Приложение Е (справочное). Стадия дополнительной очистки экстракта при определении витамина D с использованием препаративной тонкослойной хроматографии, колоночной хроматографии и твердофазной экстракции

Приложение Е
(справочное)

Стадия дополнительной очистки экстракта при определении витамина D с использованием препаративной тонкослойной хроматографии, колоночной хроматографии и твердофазной экстракции

Е.1 Стадия дополнительной очистки экстракта при определении витамина D с использованием препаративной тонкослойной хроматографии

Е.1.1 Общие сведения

Схематически представленная процедура для тонкослойной хроматографии (далее - ТСХ) широко использовалась для очистки экстрактов витамина D до введения препаративной ВЭЖХ. Она была валидирована для кормов, таких как корм для поросят с содержанием 50 мкг/кг витамина D.

Ее преимущества:

- зона, содержащая витамин D, может быть может быть легко визуализирована ультрафиолетовым излучением. В зависимости от матрицы пробы ширина зоны, содержащей витамины , снимаемой с пластины может быть различной по выбору аналитика. Тем самым влияние матрицы может быть минимизировано;

- при использовании многократного проявления пластин для ТСХ отделение зоны от зоны матричных компонентов может быть улучшено.

Недостатком этого способа является то, что он не может быть автоматизирован. Дополнительная информация дана в [11].

Е.1.2 Сущность процедуры

Аликвоту экстракта, полученного после омыления очищают с помощью препаративной ТСХ. Зону, содержащую витамины , соскребают с пластины, переносят в небольшую колонку и экстрагируют витамины . Объем этого экстракта уменьшают упариванием перед применением аналитической ВЭЖХ.

Е.1.3 Реактивы

Е.1.3.1 Пластины для ТСХ, например Silica gel 60 F 254, Merck 5715*, 0,25 мм, 20 x 20 см.

Е.1.3.2 Бутилгидрокситолуол (ВНТ).

Е.1.3.3 н-Гексан.

Е.1.3.4 Метанол.

Е.1.3.5 Ацетон.

Е.1.3.6 Диэтиловый эфир.

Е.1.3.7 Растворитель для проявления ТСХ-пластин: смесь 88  н-гексана, 2  метанола, 10 ацетона и 10 мг ВНТ.

Е.1.3.8 Растворитель для элюирования выделенной зоны витаминов : смесь 60  диэтилового эфира и 40  н-гексана.

Е.1.3.9 Стандартный раствор витамина , 250  в метаноле.

Е.1.4 Аппаратура

Е.1.4.1 Камера для ТСХ для пластин размером 20 х 20 см.

Е.1.4.2 Шприц вместимостью 1  стеклянный или подходящее устройство для нанесения пятен для ТСХ.

Е.1.4.3 Ультрафиолетовая лампа, 254 нм.

Е.1.4.4 Открытая цилиндрическая стеклянная колонка, диаметром 1 см, длиной приблизительно 15 см с краном из политетрафторэтилена.

Е.1.4.5 Небольшой шпатель с острыми краями.

Е.1.5 Порядок работы

Проявительную камеру для ТСХ заполняют растворителем (Е.1.3.7) и оставляют на 2 ч для насыщения.

Упаривают досуха при пониженном давлении подходящую аликвоту экстракта, полученного после омыления, и немедленно растворяют остаток в 2  н-гексана. 1  этого раствора наносят на пластину для ТСХ (Е.1.3.1) в виде большого числа порций таким образом, чтобы образовалась зона длиной 10 см и шириной не более 1 см. Для локализации и идентификации зоны, содержащей аналит, наносят от 5 до 10 мкл стандартного раствора витамина (Е.1.3.9) по обеим сторонам зоны.

Пластину проявляют два раза почти до самого верха. Для улучшения разделения может быть полезно многократное проявление пластины. Перед началом нового разделения пластину высушивают в токе азота. Визуализируют зону витаминов в ультрафиолетовом свете (Е.1.4.3) и отмечают ее карандашом (от 0,5 до 1,5 см). Соскабливают эту зону при помощи шпателя (Е.1.4.5) на лист бумаги и переносят в открытую цилиндрическую колонку (Е.1.4.4), предварительно заполненную 10  растворителя (Е.1.3.8). Элюируют витамин пятью порциями по 10  растворителя (Е.1.3.8). Упаривают объединенные элюаты досуха при пониженном давлении и немедленно растворяют в 1  растворителя для ВЭЖХ (раствор пробы).

Е.2 Стадия дополнительной очистки с использованием колоночной хроматографии

Е.2.1 Сущность процедуры

Очистка проводится на колонке, заполненной целитом с нанесенным на него полиэтиленгликолем в качестве стационарной фазы. Недостатком этого способа является то, что он не может быть автоматизирован.

Е.2.2 Реактивы

Е.2.2.1 Петролейный эфир, кипящий в диапазоне от 40°С до 60°С, перегнанный.

Е.2.2.2 Петролейный эфир, кипящий в диапазоне от 60°С до 70°С, перегнанный.

Е.2.2.3 Диатомитовая земля, щелочная кальцинированная (CAS 68855-54-9).

Е.2.2.4 Сульфат натрия.

Е.2.2.5 Полиэтиленгликоль 600.

Е.2.3 Аппаратура

Е.2.3.1 Ротационный испаритель, с водяной баней при 40°С.

Е.2.3.2 Взрывобезопасный высокоскоростной блендер.

Е.2.3.3 Хроматографические колонки, длиной 30 см, внутреннего диаметра 2,5 см, снабженные внизу краном с вставкой из полифторэтилена и длиной 10 см, внутреннего диаметра 1,4 см, сужающаяся книзу и имеющая наверху резервуар вместимостью 100 .

Е.2.3.4 Ультрафиолетовая лампа, 254 нм.

Е.2.4 Порядок работы

Е.2.4.1 Подготовка колонки

В блендере создают суспензию 25 г диатомитовой земли (Е.2.2.3) и 200  петролейного эфира (Е.2.2.2). Во время перемешивания быстро добавляют 15  полиэтиленгликоля (Е.2.2.5) и продолжают перемешивание в течение 20 с.

Суспензия может быть создана альтернативным способом, обеспечивающим распределение полиэтиленгликоля на поверхности носителя. В хроматографическую колонку (Е.2.3.3) вносят небольшую порцию петролейного эфира (Е.2.2.2), помешают на дно пробку из стекловаты, из которой удален воздух, и покрывают его слоем толщиной 1 см сульфата натрия. Переносят суспензию в колонку и уплотняют содержимое колонки при помощи поршня до получения слоя высотой 15 см. При этом из колонки вытекает избыток петролейного эфира. Сверху помещают слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см.

Е.2.4.2 Ввод раствора пробы, элюирование и сбор элюата

Экстракт** переносят из круглодонной колбы и ополаскивают колбу тремя порциями приблизительно по 3  петролейного эфира (Е.2.2.2), которые также переносят на колонку. Элюируют петролейным эфиром (Е.2.2.2). Отбрасывают первые 30  элюата. Собирают последующие 50  элюата или же до того момента, пока зона ретинола не достигнет нижней границы слоя сорбента. Это можно увидеть при помощи длинноволновой ультрафиолетовой лампы (Е.2.3.4). Элюат упаривают досуха в ротационном испарителе (Е.2.3.1) и добавляют от 2 до 3  петролейного эфира (Е.2.2.1 или Е.2.2.2). Затем продолжают очистку методом твердофазной экстракции (см. Е.3).

Е.3 Стадия дополнительной очистки с использованием твердофазной экстракции

Е.3.1 Сущность процедуры

Этот раздел описывает способ очистки с использованием твердофазной экстракции на силикагеле. Недостатком этого способа является то, что он не может быть автоматизирован.

Е.3.2 Реактивы

Е.3.2.1 н-Гептан, х.ч.

Е.3.2.2 Диэтиловый эфир. Перекиси удаляют каждый день перед использованием путем перегонки над твердым гидроксидом калия.

Е.3.2.3 Петролейный эфир, кипящий в диапазоне от 40°С до 60°С, перегнанный.

Е.3.3 Аппаратура

Е.3.3.1 Картриджи для твердофазной экстракции, содержащие приблизительно 700 мг силикагеля.

Е.З.3.2 Конические колбы вместимостью 50  с нормальным шлифом 29.

Е.3.4 Порядок работы

Упаривают элюат (см. Е.2.4.2) и растворяют остаток в 10  н-гептана (Е.3.2.1). Активируют картридж, пропуская через него 10  н-гептана. Вводят полученный раствор в картридж и дают ему пройти через него. Промывают картридж 10  6%-ного раствора диэтилового эфира (Е.3.2.2) в н-гептане и элюируют 20  20%-ного раствора диэтилового эфира (Е.3.2.2) в н-гептане. Собирают элюат в коническую колбу (Е.3.3.2), упаривают и растворяют в 1 - 2  петролейного эфира (Е.3.2.3). Продолжают очистку методом ТСХ или полупрепаративной ВЭЖХ.