содержится 5 мкг нитрит-иона. Затем в химически чистые пробирки емкостью 20 вносят 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 мл фильтрата рабочего раствора и доводят 2%-ным раствором уксусной кислоты /3.4/ до 5 мл. Рабочие растворы в пробе содержали соответственно 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 мкг //.

В каждую пробирку с 5 мл анализируемого фильтрата добавляли 0,5 мл реактива Грисса, тщательно перемешивали, а через 15 минут колориметрировали на ФЭК при зеленом светофильтре N 6, в кюветах шириной рабочих граней 10 мм. Раствор для сравнения, такое же количество фильтрата, как и в опытной пробе с последовательным добавлением всех реактивов, только вмест