Приложение В (обязательное). Состав и приготовление питательных сред и реактивов

Приложение В
(обязательное)

Состав
и приготовление питательных сред и реактивов

B.1 Щелочная солевая пептонная вода (ASPW)

B.1.1 Состав:

пептон - 20,0 г;

натрия хлорид - 20,0 г;

вода - 1000 

B.1.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде, нагревая при необходимости. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 8,6 0,2 при 25°С.

Разливают среду в пробирки или колбы подходящего объема, чтобы получить порции, в количествах, требуемых для анализа (см. 9.1; 9.3.1). Стерилизуют в автоклаве 15 мин при 121°С.

B.2 Тиосульфат, цитратный, желчный, сахарозный (TCBS) агар

B.2.1 Состав:

пептон - 10,0 г;

дрожжевой экстракт - 5,0 г;

цитрат натрия - 10,0 г;

тиосульфат натрия - 10,0 г;

цитрат железа (iii) - 1,0 г;

хлорид натрия - 10,0 г;

сухая бычья желчь - 8,0 г;

сахароза - 20,0 г;

бромтимоловый голубой - 0,04 г;

тимоловый голубой - 0,04 г;

агар - 8,0 - 18,0 г*;

вода - 1000 .

B.2.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу в воде доведением до кипения. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы он составлял 8,60,2 при 25°С. Среду не автоклавируют.

B.2.3 Приготовление чашек с агаром

Разливают в чашки Петри по 15 - 20  свежеприготовленной среды, охлажденной приблизительно до 50°С, и оставляют для застывания.

Непосредственно перед использованием тщательно подсушивают поверхность агаровой среды в чашках Петри (предпочтительнее после снятия крышек и переворачивания чашек).

B.2.4 Контроль среды

Для количественной оценки эффективности роста для каждой партии TCBS агара используют солевой питательный агар (SNA) как сравнительную среду и следующие штаммы:

- V. parahaemolyticus: NCTC 10885;

- V. furnissii: NCTC 11218;

- Escherichia coli: ATCC 25922, 8739 или 11775.

Эффективность роста рассчитывают по формуле

,

где N - количество выросших колоний.

Эффективность роста должна составлять как минимум 50% для каждых видов Vibrio (организмы положительного контроля) и менее 1% для Е. coli (организмы отрицательного контроля). Колонии V. parahaemolyticus: NCTC 10885 должны быть зелеными (сахарозоотрицательными), а колонии V. furnissii: NCTC 11218 должны быть желтыми (сахарозоположительными).

B.3 Солевой питательный агар (SNA)

B.3.1 Состав:

мясной экстракт - 5,0 г;

пептон - 3,0 г;

натрия хлорид - 10,0 г;

агар - 8,0-18,0 г*;

вода - 1000 .

B.3.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде, нагревая, при необходимости. Регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 7,20,2 при 25°С.

Разливают среду в емкости подходящей вместимости. Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве при 121°С.

B.3.3 Приготовление чашек с солевым питательным агаром

Разливают в стерильные чашки Петри по 15 - 20  среды, охлажденной приблизительно до 50°С. Оставляют для застывания.

Непосредственно перед применением тщательно подсушивают поверхность агара в чашках Петри (предпочтительнее после снятия крышек и переворачивания чашек).

B.3.4 Приготовление пробирок со скошенным агаром

Разливают примерно по 10  среды, охлажденной приблизительно до 50°С, в пробирки подходящей вместимости. Оставляют до застывания в наклонном положении.

B.4 Реактив для определения оксидазы

B.4.1 Состав:

N, N, N', N'-Тетраметил-пара-фенилендиамин дигидрохлорид - 1,0 г

Вода - 100 .

B.4.2 Приготовление

Растворяют компоненты в холодной воде непосредственно перед использованием.

B.5 Солевой трехсахарный железистый агар (TSI)

B.5.1 Состав:

пептон - 20,0 г;

мясной экстракт - 3,0 г;

дрожжевой экстракт - 3,0 г;

натрия хлорид - 10,0 г;

лактоза - 10,0 г;

сахароза - 10,0 г;

глюкоза - 1,0 г;

железо (Hi) цитрат, 0,3 г;

феноловый красный - 0,024 г;

агар - 8,0 - 18,0 г*;

вода - 1000 .

B.5.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде, нагревая при необходимости. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он был 7,4 0,2 при 25°С.

Разливают среду по 10  в пробирки подходящей вместимости. Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве при 121°С.

Оставляют для застывания в наклонном положении так, чтобы получить столбик высотой 2,5 см.

Если среда используется более чем через восемь дней после приготовления, ее регенерируют расплавлением в водяной бане при кипении или текучим паром в течение 10 мин. Оставляют для застывания, как указано выше.

B.6 Солевая среда для определения орнитин декарбоксилазы (ODC)

В.6.1 Состав:

L-Орнитин моногидрохлорид - 5,0 г;

дрожжевой экстракт - 3,0 г;

глюкоза - 1,0 г;

бромкрезоловый пурпурный - 0,015 г;

натрия хлорид - 10,0 г;

вода - 1000 .

В.6.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде, нагревая при необходимости. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы он составлял 6,80,2 при 25°С.

Разливают среду по 2 - 5  в узкие пробирки. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при 121°С.

B.7 Солевая среда для определения лизин декарбоксилазы (LDC)

B.7.1 Состав:

L-Лизин моногидрохлорид - 5,0 г;

дрожжевой экстракт - 3,0 г;

глюкоза - 1,0 г;

бромкрезоловый пурпурный - 0,015 г;

хлорид натрия - 10,0 г;

вода - 1000 .

B.7.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде, нагревая при необходимости. Если необходимо, регулируют рН, так, чтобы он составлял 6,80,2 при 25°С.

Разливают среду по 2 - 5  в узкие пробирки. Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве при 121°С.

B.8 Солевая среда для определения аргинин дегидроксилазы (ADH)

B.8.1 Состав:

аргинин моногидрохлорид - 5,0 г;

дрожжевой экстракт - 3,0 г;

глюкоза - 1,0 г;

бромкрезоловый пурпурный - 0,015 г;

натрия хлорид - 10,0 г;

вода - 1 000 .

B.8.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде, нагревая при необходимости. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы он составлял 6,8 0,2 при 25°С.

Разливают среду по 2 - 5  в узкие пробирки. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при 121°С.

B.9 Реактивы для определения -галактозидазы

В.9.1 OPNG раствор

B.9.1.1 Состав:

2-орто-нитрофенил--D-галактопиранозид (OPNG) - 0,08 г;

вода - 15 .

B.9.1.2 Приготовление

Растворяют OPNG в воде приблизительно при 50°С. Охлаждают раствор.

В.9.2. Буферный раствор

B.9.2.1 Состав:

натрия дигидрофосфат - 6,9 г;

натрия гидроксид (NaOH) (0,1 раствор) - приблизительно 3 ;

вода до конечного объема - 50 .

B.9.2.2 Приготовление

Растворяют дигидрофосфат натрия в мерной колбе приблизительно в 45  воды.

Регулируют рН так, чтобы он составлял 7,00,2 при 25°С с помощью раствора гидроксида натрия. Доводят объем водой до 50 .

B.9.3 Готовый реактив

B.9.3.1 Состав:

буферный раствор (В.9.2) - 5 ;

OPNG раствор (В.9.1) - 15 .

B.9.3.2 Приготовление

Добавляют буферный раствор к раствору OPNG. Хранят при температуре от 0°С до 5°С.

B.10 Солевая среда для определения индола

В.10.1 Триптофановая солевая среда

B.10.1.1 Состав:

энзиматически переваренный казеин - 10,0 г;

DL-Триптофан - 1,0 г;

натрия хлорид - 10,0 г;

вода - 1000 .

8.10.1.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде, нагревая при необходимости, и фильтруют. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 7,00,2 при 25°С.

Разливают среду по 5  в пробирки подходящей вместимости. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при 121°С.

В.10.2 Реактив Ковача

B.10.2.1 Состав:

4-диметиламинобензальдегид - 5,0 г;

соляная кислота, плотностью от 1,18 до 1,19 - 25 ;

2-метилбутан-2-ол - 75 .

B.10.2.2 Приготовление

Смешивают компоненты.

B.11 Солевые пептонные воды

B.11.1 Состав:

пептон - 10,0 г;

натрия хлорид - 0, 20, 60, 80 или 100 г;

вода - 1000 .

B.11.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде, нагревая при необходимости. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 7,50,2 при 25°С.

Разливают среду по пробиркам подходящей вместимости. Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве при 121°С.

B.12 Раствор хлорида натрия

B.12.1 Состав:

натрия хлорид - 10,0 г;

вода - 1000 .

B.12.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде, нагревая при необходимости. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 7,50,2 при 25°С.

Разливают раствор по пробиркам подходящей вместимости. Стерилизуют 15 минут в автоклаве при 121°С.