Методические рекомендации MP 4.2.0089-14 "Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) для индикации и идентификации возбудителей I - II групп патогенности" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 24 апреля 2014 г.)

4.2. Методы контроля. биологические и микробиологические факторы

Методические рекомендации
MP 4.2.0089-14
"Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) для индикации и идентификации возбудителей I - II групп патогенности"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 24 апреля 2014 г.)

Дата введения - 24 апреля 2014 г.

Введены впервые

1. Область применения

Настоящие методические рекомендации предназначены для специалистов лабораторий, осуществляющих диагностические, мониторинговые и научные исследования с возбудителями опасных инфекционных болезней.

Методические рекомендации по использованию метода масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией для идентификации возбудителей чумы, холеры и туляремии включают описание применения масс-спектрометрии для видовой идентификации микроорганизмов - возбудителей опасных инфекционных заболеваний. Описание охватывает такие разделы, как культивирование исследуемых штаммов, получение из них белковых препаратов, снятие спектров, дополнение базы данных референсных спектров, проведение идентификации с использованием расширенной базы данных, интерпретацию полученных результатов, приводится список используемых реактивов и расходных материалов.

2. Общие положения

Масс-спектрометрический анализ (МС-анализ) является аналитической процедурой, физическим методом исследования, в процессе которого осуществляется измерение отношения массы заряженных частиц материи (ионов) к их заряду. Полученный результат - спектральный сигнал - представляет собой рассортировку заряженных частиц по значению отношения молекулярной массы иона к его заряду.

Первоначально, с момента разработки, МС-анализ применялся в основном в аналитической и биологической химии и физике для изучения химического и изотопного состава веществ, в том числе и многокомпонентных, сложных биополимеров, их структуры и химических модификаций.

Для исследования применяется прибор - масс-спектрометр. Несмотря на большое количество различных моделей инструментов для МС-анализа, любой прибор включает три компонента: источник ионов (ионизатор), систему разделения ионов и систему детекции ионов. Ионизатор переводит исследуемый образец в ионизированную форму. Существует большое количество систем ионизации, ее выбор зависит от типа исследуемых молекул, агрегатного состояния образца (твердого, жидкого, газообразного). Далее ионизированные компоненты образца оказываются в системе разделения ионов, которая, используя различные физические механизмы, ранжирует их по значению отношения массы иона к заряду. Детектор регистрирует образовавшиеся и рассортированные ионы, позволяя генерировать визуальный спектр, на котором в виде пиков различной интенсивности представлены отношения массы иона к заряду всех ионизированных компонентов исследуемого образца.

Последнее десятилетие ознаменовалось активным внедрением одного из видов МС-анализа, метода матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (англ. Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) с времяпролетным разделением (англ. Time of Flight, ToF) ионов (MALDI-ToF-MS), в клиническую микробиологию для идентификации микроорганизмов. MALDI - метод мягкой ионизации, позволяющий ионизировать биологические макромолекулы (пептиды, белки, ДНК, олигонуклеотиды, липополисахариды и сахара) в присутствии особого вещества, "матрицы", под воздействием лазера. Полученные ионы, преимущественно однозарядные, ранжируются во времяпролетной системе разделения за счет разной скорости перемещения, обратно пропорциональной массе иона. Зная длину пути перемещения иона от ионизатора до детектора, а также время этого перемещения, можно вычислить скорость движения иона и на основании ее значения рассчитать массу частицы.

Использование в качестве исследуемого образца чистой культуры микроорганизма или его экстрактов позволяет получить спектр, характеризующий качественный молекулярный состав исследуемого объекта. Получаемый спектральный паттерн является уникальной видо-, а в некоторых случаях и штаммоспецифичной характеристикой, позволяющей однозначно идентифицировать микроорганизм до вида, а в некоторых случаях осуществить и внутривидовую дифференциацию или определить дополнительные свойства микроорганизма, в том числе и клинически значимые.

Собранные в процессе анализа спектры исследуемых микроорганизмов могут сравниваться с референсными спектрами, присутствующими в базе данных, поставляемых производителями вместе с оборудованием для MALDI-ToF MS. При определенном проценте совпадений выводится результат о таксономической принадлежности исследуемого объекта.

3. Требования к организации работ

Работу в микробиологической лаборатории с пробами материалов, содержащих возбудителей опасных инфекционных болезней бактериальной природы, на MALDI-ToF масс-спектрометре выполняют в соответствии с действующими нормативными и методическими документами.

Пробы, содержащие или подозрительные на содержание возбудителей опасных инфекционных болезней, подготавливают и обеззараживают в "заразной" зоне в боксах биологической безопасности II класса. Работу с подготовленными пробами осуществляют после их выноса из микробиологического бокса или из "заразной" зоны в зависимости от того, где установлен MALDI-ToF масс-спектрометр. Средства индивидуальной защиты и тип дезинфицирующего раствора определяются конкретным видом возбудителя, с которым проводятся работы, в соответствии с действующими нормативными и методическими документами.

Каждое структурное подразделение (лаборатория), проводящее работы по индикации возбудителей опасных инфекционных болезней на MALDI-ToF масс-спектрометре, должно иметь санитарно-эпидемиологическое заключение о соответствии санитарно-эпидемиологическим правилам и нормативам при проведении работ с возбудителями опасных инфекционных болезней.

Исследования методом MALDI-ToF масс-спектрометрии проводят в организациях, имеющих лицензию на деятельность, связанную с возбудителями инфекционных болезней, в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения данных работ, выданных в установленном порядке.

4. Культивирование микроорганизмов

Стандартная среда культивирования бактерий для MALDI-ToF MS анализа - кровяной агар (прилож. 1), содержащий 5% овечьей крови.

Допускается исследование культур, полученных на других питательных средах, а также с различных фаз роста или выращенных при разных температурах. Следует помнить, что наилучшие результаты получаются при использовании условий (среда, фаза роста, температура), идентичных тем, что были использованы для культивирования образцов, использованных для создания референсных единиц базы данных.

Для масс-спектрометрического анализа необходимо использовать только чистые культуры или изолированные колонии микроорганизмов, выращенных с соблюдением условий, специфических для каждого патогена. В случае работы с медленнорастущими микроорганизмами допускается использование культур, выращиваемых более суток. Если в исследуемом образце содержатся микроорганизмы более чем одного вида, то идентификация пройдет некорректно.

Все манипуляции с живыми ПБА I - II групп проводятся в боксах биологической безопасности II В класса, с ПБА III - IV групп - в боксах биологической безопасности IIА класса.

При выполнении работ необходимо руководствоваться действующими нормативными правовыми и методическими документами, регламентирующими требования биологической безопасности при проведении работ с возбудителями инфекционных заболеваний, а также иными документами и внутренними инструкциями, разработанными и согласованными с органом по контролю соблюдения требований биологической безопасности учреждения, утвержденными руководителем, регламентирующими работу с возбудителями I-IV группы патогенности.

4.1. Культивирование возбудителя чумы

Для исследования используют чистые культуры суточного роста. Исследуемые штаммы Y. pestis выращивают на питательном агаре для культивирования микроорганизмов общего назначения, рН 7,2 (прилож. 1), в течение 24 ч при температуре 28°С. Полученные суточные культуры используют для приготовления образцов для масс-спектрометрии. Культуры возбудителя чумы подвергают предварительной экстракции белка перед нанесением на чип (мишень).

4.2. Культивирование возбудителя холеры

Культуры, выросшие на щелочном агаре (рН7,6) в течение 18 - 24 ч (прилож. 1), проверяют в ориентировочной слайд-агглютинации с холерными сыворотками 01 в разведении 1:100, РО и О139 в разведении 1:50. Культуры, агглютинирующиеся одной из серогруппоспецифических сывороток, исследуют масс-спектрометрически с предварительной экстракцией белка, не агглютинирующиеся - прямым нанесением на MSP-чип.

4.3. Культивирование возбудителя туляремии

Культивирование проводят на чашках с FT-агаром (прилож. 1) в течение 72 ч при температуре 37°С. Культуры возбудителя для масс-спектрометрического исследования подвергают предварительной экстракции белка перед нанесением на чип (мишень).

4.4. Культивирование возбудителя сибирской язвы

Культивирование проводят на чашках с агаром Хоттингера (рН 7,2) в течение 24 ч при температуре 37°С (прилож. 1). Культуры возбудителя для масс-спектрометрического исследования подвергают предварительной экстракции белка перед нанесением на чип (мишень).

5. Подготовка проб для масс-спектрометрии

5.1. Экстракция белков с использованием муравьиной кислоты

Данный метод применяют для возбудителей I - II групп патогенности (за исключением спорообразующих микроорганизмов, дрожжей, грибов) - возбудителей чумы, туляремии и холеры, агглютинирующих с одной из указанных серогруппоспецифических сывороток.

Проведение экстракции:

1. Готовят и маркируют необходимое число микропробирок, соответствующее числу исследуемых штаммов.

2. В каждую пробирку вносят 300 мкл деионизованной воды.

3. Микробиологической петлей диаметром 1 мм в пробирку вносят одну изолированную колонию возбудителя и плавными движениями суспендируют.

4. К суспензии добавляют 900 мкл 96%-го этилового спирта.

5. Полученную смесь тщательно перемешивают на микроцентрифуге-вортексе.

6. После перемешивания пробирки помещают в центрифугу (необходимо сохранять ориентацию пробирок после помещения их в ротор) и центрифугируют в течение 2 мин при 13 тыс. об/мин.

7. Полученный супернатант аккуратно, не задевая осадка, отбирают одноразовым наконечником и сливают в емкость с дезинфицирующим раствором.

8. Этапы 6 и 7 повторяют для удаления остатков раствора этанола.

9. К осадку добавляют 25 мкл 70%-го водного раствора муравьиной кислоты, полученную смесь тщательно перемешивают пипетированием или на микроцентрифуге-вортексе (объем муравьиной кислоты зависит от первоначального количества культуры, взятой в исследование, и может варьировать от 1 до 80 мкл).

10. К суспензии добавляют равный объем ацетонитрила и смесь повторно тщательно перемешивают.

11. После перемешивания пробирки помещают в центрифугу (необходимо сохранять ориентацию пробирок после помещения их в ротор) и центрифугируют в течение 2 мин при 13 тыс. об./мин.

12. В лунку MSP-чипа вносят 1 мкл полученного супернатанта. Для каждой исследуемой единицы (колония, штамм) используют 5 лунок для получения достоверного результата.

13. Сразу после высыхания нанесенной на чип капли супернатанта сверху наносят 1 мкл матрицы (прилож. 3, 5).

14. В лунку H12 MSP-чипа вносят 1 мкл калибровочного стандарта для масс-спектрометрии, на который также после высыхания наносят 1 мкл матрицы. Необходимо дождаться высыхания раствора матрицы, после чего можно приступать к масс-спектрометрическим исследованиям.

15. После проведения мероприятий по заключительной дезинфекции рабочей зоны бокса 70%-м спиртом чип с нанесенными на него образцами может быть перенесен в "чистую" зону для дальнейшего анализа.

5.2. Экстракция белков с использованием трифторуксусной кислоты

Данный метод применяют для спорообразующих возбудителей инфекционных болезней II - IV групп патогенности:

1. Готовят и маркируют необходимое число микропробирок, соответствующее числу исследуемых штаммов.

2. В каждую пробирку вносят 300 мкл деионизованной воды.

3. Микробиологической петлей диаметром 1 мм в пробирку вносят одну изолированную колонию возбудителя, аккуратными, плавными движениями тщательно суспендируют.

4. В микропробирку добавляют 50 мкл 80%-й ТФУ и перемешивают пипетированием.

5. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.

6. Добавляют 150 мкл ультрачистой .

7. Добавляют 200 мкл ацетонитрила и перемешивают пипетированием.

8. Центрифугируют микропробирки в течение 2 мин при 13 000 об./мин.

9. В лунку MSP-чипа вносят 1 мкл полученного супернатанта. Для каждой исследуемой единицы (колония, штамм) используют 5 лунок для получения достоверного результата.

10. Сразу после высыхания нанесенной на чип капли супернатанта сверху наносят 1 мкл матрицы (прилож. 3, 5).

11. В лунку Н12 MSP-чипа вносят 1 мкл калибровочного стандарта для масс-спектрометрии, на который также после высыхания наносят 1 мкл матрицы. Необходимо дождаться высыхания раствора матрицы, после чего можно приступать к масс-спектрометрическим исследованиям.

12. После проведения мероприятий по заключительной дезинфекции рабочей зоны бокса 70%-м спиртом чип с нанесенными на него образцами может быть перенесен в "чистую" зону для дальнейшего анализа.

5.3. Прямое нанесение образцов на мишень

Данный метод применяют для микроорганизмов III - IV групп патогенности, в частности штаммов V. cholerae, не агглютинирующихся ни с одной из указанных серогруппоспецифических сывороток.

Одну изолированную колонию возбудителя захватывают одноразовой микробиологической петлей (стерильной зубочисткой) и равномерно наносят на лунку MSP-чипа, не выходя за края. Для каждой исследуемой единицы (колония, штамм) используют 5 лунок для получения достоверного результата.

Сразу после высыхания нанесенной на чип биомассы сверху наносят 1 мкл матрицы.

В лунку Н12 MSP-чипа вносят 1 мкл калибровочного стандарта для масс-спектрометрии, на который также после высыхания наносят 1 мкл матрицы. Необходимо дождаться высыхания раствора матрицы, после чего можно приступать к масс-спектрометрическим исследованиям.

После проведения мероприятий по заключительной дезинфекции рабочей зоны бокса 70%-м спиртом чип с нанесенными на него образцами может быть перенесен в "чистую" зону для дальнейшего анализа.

6. Проведение MALDI-ToF масс-спектрометрии

Идентификацию проводят на масс-спектрометрах. На первом этапе идентификации программные продукты, прилагаемые к масс-спектрометрам (прилож. 2), производят сбор исходных спектров исследуемых образцов. Для получения одиночного масс-спектра используют 40 импульсов лазера (частота 60 Гц), анализируемый диапазон масса/заряд составляет 2 000 - 20 000 Да. С каждой лунки чипа снимается исходный спектр, представляющий собой сумму шести одиночных спектров (240 импульсов лазера). Для получения достоверных результатов идентификации с каждого образца необходимо получить не менее пяти исходных спектров.

7. Учет и интерпретация результатов

С помощью программ (прилож. 2) проводится автоматическая идентификация на основании сравнения собранных исходных спектров с референсными спектрами базы данных. По окончании процесса идентификации программа отображает результат идентификации, приводя наиболее ревалентную исходному спектру таксономическую единицу базы данных с указанием значения коэффициента соответствия. Чем выше коэффициент соответствия, тем вероятнее классификация вида. Для лучшего восприятия результаты идентификации помечены одним из трех цветов: зеленый, желтый или красный. Значение коэффициента соответствия большее или равное 2,0 рассматривается как достоверная идентификация (зеленый цвет).

После завершения процесса идентификации результат выводится в таблицу классификации, показывающую наилучший результат идентификации полученных спектров. Достоверность полученных результатов характеризуется значением "Score" и соответствующим цветовым, сим-вольным и буквенным обозначением.

Диапазон Score	Описание	Символы	Цвет
2.300 - 3.000	Высокий уровень видовой идентификации	(+++)	Зеленый
2.000 - 2.299	Надежная родовая идентификация, возможная видовая идентификация	(++)	Зеленый
1.700 - 1.999	Возможная родовая идентификация	(+).	Желтый
0.000 - 1.699	Ненадежная идентификация	(-)	Красный

8. Дополнение базы данных программ

Поскольку коммерчески доступные базы данных, поставляемые с масс-спектрометрами на территорию России, не содержат спектров возбудителей особо опасных инфекций, необходимо создание референсных спектров (MSP) для микроорганизмов I - II групп патогенности и внесение их в базу данных. Для создания референтных спектров необходимо использовать исключительно белковые экстракты.

Чип с нанесенными на него образцами помещается в масс-спектрометр. После позиционирования чипа в ионизационной камере необходимо дождаться набора прибором значений вакуума не более атм. После достижения указанных значений необходимо провести калибровку с помощью нанесенного на лунку Н12 калибровочного стандарта. После этого можно приступать к сбору спектров в ручном или автоматическом режиме.

Сбор спектров проводят на масс-спектрометрах (прилож. 2). Для получения одиночного масс-спектра используют 40 импульсов лазера (частота 60 Гц), анализируемый диапазон масса/заряд составляет 2 000 - 20 000 Да.

Для штаммов, используемых для расширения референсной базы данных, сбор спектров проводят по следующей схеме: из каждой лунки (5 лунок на одну исследуемую единицу) с нанесенным образцом снимают по четыре исходных спектра, что в сумме составляет по 20 исходных спектров для каждого штамма. Из исходных спектров создают референсные и вносят их в базу данных программ (прилож. 2). После дополнения базы данных представляется возможным идентификация микроорганизмов в автоматическом режиме.

Библиография

1. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30 апреля 2003 г. N 85 "О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.1318-03 "Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционной заболеваемости человека I - IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами".

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо слов "санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.1318-03" следует читать "санитарно-эпидемиологических правил СП 1.2.1318-03"

2. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 15 апреля 2003 г. N 42 "О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)".

3. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28 января 2008 г. N 4 "Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

4. СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности", утверждены постановлением Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации от 28 августа 1995 г. N 14.

5. Приказ Роспотребнадзора от 8 мая 2008 года N 152 "О совершенствовании организации и проведения мероприятий по профилактике чумы".

6. МУК 4.2.2413-08 "Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы", утверждены Роспотребнадзором 29 июля 2008 г.

7. МУК 4.2.2939-11 "Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней", утверждены Роспотребнадзором 14 июля 2011 г.

8. МУК 4.2.2940-11 "Порядок организации и проведения лабораторной диагностики чумы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней", утверждены Роспотребнадзором 14 июля 2011 г.

9. МУК 4.2.2870-11 "Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней", утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 25 мая 2011 г.

10. МУК 4.2.3010-12 "Порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней", утверждены Роспотребнадзором 29 марта 2012 г.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова