Приложение Ж (справочное). Биолюминесцентный метод определения общей биологической чистоты поверхностей

Приложение Ж
(справочное)

Биолюминесцентный метод определения общей биологической чистоты поверхностей

Метод распространяется на материалы поверхностей и позволяет определить общую биологическую чистоту по количеству аденозин-5'-трифосфорной кислоты динатриевой соли (АТФ).

Ж.1 Аппаратура, материалы, реактивы

Люминометр.

Микрокюветы из полистирола.

Тампоны ватные, стерильные.

Пробирки стерильные объемом 1,5 мл (типа "эппендорф").

Дозатор автоматический постоянного объема 0,02 мл.

Дозатор автоматический постоянного объема 0,10 мл.

Реактив N 1 - АТФ-реагент.

Реактив N 2 - раствор для реконструкции АТФ-реагента.

Реактив N 3 - АТФ-контроль.

Реактив N 4 - раствор реагента для разрушения клеток.

Реактив N 5 - раствор для смачивания тампонов.

Ж.2 Подготовка к испытанию

Ж.2.1 Во флакон с реактивом N 1 вносят 4 мл раствора из флакона с реактивом N 2, выдерживают 30 мин перед использованием. Полученный раствор АТФ-реагента хранят при комнатной температуре в течение рабочего дня, а при 4°С - в течение двух-трех дней.

Ж.2.2 Во флакон с реактивом N 3 вносят 1 мл раствора из флакона с реактивом N 5, перемешивают. Раствор АТФ-контроля следует использовать в течение 2-3 ч.

Ж.2.3 Пробирки (типа "эппендорф") нумеруют по количеству анализируемых поверхностей, устанавливают в штатив, вносят в них по 0,2 мл реактива N 4 и добавляют одну пробирку для АТФ-контроля.

Ж.2.4 Производят калибровку АТФ-реагента по АТФ-контролю, для чего кончик тампона погружают в раствор с АТФ-контролем и выдерживают в течение 20 сек. Вынимают увлажненный тампон из раствора и помещают в пробирку с 0,2 мл раствора для разрушения бактериальных клеток. Извлекают тампон из пробирки, отжав излишек жидкости о стенку.

Ж.2.5 Помещают микрокювету с помощью пинцета в кюветное отделение люминометра.

С помощью автоматических дозаторов вносят в нее:

- 0,02 мл раствора АТФ-контроля;

- 0,10 мл раствора АТФ-реагента.

Быстро перемешивают содержимое микрокюветы, прокачав его 2-3 раза через наконечник дозатора, и измеряют биолюминесцентный сигнал на люминометре.

Ж.2.6 Повторяют измерения и находят среднее значение биолюминесцентного сигнала для АТФ-контроля ().

Ж.3 Проведение испытания

Ж.3.1 Для каждого образца поверхности используют новый стерильный ватный тампон. Погружают кончик тампона в реактив N 5 и выдерживают в течение 20 с.

Ж.3.2 Влажным тампоном тщательно протирают исследуемую поверхность, перемещая тампон сначала - по горизонтали, затем - по вертикали, и в конце - по диагонали. Площадь поверхности выбирают потребители.

Ж.3.3 Помещают тампон в пробирку с 0,2 мл раствора для разрушения бактериальных клеток, выдерживают в течение 1-2 мин, периодически вращая. Извлекают тампон из пробирки, отжав излишек жидкости о стенку, и закрывают пробирку.

Ж.3.4 Помещают микрокювету с помощью пинцета в кюветное отделение люминометра. С помощью автоматических дозаторов вносят в нее:

- 0,02 мл раствора АТФ-контроля;

- 0,10 мл раствора АТФ-реагента.

Быстро перемешивают содержимое микрокюветы, прокачав его два-три раза через наконечник дозатора, и измеряют биолюминесцентный сигнал на люминометре.

Ж.3.5 Повторяют операции с использованием второй микрокюветы. Находят среднее значение биолюминесцентного сигнала для исследуемого образца ().

Ж.3.6 Рассчитывают концентрацию АТФ в исследуемом растворе по формуле:

, пикомол/мл

Ж.3.7 Оценивают степень загрязненности поверхности по таблице:

Концентрация АТФ, пикомоль/мл	Степень загрязненности образца
<0,01	Чисто
0,01-0,02	Недостаточно чисто
0,02-0,1	Грязно
	Очень грязно

Длительность испытания - 5-7 мин на один образец поверхности.

При выполнении каждой операции следует использовать новый стерильный наконечник для автоматических дозаторов.