Приложение 6. Фотоколориметрический гемиглобинцианидный метод определения метгемоглобина крови животных и птиц

Приложение 6

Фотоколориметрический гемиглобинцианидный метод определения метгемоглобина крови животных и птиц*

Метод предназначен для химико-токсикологических, клинических и других исследований свернувшейся (сгустков) и несвернувшейся (цельной) крови на долю метгемоглобина в процентах по отношению к общему гемоглобину.

Методы основаны на уменьшении величины оптической плотности содержащегося в исследуемом растворе крови метгемоглобина (гемиглобина) вследствие перевода его в цианметгемоглобин (гемиглобинцианид) и вычисления процентного соотношения этой величины к такому жe показателю 100%-ного метгемоглобина того же раствора крови.

Принцип определения - фотоколориметрический по прямому определению (установления) величины уменьшения оптической плотности () раствора крови в одной кювете.

Погрешность метода - не более 0,075% при нормальном и 0,227% при 71,1%-ном содержании метгемоглобина от общего гемоглобина.

Выявляемость метода при оптической плотности 0,001 составляет не более 0,3 %.

1. Оборудование, реактивы и растворы

1.1. Оборудование:

- колориметр-нефелометр фотоэлектрический типа "ФЭК-56 М" или другие приборы подобного типа с наличием светофильтра с длиной волны 625-670 НМ;

- центрифуга лабораторная от 4 до 8 тыс. оборотов в мин. типа "ЦЛН-2" или "ЦУМ-1" и др.

- колбы мерные вместимостью 25 ;

- пипетки на 1,5 и 10 ;

- стаканчика стеклянные на 50 ;

- пипетки глазные;

- палочки стеклянные или пластмассовые.

1.2. Реактивы и растворы

- ацетонциангидрин по ТУ 6-09-3558-81 дли ГОСТ 13198-77, 10%-ный раствор (объём/объём), годен до 1 года;

- вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;

- калий железосинеродистый (соль красная кровяная) по ГОСТ 4206-75, хч., 10%-ный раствор (годен 30 дней при хранении в тёмном месте).

2. Подготовка к анализу

2.1. Приготовление раствора крова

2.1.1. Из сгустка крови. От свежего трупа животного (птицы) или из патматериала (из сердца, крупных сосудов) берут в стаканчик сгусток крови массой около 1 г, добавляют 9  воды сгусток тщательно разминают чистым никелированным пинцетом до обесцвечивания комков фибрина. Затем комки фибрина удаляют, а в стаканчик с гемолизатом эритроцитов приливают 15 воды.

2.1.2. Из цельной крови. В 25 мерную колбу наливают около 20 воды, 1 (точно) гепаринизированной (декальцинированной трилоном Б или оксалатной) крови, промывают внутренний канал пипетки несколько раз содержимым колбы (избегая образования пены), объём гемолизата эритроцитов в колбе доводят водой до метки и тщательно перемешивают (разведение крови в 25 раз).

2.1.3. Гемолизаты из стабилизированной крови или сгустка крови переносят в капроновое центрифужные патроны, центрифугируют 15 - 20 мин. при 8 тыс. об/мин. и исследуют не позднее 1 часа после центрифугирования.

3. Проведение анализа

3.1. Устанавливают в рабочее положение светофильтр с длиной волны 630 нм. В левый кюветодержатель помещают 10-миллиметровую кювету с водой, а в правый - такую же кювету с 4 центрифугата раствора крови и устанавливают правый измерительный барабан прибора точно на ноль (по красной шкале).

Открывают световое окно с помощью рукоятки шторки и вращением левого барабана добиваются установки стрелки микроамперметра на ноль.

В кювету с раствором крови вносят 1 каплю раствора ацетонциангидрина (АЦГ) и перемешивают содержимое кюветы стеклянной палочкой. При этом взаимодействие метгемоглобина с цианидом (АЦГ) с образованием цианметгемоглобина заканчивается через 2-3 мин.

Через 2-3 мин. после прибавления раствора АЦГ открывают световое окно прибора и правым измерительным барабаном устанавливают стрелку микроамперметра на ноль. По красной шкале правого барабана отсчитывают показатель уменьшения оптической плотности () раствора крови.

3.2. Правую кювету освобождают от содержимого и 4-5 раз тщательно промывают водой. Затем ополаскивают кювету 0,5 раствора крови, наливают 4 того же раствора крови и устанавливают кювету в правый кюветодержатель. К раствору крови в кювете добавляют 1 каплю 10%-ного раствора красной кровяной соли (ККС), перемешивают другой чистой стеклянной палочкой и оставляют стоять 3 мин. За это время весь кровяной пигмент превращается в метгемоглобин.

Устанавливают правый измерительный барабан точно на ноль, а левый (не открывая светового окна), устанавливают на отметку 0,4 - 0,6 по красной шкале. Открывают шторку светового окна и левым барабаном точно устанавливают стрелку микроамперметра на ноль.

К раствору крови в кювете прибавляют 1 каплю раствора АЦГ, содержимое кюветы перемешивают стеклянной палочкой, устанавливают первый барабан на отметку 0,4 (грубая наводка, без открытия светового окна).

Через 2-3 мин. после прибавления раствора АЦГ открывают световое окно и устанавливают правым измерительным барабаном стрелку микроамперметра на ноль. По красной шкале правого барабана снимают показатель уменьшения оптической плотности () раствора крови, в котором весь гемоглобин был переведен в метгемоглобин.

4. Обработка результатов

4.1. Доля метгемоглобина (в %) к общему гемоглобину (общему пигменту) крови вычисляют по формуле:

, где:

- показатель уменьшения оптической плотности раствора крови после прибавления АЦГ;

- показатель уменьшения оптической плотности 100%-ного метгемоглобинового раствора крови после прибавления АЦГ.

5. Оценка результатов

5.1. Для постановки диагноза при отравлении животных и птицы метгемоглобинобразующими ядами определение доли метгемоглобина к общему гемоглобину является решающим диагностическим показателем.

Обнаружение в крови более 30% метгемоглобина указывает на возможность отравления, а более 60% - на возможную причину падежа животного от отравления метгемоглобинобразующими веществами (ядами).

5.2. Обнаружение в крови животного нормального содержания (до 5%) метгемоглобина исключает потребность проведения химико-токсикологических исследований патматериала на метгемоглобинобразующие вещества (нитриты, бертолетовую соль, красную кровяную соль, анилин и др.). Однако для исключения отравления животных нитрат-ионами (без их редукции в нитриты) необходимо патматериал исследовать на нитраты.

_____________________________

Метод разработан З.Г. Олейником (ВГНКИ).