9 Проведение испытания (см. приложение А)

9 Проведение испытания (см. приложение А)

9.1 Проба для испытания и исходная суспензия

Для приготовления исходной суспензии используют первую среду для обогащения (ASPW), указанную в 5.1.

Берут пробу для испытания (х г, или х ) в соответствии с требованиями, указанными на конкретный продукт, и гомогенизируют ее в 9х (или 9х г) среды для обогащения.

В случае больших количеств высеваемого продукта перед внесением навески ASPW должна быть нагрета до 37°С.

Если разведение продукта и инкубирование посевов не могут быть проведены в тот же день, исходную суспензию хранят до следующего дня при температуре (53)°С.

Для уменьшения объема проводимой работы пробы могут быть объединены в случае, когда более чем одна проба (25 г) испытывается от той же партии анализируемого пищевого продукта и когда есть уверенность в том, что смесь (собранные вместе порции пробы) не изменят конечные результаты, связанные с этим продуктом.

Пример - Если анализируют 10 проб для испытаний массой 25 г, возможно их объединение для того, чтобы получить в сумме объединенную пробу массой 250 г и добавить к ней 2,25 среды для обогащения.

Количество клеток Vibrio parahaemolyticus и Vibrio cholerae значительно снижается за счет хранения при низких температурах. Хранение проб и в меньшей степени суспензий при таких температурах должно быть устранено или сведено к минимуму.

9.2 Первичное селективное обогащение

Инкубируют исходную суспензию (9.1) при 37°С в течение (61) ч для глубоко замороженных, сушеных или соленых продуктов или при 41,5°С в течение (61 ч) для свежих продуктов.

Необходимо особое внимание к применению метода для продуктов с высоким содержанием соли, так как конечная концентрация соли в среде может изменять ее качественные характеристики (см. ISO 6887-4).

9.3 Вторичное селективное обогащение

9.3.1 Переносят 1  культуры, полученной по 9.2, взятой с поверхности, в пробирку, содержащую 10  ASPW (5.1).

9.3.2 Посевы по 9.3.1 инкубируют при 41,5°С в течение (181) ч.

9.4 Выявление и идентификация

9.4.1 Культурами, выросшими на среде ASPW (9.2 и 9.3.2), засевают петлей поверхность чашек с TCBS агаром (5.2.1) так, чтобы обеспечить рост хорошо изолированных колоний.

Аналогично поступают со второй селективной средой (5.2), используя новую петлю (после фламбирования).

9.4.2 Переворачивают чашки Петри с посевами. Чашки с посевами на TCBS агар (9.4.1) помещают в термостат (6.1), установленный на 37°С. Посевы на вторую селективную среду инкубируют, следуя инструкции изготовителя.

9.4.3 После инкубирования посевов (9.4.1 и 9.4.2) в течение (243) ч их просматривают на наличие типичных колоний предположительно патогенных Vibrio spp., отмечают их расположение на дне чашки Петри.

Существуют две основные морфологические характеристики для колоний Vibrio spp. на TCBS агар:

- типичные колонии V. parahaemolyticus гладкие зеленые (сахарозоотрицательные), от 2 до 3 мм в диаметре;

- типичные колонии V. cholerae гладкие, желтые (сахарозоположительные), от 2 до 3 мм в диаметре.

Вторую селективную среду инкубируют при соответствующей температуре в течение соответствующего периода времени, затем проверяют на наличие колоний, которые в соответствии с их характеристиками могут быть отнесены к возможно выделенным V. parahaemolyticus и V. Cholera.

9.5 Подтверждение

9.5.1 Для идентификации Vibrio до вида могут быть использованы разнообразные коммерчески доступные наборы для биохимической идентификации, обеспеченные базой данных или идентификационными таблицами. Наборы инокулируются суспензией определяемых бактерий. Суспензии для инокуляции готовятся в физиологическом растворе или жидкости для разбавления. Наборы для биохимической идентификации основаны на реакциях, полученных при использовании сред, аналогичным тем, которые описаны в настоящем стандарте. Данные наборы следует использовать в соответствии с требованиями инструкций изготовителей.

Примечание - Распознавание колоний Vibrio в значительной степени вопрос опыта, их внешний вид может иногда различаться в зависимости не только от вида, а также от партии питательной среды.

9.5.2 Отбор колоний для подтверждения и приготовления чистых культур

Для подтверждения пересевают с каждой селективной среды (см. 9.4) по меньшей мере пять колоний, которые считаются типичными для каждого потенциально патогенного вида Vibrio spp. (V. parahaemolyticus, V. cholerae). Если на чашке менее пяти типичных колоний, то пересевают все эти колонии.

Примечание - Пищевые продукты, особенно морепродукты, могут содержать большое число бактерий, включая непатогенные Vibrio spp., которые могут расти в процессе культивирования на селективных средах. Пересев малого количества колоний может привести к потере потенциально патогенных видов.

Пересевают отобранные колонии на поверхность чашек с солевым питательным агаром или поверхность скошенного солевого питательного агара (5.3) для получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при температуре 37°С в течение (243) ч.

Для биохимического подтверждения используют чистые культуры.

9.5.3 Тесты для идентификации

9.5.3.1 Тест на оксидазу

Используя петлю из платиново-иридиевого провода или стеклянный стержень, отбирают часть чистой культуры с солевого питательного агара (9.5.2) и проводят по поверхности фильтровальной бумаги, увлажненной реактивом на оксидазу (5.4), или используют коммерческие диски или растворы, следуя инструкциям изготовителя. Не допускается использовать никель-хромовую петлю для отбора или металлическую проволоку. Тест считается положительным, если цвет меняется на розовато-лиловый, фиолетовый или насыщенный фиолетовый в течение 10 с.

9.5.3.2 Микроскопирование

Каждую чистую культуру, полученную по 9.4.2, тестируют в соответствии с а) и b) как указано далее.

a) Готовят мазок для окраски по Граму. После окраски, используя микроскоп, проверяют морфологию и отношение к окраске по Граму.

b) Инокулируют пробирку с щелочной солевой пептонной водой (ASPW) (5.1). Посев инкубируют при 37°С от 1 ч до 6 ч. Наносят каплю культуры на чистую поверхность предметного стекла, накрывают покровным стеклом и проверяют подвижность культуры под микроскопом. Отбирают культуры, которые показали положительный результат на подвижность.

9.5.3.3 Отбор культур для биохимических тестов

Отбирают для биохимического подтверждения оксидазоположительные, грамотрицательные культуры, которые показывают положительный результат в тесте на подвижность.

9.5.4 Биохимическое подтверждение

9.5.4.1 Используя петлю для посевов, инокулируют среды, указанные в 9.5.4.2 - 9.5.4.8 каждой культурой, полученной из колоний, отобранных по 9.5.3.3.

9.5.4.2 Тест с солевым TSI агаром (5.5)

Инокулируют укалыванием основание столбика агара и проводят вдоль по скошенной поверхности. Посевы инкубируют при 37°С в течение (243) ч. 

Результаты интерпретируют следующим образом:

a) Столбик плотной среды:

- желтый: глюкозоположительный (ферментация глюкозы);

- красный или неизменившийся: глюкозоотрицательный (нет ферментации глюкозы);

- черный: образование сероводорода;

- пузыри или трещины: образование газа из глюкозы.

b) Скошенная поверхность плотной среды

- желтый: лактозо и/или сахарозоположительный (ферментация лактозы и/или сахарозы);

- красный или неизменившийся: лактозо и сахарозоотрицательный (нет ферментации лактозы или сахарозы).

Типичные реакции для Vibrio parahaemolyticus соответствуют щелочной поверхности (красный цвет среды) и кислотному основанию (желтый цвет среды), без образования сероводорода или газа.

Типичные реакции для Vibrio cholerae соответствуют кислотной поверхности (желтый цвет среды) и кислому основанию (желтый цвет среды) без образования сероводорода или газа.

Инкубирование не должно превышать 24 ч, так как желтая поверхность V. cholerae может через 24 ч преобразоваться в красную.

9.5.4.3 Определение орнитин декарбоксилазы

Инокулируют жидкую солевую среду (5.6) чуть ниже поверхности. Добавляют около 1  стерильного минерального масла на поверхность среды. Посевы инкубируют при 37°С в течение (243) ч.

Помутнение и фиолетовый цвет среды после термостатирования указывают на положительную реакцию (бактериальный рост и декарбоксилирование орнитина). Желтый цвет показывает отрицательную реакцию.

9.5.4.4 Определение L-лизин декарбоксилазы

Инокулируют жидкую солевую среду (5.7) чуть ниже поверхности. Добавляют около 1  стерильного минерального масла на поверхность среды. Посевы инкубируют при 37°С в течение (243) ч.

Помутнение и фиолетовый цвет после инкубирования указывают на положительную реакцию (бактериальный рост и декарбоксилирование лизина). Желтый цвет указывает на отрицательную реакцию.

9.5.4.5 Определение аргинин дигидролазы

Инокулируют жидкую солевую среду (5.8) чуть ниже поверхности. Добавляют около 1  стерильного минерального масла на поверхность среды. Посевы инкубируют при 37°С в течение (243) ч.

Помутнение и фиолетовый цвет после инкубирования указывают на положительную реакцию (бактериальный рост и дигидрирование аргинина). Желтый цвет указывает на отрицательную реакцию.

9.5.4.6 Определение -галактозидазы

Инокулируют подозрительную колонию в пробирку, содержащую 0,25  солевого раствора (5.12). Добавляют одну каплю толуола и встряхивают пробирку.

Помещают пробирку в водяную баню (6.4), установленную на 37°С и оставляют ее приблизительно на 5 мин.

Добавляют 0,25  реактива для определения -галактозидазы (5.9) и перемешивают, после чего пробирку возвращают в водяную баню, установленную на 37°С, оставляют ее на (243) ч, проверяя время от времени.

Желтый цвет указывает на положительную реакцию (присутствие -галактозидазы). Часто реакция видна через 20 мин. Отсутствие окрашивания через 24 ч указывает на отрицательную реакцию.

Если используются диски, готовые к применению, то следуют инструкциям изготовителя.

9.5.4.7 Определение индола

Подозрительную колонию засевают в пробирку с 5  триптон-триптофановой солевой среды (5.10). Посевы инкубируют при 37°С в течение (243) ч. После инкубирования добавляют 1  реактива Ковача.

Образование красного кольца указывает на положительную реакцию (образование индола). Желто-коричневое кольцо указывает на отрицательную реакцию.

9.5.4.8 Тест на солеустойчивость

Готовят серию сред с пептонной водой (5.11) с возрастающей концентрацией соли (NaCI): 0, 2, 4, 6, 8 и 10%.

Готовят суспензию из колоний, которые будут тестироваться, и засевают каждую из пробирок (с помощью петли). Посевы инкубируют при 37°С в течение (243) ч.

Появление помутнения указывает на то, что подозреваемая колония может расти при концентрации хлорида натрия, в соответствующей пробирке с солевой пептонной водой.

9.5.4.9 Интерпретация биохимических тестов

Виды V. parahaemolyticus, V. cholerae в основном дают реакции, представленные в таблице 1.

Таблица 1 - Интерпретация биохимических тестов

Тесты (среды, содержащие 1% NaCI)	V. cholerae(a)	V. parahaemolyticus(a)
Оксидаза	+	+
Выделение газа (глюкоза)	-	-
Лактоза	-	-
Сахароза	+	-
ODC	+	+
LDC	+	+
ADH	-	-
ONPG гидролиз	+	-
Образование индола	+	+
Рост в пептонной воде с: 0% NaCI 2% NaCI 6% NaCI 8% NaCI 10% NaCI	+ + - - -	- + + + -
(a) Знак "+" означает от 76% до 89% положительных реакций.

Примечание - Реакции, приведенные в Таблице 1, - руководство к идентификации перечисленных видов. Требуются дополнительные фенотипические тесты для полного различения этих видов друг от друга, от других непатогенных видов Vibrio и от других ферментативных грамотрицательных организмов, таких как Aeromonas spp. Vibrio mimicus, патогенных видов, указанных в ISO/TS 21872-2, так как показывают идентичные реакции с V. cholerae в этой серии тестов. Кроме того, что они являются сахарозоотрицательными.

9.5.4.10 Пошаговое подтверждение (по желанию)

С культурами, отобранными в 9.5.3.3, проводят тесты на рост в 10%-ной солевой пептонной воде (5.11) и аргинин дегидролазу (5.8). Другие подтверждающие тесты проводят со всеми колониями, которые не показали рост в 10%-ной солевой пептонной воде и которые дают отрицательную реакцию на аргинин дегидролазу.

Примечание - Желательно в то же время делать пересев либо в 2%-ную солевую пептонную воду, либо на солевой питательный агар, для того, чтобы быть уверенным, что "отсутствие роста" в 10%-ной солевой пептонной воде не вызвано гибелью культуры.

9.5.5 Подтверждение биохимической идентификации и определение факторов патогенности

Биохимическая идентификация Vibrio трудна, желательно получить подтверждение выявления V. parahaemolyticus, V. cholerae в специализированной лаборатории. В этом случае для транспортирования колонии пересевают на поверхность скошенного солевого питательного агара (5.3).

Не все виды V. parahaemolyticus и V. cholerae являются патогенными. Для того, чтобы подтвердить патогенный характер видов, предпочтительнее проводить серологические тесты для V. cholerae (по крайней мере, чтобы определить, являются ли они серогруппами О1 или О139) и обнаружить присутствие токсинообразования или токсигенных генов для V. cholerae и термостабильно направленного гемолизина (TDH) или TDH-родственных гемолизиновых генов для V. parahaemolyticus. Эти тесты следует проводить в специализированной лаборатории. Следует отметить, что соотношение патогенных видов в окружающей среде и образцах пищевых продуктов обычно невелико (для V. parahaemolyticus они обычно присутствуют приблизительно в 1% от общего содержания V. parahaemolyticus в образце) и, таким образом, вероятность обнаружения патогенных видов с помощью пересева небольшого количества колоний для идентификации и подтверждения очень низка.