Приложение А (справочное). Основные методы идентификации

Приложение А
(справочное)

Основные методы идентификации

А.1 Приготовление чистой культуры

А.1.1 Общее требование

Приготовление чистой культуры начинают с селекции колонии на или в агаровой среде, которая была инокулирована разбавлением тест-пробы или культурой.

Затем выбранную колонию инокулируют на неселективной агаровой культуральной среде. После инкубации выбирают хорошо изолированную колонию. Повторяют операцию, если это необходимо.

Используют методы чашечного высевания, описанные в А.1.2. Различные методы могут оказаться необходимыми в специальных случаях.

А.1.2 Чашечное высевание

А.1.2.1 Общие требования

Отбирают небольшое количество с поверхности хорошо изолированной колонии кончиком стерильной петли.

Затем высевают либо непосредственно с клетками, присутствующими на петле (А.1.2.2), либо приготавливают суспензию из этих клеток (А.1.2.3).

А.1.2.2 Прямой метод: Пример

Кончиком петли инокулируют (близко расположенными штрихами) часть, приблизительно в одну треть площади, поверхности агаровой среды. Стерилизуют и охлаждают петлю. С края инокулированной площади получают другой ряд штрихов, менее плотно расположенных, чем в первый раз, на одной половине оставшейся еще не инокулированной площади поверхности. Повторяют операцию на оставшейся площади поверхности, располагая штрихи еще более широко (см. рисунок А.1).

"Рисунок А.1 - Пример чашечного посева: прямой метод"

А.1.2.3 Метод c использованием разбавления

Суспендируют клетки в селективном разбавлении объемом 1 - 2 , проводя инокулированной петлей по стенке пробирки у поверхности жидкости, затем хорошо перемешивают.

Стерилизуют и охлаждают петлю. С помощью петли отбирают небольшое количество микробной суспензии и продолжают согласно А.1.2.2.

А.1.3 Инкубация

Переворачивают инокулированные чашки Петри и помещают их в термостат на заданный период времени при заданной температуре.

А.1.4 Селекция

После инкубации выбирают хорошо изолированную колонию из чашки либо для последующего высевания, либо для проводимых испытаний.

Если возможно, то окончательные испытания следует проводить, используя клетки, выращенные из одной единственной колонии. В случае недостаточного клеточного материала в одной колонии сначала необходимо осуществить субкультивирование в жидкой среде или на скошенной агаровой среде, после чего субкультуру можно использовать для проведения испытаний.

А.2 Окраска по Граму (модифицированный метод Хакера)

А.2.1 Общие требования

Данное окрашивание бактериальных клеток допускает описание морфологии бактерий и их классификацию на две группы в зависимости от того, способны они удерживать фиолетовую окраску кристаллического фиолетового красителя в условиях испытаний или нет. Подобное деление обусловлено, главным образом, различиями в структуре клеточных стенок двух групп и коррелируется с другими существенными различиями между этими двумя группами. Существует ряд способов рассмотрения окраски по Граму, однако все они следуют последовательностям, приводимым ниже.

А.2.2 Растворы

А.2.2.1 Общие требования

Могут использоваться технически чистые растворы. В этом случае следуют рекомендациям изготовителя.

А.2.2.2 Раствор кристаллический фиолетовый

А.2.2.2.1 Химический состав

Кристаллический фиолетовый	- 2,0 г;
Этиловый спирт (95%)	- 20 ;
Оксалат аммония ()	- 0,8 г;
Вода	- 80 .

А.2.2.2.2 Приготовление

Растворяют фиолетовый кристаллический в этиловом спирте и оксалат аммония - в дистиллированной воде. Смешивают два раствора и дают отстояться смеси в течение 24 ч перед применением.

А.2.2.3 Раствор йода

А.2.2.3.1 Химический состав

Йод	- 1,0 г;
Йодид калия (KI)	- 2,0 г;
Вода	- 100 .

А.2.2.3.2 Приготовление

Йодид калия растворяют в 10  дистиллированной воды, добавляют частями йод. После растворения доводят объем раствора в мерной колбе до 100 .

А.2.2.4 Раствор сафранина

А.2.2.4.1 Химический состав

Сафранин О	- 0,25 г;
Этиловый спирт (95%)	- 10 ;
Вода	- 100 .

А.2.2.4.2 Приготовление

Растворяют сафранин в этиловом спирте, затем смешивают с дистиллированной водой. Доводят объем раствора до 100 .

При использовании раствора фиолетового кристаллического проверяют стабильность раствора. Для проверки смешивают одну каплю раствора кристаллического фиолетового с одной каплей раствора йода на предметном стекле, чтобы проследить за химической реакцией. Если на стекле видна кристаллизация, раствор фиолетового кристаллического не используют.

А.2.2.5 Метод окрашивания

После фиксации на предметном стекле (например, пламенем) бактериального мазка, приготовленного из 18 - 24-часовой культуры или из помутневшего бульона, покрывают мазок раствором кристаллического фиолетового (А.2.2.2). Дают реагировать в течение 1 мин.

Осторожно промывают наклоненное предметное стекло водой в течение нескольких секунд.

Покрывают предметное стекло раствором йода (А.2.2.3). Дают ему реагировать в течение 1 мин. Затем осторожно промывают наклоненное предметное стекло водой в течение нескольких секунд.

Наносят осторожно и непрерывно пленку этилового спирта (95%) на наклонное предметное стекло не более чем 30 с и до тех пор, пока не перестанет выступать фиолетовый цвет.

Наклоненное предметное стекло осторожно промывают водой в течение нескольких секунд.

Предметное стекло покрывают раствором сафранина (А.2.2.4) в течение 10 с.

Осторожно промывают наклоненное предметное стекло водой.

Предметное стекло высушивают.

А.2.2.6 Интерпретация

Исследуют предметное стекло под объективом микроскопа с большим увеличением (4.13). Те бактериальные клетки, которые окрасились в синий или фиолетовый цвет, относят к числу грамположительных, окрашенные в темно-розовый и красный - к грамотрицательным.

В отношении чистой культуры некоторых бактериальных типов как грамположительные, так и грамотрицательные клетки могут быть получены в одном и том же поле зрения микроскопа.

Примечание - У плотноупакованных клеток может отмечаться нехарактерная реакция.

А.3 Тест на каталазу

А.3.1 Общие требование

Обнаружение этого фермента, который разлагает перекись водорода () на воду и кислород, может быть проведено с помощью бульонной культуры, агаровой культуры или одной единственной колонии на агаровой среде.

А.3.2 Из бульонной культуры

Добавляют в 1  культуры 0,5  10-объемного [3% (массовая доля)] раствора перекиси водорода. Отмечают возникновение пузырьков кислорода (каталазоположительных) или их отсутствие (каталазоотрицательных).

А.3.3 Из агаровой культуральной среды

Покрывают культуру 1 - 2  10-объемного [3% (массовая доля)] раствора перекиси водорода.

Наблюдают сразу же и по истечении 5 мин независимо от того, сформировались ли пузырьки кислорода или нет.

А.3.4 Из колонии

Вводят раздельно две капли 10-объемного раствора перекиси водорода на предметное стекло микроскопа.

Отбирают колонию с помощью стерильной стеклянной или пластиковой палочки (но только не металлической иглы) и осторожно эмульгируют ее в одну из этих двух капель. Наблюдают сразу же и через несколько минут (не менее 1 мин), сформировались или нет пузырьки кислорода. В случае сомнения покрывают каждую каплю покровным стеклом и сравнивают возникновение пузырьков под обоими покровными стеклами.

Наблюдение можно проводить макроскопически или используя микроскоп с малым увеличением.

А.4 Тест на оксидазу

А.4.1 Общее требование

Обнаружение оксидазы выявляют путем изменения цвета соединения во время окисления под действием данного фермента.

А.4.2 Реагент

А.4.2.1 Химический состав

N,N,N',N'-тетраметил-3-р-фенилендиаминдигидрохлорид () 1,0 г.

Вода 100 .

А.4.2.2 Приготовление

Растворяют реагент в холодной воде. Приготавливают реагент непосредственно перед его использованием.

Могут использоваться технически чистые диски или палочки. В этом случае следуют рекомендациям изготовителя.

А.4.2.3 Метод

Увлажняют фильтровальную бумагу реагентом. Берут пробу бактериальной культуры, полученной из агаровой среды, с помощью платиновой иглы или стеклянной или пластиковой палочки (никельхромовая игла дает ложный положительный результат) и наносят ее на смоченную фильтровальную бумагу.

А.4.2.4 Интерпретация полученного результата

В случае присутствия оксидазы появляется фиолетово-пурпурный цвет в течение 5 - 10 с. Если цвет не изменился в течение 10 с, тест рассматривается как отрицательный.

А.5 Использование биохимических тестов на идентификацию микроорганизмов

Для идентификации могут использоваться существующие в настоящее время биохимические тесты. Вместе с тем, все коммерческие тесты не обеспечивают одинаковый уровень надежности. Следовательно, их рабочие характеристики должны оцениваться перед использованием, если только они не были подтверждены изготовителем и/или независимой организацией.