Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 20481-2013 "Кофе и кофейные продукты. Определение содержания кофеина с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Стандартный метод" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 марта 2014 г. N 238-ст)

Coffee and coffee products. Determination of the caffeine content using high performance liquid chromatography (HPLC). Reference method

Дата введения - 1 июля 2015 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены".

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для определения содержания кофеина в зеленом, жареном и растворимом кофе, в том числе декофеинизированном, а также в растворимых кофейных продуктах (например, смесь кофе/цикорий или кофейный напиток типа капучино).

2 Нормативные ссылки

Следующие ниже ссылочные стандарты являются обязательными при применении настоящего документа.

ISO 3696 Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

ISO 3726 Instant coffee - Determination of loss in mass at 70 degrees С under reduced pressure (Кофе растворимый. Определение потери массы при 70 град. С и пониженном давлении)

ISO 6673 Green coffee - Determination of loss in mass at 105 degrees С [Кофе зеленый (сырой). Определение потери массы при температуре 105°С]

ISO 11817 Roasted ground coffee - Determination of moisture content - Karl Fischer method (Reference method) [Кофе жареный молотый. Определение массовой доли влаги. Метод Карла Фишера (эталонный метод)]

3 Принцип

Кофеин экстрагируют из проб водой при 90°С в присутствии оксида магния. После фильтрации содержание кофеина в экстракте определяют методом ВЭЖХ на колонке RP-18, применяя изократическое элюирование с ультрафиолетовым детектированием приблизительно при 272 нм.

При необходимости содержание кофеина может быть выражено в пересчете на сухое вещество, для чего требуется определение влаги подходящим стандартным методом.

4 Реактивы

Если не установлено иное, то следует использовать только реактивы признанной аналитической чистоты и только воду, соответствующую требованиям ISO 3696, класс 1.

4.1 Метанол, класса для ВЭЖХ.

4.2 Магния оксид (MgO), тяжелый, высокой чистоты*.

Примечание - Использование MgO существенно для срока службы аналитической колонки, особенно для зеленого кофе. Количество используемого MgO зависит от оборудования и от типа кофейного продукта.

Данные о прецизионности в приложении А были получены с использованием процедуры, описанной в настоящем стандарте.

Появление интерферирующих пиков на хроматограмме может быть обусловлено неправильной адсорбцией. В этих случаях используемый MgO подлежит проверке.

4.3 Кофеин (1,3,7-триметилксантин; 1,3,7-триметил-1Н-пурин-2,6(3Н, 7H)-дион; метилтеобромин; ), чистый безводный.

4.4 Подвижная фаза, 24% (об.) водный раствор метанола.

Меры предосторожности - Следует использовать перчатки, средства защиты глаз и готовить реактивы в вытяжном шкафу.

Переносят 240  метанола (см. 4.1) в мерную колбу вместимостью 1 с одной меткой (см. 5.11). Доводят водой до метки, перемешивают и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм (см. 5.2).

Примечание - Изменяя отношение метанола и воды, можно регулировать время удерживания кофеина с целью оптимизации хроматографического разделения на используемой колонке.

4.5 Стандартные растворы кофеина [1]

4.5.1 Исходный раствор, соответствующий концентрации 200 

Взвешивают (0,2000,001) г безводного кофеина (см. 4.3) в мерную колбу вместимостью 1 (см. 5.11). Добавляют достаточное количество теплой воды до половины объема колбы. Перемешивают до полного растворения кофеина, охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки водой и перемешивают.

Раствор устойчив при температуре +4°С в течение месяца. Хранить в холодильнике.

4.5.2 Разбавленный стандартный раствор для обычного кофе, соответствующий концентрации приблизительно 40 

С помощью пипетки (см. 5.12) вносят 50  стандартного исходного раствора кофеина (см. 4.5.1) в мерную колбу вместимостью 250  (см. 5.11). Доводят водой до метки и перемешивают.

Готовят свежий стандартный раствор ежедневно.

4.5.3 Разбавленный стандартный раствор для декофеинизированного кофе, соответствующий концентрации приблизительно 4 

С помощью пипетки (см. 5.12) вносят 5  стандартного исходного раствора кофеина (см. 4.5.1) в мерную колбу вместимостью 250  (см. 5.11). Доводят водой до метки и перемешивают.

Готовят свежий стандартный раствор ежедневно.

4.5.4 Градуировочный график

Для построения градуировочной зависимости используют от трех до пяти точек. Рекомендуется интервал концентраций от 5 до 25  для обычного кофе и от 0,5 до 2,5  для декофеинизированных проб.

5 Оборудование

Используют обычное лабораторное оборудование, в частности:

5.1 Весы аналитические, обеспечивающие взвешивание с точностью 0,1 мг.

5.2 Фильтры мембранные с размером пор 0,45 мкм для фильтрации подвижных фаз и разбавленных экстрактов проб.

5.3 Хроматограф высокоэффективный жидкостный, обеспечивающий выполнение изократического элюирования, оснащенный УФ детектором, установленным на 272 нм (от 270 до 280 нм), или фильтровым детектором (254 нм), а также системой сбора/интеграции данных. Использование дегазатора не является обязательным.

5.4 Колонка хроматографическая для ВЭЖХ минимальной длины 125 мм, заполненная материалом С18 с размером сферических частиц предпочтительно 5 мкм, с эффективностью разделения как минимум 5000 теоретических тарелок. Число теоретических тарелок может быть вычислено исходя из формы пика, полученного при вводе стандартного раствора кофеина (см. 4.7) по формуле

,

(1)

где - время удерживания пика, с;

b - ширина пика на половине высоты, с.

5.5 Мешалка магнитная с нагревателем и установленной водяной баней.

5.6 Ванна ультразвуковая.

5.7 Шприц микролитровый.

5.8 Кофемолка, пригодная для размола зерен жареного кофе.

5.9 Мельница с зубчатым колесом и с охлаждающим кожухом, или лабораторная мельница с лопастями и охлаждающим кожухом, или любой другой прибор, подходящий для размола зерен зеленого кофе.

5.10 Сито с номинальным размером отверстий 630 мкм, соответствующее требованиям [2], серия R 20.

5.11 Колбы мерные с одной меткой вместимостью 1 и 250 , соответствующие требованиям [4], класс А.

5.12 Пипетки вместимостью 50  и 5 , соответствующие требованиям [3], класс А.

6 Отбор пробы

В лабораторию должна быть отправлена репрезентативная проба. Повреждения или изменения во время транспортировки или хранения недопустимы.

Отбор проб настоящим стандартом не регламентируется. Процедура отбора проб должна быть согласована заинтересованными сторонами.

Пробу для анализа следует хранить таким образом, чтобы были предотвращены любые повреждения и изменения состава.

Для испытания продуктов из порошковых смесей требуется как минимум 50 г продукта (для порционных упаковок: минимум пять порций).

7 Подготовка пробы

7.1 Зеленый кофе

Зерна зеленого кофе (см. 5.9) размалывают так, чтобы более 50% массовой доли пробы проходило через сито (см. 5.10). Затем берут пробу для анализа из всего хорошо перемешанного размолотого кофе.

7.2 Жареный кофе

Зерна жареного кофе (см. 5.8) размалывают так, чтобы более 50% массовой доли проходило через сито (см. 5.10). Жареный молотый кофе в потребительской упаковке используют без дальнейшей обработки, за исключением гомогенизации.

7.3 Растворимый кофе

Размалывание для растворимого кофе не требуется.

7.4 Смешанные напитки

Кофейные напитки из порошковых смесей гомогенизируют, используя мельницу (см. 5.8), непосредственно перед экстрагированием для того, чтобы предотвратить разделение.

8 Процедура проведения анализа

8.1 Определение сухого вещества в кофе (необязательное, см. 9.2)

Рассчитывают содержание сухого вещества в кофе, значение которого будет использовано в 9.2, на основе содержания влаги, определенного на анализируемой пробе (см. раздел 7) в соответствии:

- с ISO 6673 для зеленого кофе;

- ISO 11817 для жареного кофе;

- ISO 3726 или [8] для растворимого кофе.

Для других типов кофе и кофейных продуктов процедура определения содержания сухого вещества должна согласовываться между заинтересованными сторонами.

8.2 Проба для анализа

8.2.1 Жареный и зеленый кофе

На аналитических весах (см. 5.1) взвешивают с точностью до 1 мг приблизительно 1 г пробы для анализа (см. 7.1, 7.2) и помещают в мерную колбу вместимостью 250  (см. 5.11).

8.2.2 Растворимый кофе

На аналитических весах (см. 5.1) взвешивают с точностью до 1 мг приблизительно 0,5 г пробы для анализа (см. 7.3) и помещают в мерную колбу вместимостью 250  (см. 5.11).

8.2.3 Смешанные напитки

На аналитических весах (см. 5.1) взвешивают с точностью до 1 мг приблизительно 1 г пробы для анализа (см. 7.4) и помещают в мерную колбу вместимостью 250  (см. 5.11).

8.3 Экстрагирование кофеина

В колбу, содержащую пробу для анализа (см. 8.2.1, 8.2.2 или 8.2.3), добавляют 5 г оксида магния (см. 4.2) и приблизительно 200  воды. Помещают колбу на водяную баню, функционирующую при температуре кипения, и ждут, пока раствор не достигнет температуры как минимум 90°С. Продолжают нагревание колбы в водяной бане 20 мин, перемешивают время от времени, покачивая или встряхивая. Снимают мерную колбу с водяной бани, охлаждают до комнатной температуры водопроводной водой и восполняют объем водой. Ждут, пока не произойдет осаждение твердого вещества.

Берут аликвоту раствора и фильтруют через фильтр с порами 0,45 мкм (5.2), отбрасывая первые несколько кубических сантиметров. Полученный фильтрат готов для разделения методом ВЭЖХ.

8.4 Проведение анализа

8.4.1 Настройка оборудования

Примечание - Подвижную фазу перед использованием следует дегазировать в течение 20 мин в ультразвуковой ванне (см. 5.6) или продуть гелием. Если хроматограф оборудован дегазатором, достаточно 10 мин.

Готовят хроматограф (см. 5.3) в соответствии с инструкциями изготовителя и устанавливают следующие параметры хроматографического разделения:

- скорость потока подвижной фазы (см. 4.4): 1,0 ;

- УФ детектор устанавливается на длину волны 272 нм (254 нм при использовании фильтрового детектора). Необходимо обеспечить, чтобы диапазон чувствительности детектора соответствовал пику стандартного раствора (при использовании нескольких стандартных растворов - максимальному пику).

8.4.2 Хроматографический анализ

Как только скорость потока подвижной фазы и соответствующее давление становятся стабильными, оставляют систему как минимум на 10 мин для достижения равновесия. Затем вводят 0,01  стандартного раствора в колонку, используя микролитровый шприц (5.7), с последующим введением равного объема экстракта пробы для анализа (8.3). При использовании одного стандартного раствора, его вводят с регулярными интервалами (обычно после шести экстрактов пробы). После каждой серии тщательно промывают хроматографическую систему и колонку метанолом 50% (об.) (см. 4.1) и водой и устанавливают на колонку заглушки, если они удалялись.

9 Обработка результатов

9.1 Содержание кофеина в пробе

Вычисляют содержание кофеина, , выраженное в процентах по массе, численно эквивалентное г/100 г кофе по формуле

,

(2)

где - площадь пика, полученного для анализируемого раствора, в произвольных единицах;

- концентрация стандартного раствора кофеина, ;

V - объем экстракта, определенный в 8.2, (V = 0,25 );

- площадь пика, полученного для стандартного раствора кофеина, в произвольных единицах;

- масса пробы, г.

Примечание - Высоту пика можно использовать как альтернативу площади пика.

Если используют более одного стандартного раствора, строят линейный градуировочный график для стандарта кофеина, чтобы получить значение угла наклона и точки пересечения. Этот градуировочный график используют для вычисления концентрации кофеина в пробе.

В качестве результата берут среднеарифметическое значение двух определений при соблюдении условия повторяемости (см. 10.2).

9.2 Определение содержания кофеина в пробе на основе массы сухого вещества (необязательное, см. 8.1)

Вычисляют содержание кофеина, , выраженное в процентах по массе, численно эквивалентное г/100 г (в пересчете на сухое вещество), по формуле

,

(3)

где - содержание сухого вещества в пробе, г/100 г, определенное в соответствии с 8.1.

В качестве результата берут среднеарифметическое значение результатов двух определений при соблюдении условия повторяемости (см. 10.2).

10 Прецизионность

10.1 Межлабораторные испытания

Подробности межлабораторных испытаний для определения прецизионности метода приведены в приложении А.

Пределы повторяемости и воспроизводимости по [5] (пункты 3.16 и 3.20 соответственно), определены по [6], [7] (пункт 4.1.4).

Для оценки предела воспроизводимости по Горвитцу использовали функцию Горвитца [9].

Значения, полученные в этом межлабораторном испытании, не применимы к другим интервалам концентраций и образцам.

Данные о прецизионности по [5] приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Средние значения, пределы повторяемости и воспроизводимости

Образец/продукт	Содержание кофеина, % (по массе)	Повторяемость r, % (по массе)	Воспроизводимость R, г кофеина/100 г кофе
	Зеленый кофе
Декофеинизированный (Decaf) Decaf Arabics Robusta	0,057 0,075 1,14 2,18	0,004 0,003 0,05 0,096	0,006 0,009 0,15 0,37
Жареный кофе
Decaf Смесь Decaf/обычный Обычный	0,055 0,642 1,22	0,007 0,055 0,053	0,026 0,091 0,176
Порошковый кофейный напиток
Капучино	0,403	0,024	0,068
Растворимый кофе
Decaf Decaf Обычный Freeze Dried Гранулированный	0,072 0,109 2,51 3,19	0,004 0,008 0,050 0,085	0,024 0,030 0,23 0,372
Растворимая смесь
Кофе/цикорий	2,45	0,066	0,216

10.2 Повторяемость

Абсолютное значение разности двух независимых испытаний, проведенных с использованием одного и того же метода, на одном и том же испытуемом материале, в одной и той же лаборатории, на одном и том же оборудовании, одним и тем же оператором в течение небольшого промежутка времени, не должно превышать значений предела повторяемости r, приведенных в таблице А.1 приложения А, более чем в 5% испытаний.

10.3 Воспроизводимость

Абсолютное значение разности двух независимых испытаний, проведенных с использованием одного и того же метода, на одном и том же испытуемом материале, в различных лабораториях, на различном оборудовании, разными операторами, не должны превышать значений предела воспроизводимости R, приведенных в таблице А.1 приложения А, более чем в 5% испытаний.

11 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен содержать:

- информацию, необходимую для идентификации пробы;

- информацию о методе испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

- результаты испытаний;

- полученный окончательный результат, если проводилась проверка повторяемости;

- детали испытания, не установленные в настоящем стандарте, или считающиеся необязательными, а также подробности всех обстоятельств, которые могут повлиять на результат.

_____________

* Примером продукции, имеющейся в продаже, является Merck 105867. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой данной продукции со стороны ISO.

Библиография

[1]	ISO 30:1992	Термины и определения, используемые в области стандартных образцов
[2]	ISO 565	Сита контрольные. Проволочная ткань, перфорированные пластины и листы, изготовленные гальваническим методом. Номинальные размеры отверстий
[3]	ISO 648	Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной меткой
[4]	ISO 1042	Посуда лабораторная стеклянная. Мерные колбы с одной меткой
[5]	ISO 5725-1:1994	Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Общие принципы и определения
[6]	ISO 5725-2:1994	Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод для определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений
[7]	ISO 5725-6:1994	Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
[8]	ISO 20938	Кофе быстрорастворимый. Определение содержания влаги. Метод Карла Фишера (Контрольный метод)
[9]	М. Thompson, S.L.R. Ellison, R. Wood, FOR THE INTERDIVISIONAL WORKING PARTY FOR HARMONIZATION OF QUALITY ASSURANCE SCHEMES. The International Harmonized Protocol for the proficiency testing of analytical chemistry laboratories: IUPAC Technical Report. Pure Appl. Chem. 2006, 78, pp. 145 - 196 Available (2007-12-06) at: http://www.iupac.org/publications/pac/2006/pdf/7801x0145.pdf
[10]	W. Horwitz, R. Albert, The Horwitz ratio (HorRat): A useful index of method performance with respect to precision. J AOAC Int. 2006, 89, pp. 1095 - 1109