Приложение В (обязательное). Состав и приготовление питательных сред и реактивов

Приложение В
(обязательное)

Состав
и приготовление питательных сред и реактивов

В.1 Щелочная солевая пептонная вода (ASPW)

В.1.1 Состав:

пептон - 20,0 г;

натрия хлорид - 20,0 г;

вода - 1 000

В.1.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде, нагревая при необходимости. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он был 8,60,2 при 25°С.

Разливают среду в пробирки или колбы подходящего объема, чтобы получить порции, в количествах, требуемых для анализа (см. 9.1 и 9.3.1). Стерилизуют в автоклаве 15 мин при 121°С.

В.2 Тиосульфат-цитратный желчный и сахарозный (TCBS) агар

В.2.1 Состав:

пептон - 10,0 г;

дрожжевой экстракт - 5,0 г;

цитрат натрия - 10,0 г;

тиосульфат натрия - 10,0 г;

цитрат железа (iii) - 1,0 г;

натрия хлорид - 10,0 г;

сухая бычья желчь - 8,0 г;

сахароза - 20,0 г;

бромтимоловый голубой - 0,04 г;

тимоловый голубой - 0,04 г;

агар - 8,0 - 18,0 г*

вода - 1000 .

В.2.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу в воде доведением до кипения.

Если необходимо, регулируют рН так, чтобы он составлял 8,60,2 при 25°С. Не автоклавируют.

В.2.3 Приготовление чашек с агаром

Разливают в чашки Петри по 15 - 20  свежеприготовленной среды, охлажденной приблизительно до 50°С и оставляют для застывания.

Непосредственно перед использованием тщательно подсушивают поверхность агара (предпочтительнее после снятия крышек и переворачивания чашек).

В.2.4 Контроль среды

Для руководства см. [1], [2].

Для количественной оценки эффективности роста для каждой партии TCBS агара, используют солевой питательный агар (SNA) как сравнительную среду и следующие штаммы:

- V. parahaemolyticus: NCTC 10885;

- V. furnissii: NCTC 11218;

- Escherichia coli: ATCC 25922, 8739 или 11775.

Эффективность роста рассчитывают по формуле

,

где N - количество выросших колоний.

Эффективность роста должна составлять по меньшей мере 50% для любых видов Vibrio (организмы положительного контроля) и менее 1% для Е. coli (организмы отрицательного контроля). Колонии V. parahaemolyticus: NCTC 10885 должны быть зелеными (сахарозоотрицательными), а колонии V. furnissii: NCTC 11218 должны быть желтыми (сахарозоположительными).

В.3 Натрий додецил сульфат полимиксин сахарозный (SDS) агар

В.3.1 Основа среды

В.3.1.1 Состав:

протеозопептон - 10,0 г;

мясной экстракт - 5,0 г;

сахароза - 15,0 г;

натрия хлорид - 20,0 г;

натрий додецил сульфат - 1,0 г;

бромтимоловый голубой - 0,04 г;

крезоловый красный - 0,04 г;

агар - 15,00 г;

дистиллированная вода - 1000 

В.3.1.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде. Устанавливают рН 7,60,2 при 25°С. Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин.

В.3.2 Раствор полимиксина В

В.3.2.1 Состав:

Полимиксин В сульфат - 100000 единиц;

Вода - 5 .

В.3.2.2 Приготовление

Растворяют компонент в воде. Стерилизуют фильтрацией.

В.3.3 Приготовление готовой среды)

Охлаждают основу среды приблизительно до 50°С и прибавляют 5  стерильного раствора полимиксина В, перемешивают.

В.3.4 Приготовление чашек Петри с агаром

Разливают в чашки Петри по 15 - 20  агара. Выдерживают чашки до тех пор, пока поверхность агара не станет сухой.

В.3.5 Контроль среды

Для руководства см. [1], [2].

Для количественной оценки эффективности роста для каждой партии TCBS агара используют солевой питательный агар (SNA) как сравнительную среду и следующие штаммы:

- V. vulnificus: NCTC 11067 (АТСС 29307);

- V. cholerae: NCTC 8042 (АТСС 14733);

- Escherichia coli: АТСС 25922, 8739 или 11775.

Эффективность роста рассчитывают по формуле

,

где N - количество выросших колоний.

Эффективность роста должна составлять по меньшей мере 50% для любых видов Vibrio и менее 1% для Е. coli. Колонии V. vulnificus: NCTC 11067 должны быть пурпуро-зелеными с непрозрачными зонами, а V. cholerae: NCTC 8042 - желтыми с непрозрачными зонами.

В.4 Целлобиозо-полимиксин-колистин (СРС) агар

В.4.1 Раствор 1

В.4.1.1 Состав

бактериологический пептон - 10,0 г;

мясной экстракт - 5,0 г;

цитрат железа - 0,1 г;

натрия хлорид - 20,0 г;

бромтимоловый голубой - 0,04 г;

крезоловый красный - 0,04 г;

агар - 15,0 г;

дистиллированная вода - 900 .

В.4.1.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде. Устанавливают рН 7,60,2.

Автоклавируют при 121°С в течение 15 мин. Охлаждают приблизительно до 50°С.

В.4.2 Раствор 2

В.4.2.1 Состав:

целлобиоза -15,0 г;

колистин - 1360000 единиц;

полимиксин В - 100000 единиц;

дистиллированная вода - 100 .

В.4.2.2 Приготовление

Растворяют целлобиозу в дистиллированной воде при нагревании. Охлаждают и прибавляют антибиотики, стерилизуют фильтрацией.

В.4.3 Готовая среда

Прибавляют раствор 2 (100 ) к раствору 1 (900 ) и перемешивают.

В.4.4 Приготовление чашек с агаром.

Вносят в чашку Петри 15 - 20  среды. Подсушивают поверхность агара перед использованием.

В.4.5 Контроль среды

Для руководства см. [1], [2].

Для количественной оценки эффективности роста для каждой партии TCBS агара используют солевой питательный агар (SNA) как сравнительную среду и следующие штаммы:

- V. vulnificus: NCTC 11067 (АТСС 29307);

- V. cholerae: не 01/0139 NCTC 8042 (АТСС 14733);

- Escherichia coli: АТСС 25922, 8739 или 11775.

Эффективность роста рассчитывают по формуле:

,

где N - количество выросших колоний.

Эффективность роста должна составлять по меньшей мере 50% для любых видов Vibrio и менее 1% для Е. coli. Колонии V. vulnificus: NCTC 11067 должны быть желтыми окруженными окрашенной желтой зоной среды, в то время как V. cholerae: NCTC 8042 должны быть пурпурными окруженными пурпурными зонами среды.

В.5 Модифицированный целлобиозо-полимиксин-колистин (mCPC) агар

В.5.1 1000-кратный красящий раствор

В.5.1.1 Состав:

бромтимоловый голубой - 4,0 г;

крезоловый красный - 4,0 г;

этанол, 95% - 100 .

В.5.1.2 Приготовление

Растворяют краски в этаноле для получения 4%-ного (масса к объему) раствора. Прибавляют 1  этого раствора на mCPC агара до конечной концентрации 40 мг бромтимолового голубого и 40 мг крезолового красного на .

В.5.2 Раствор 1

В 5.2.1 Состав:

пептон - 10 г;

мясной экстракт - 5 г;

натрия хлорид - 20 г;

1000-кратный раствор красителя - 1 ;

агар - 15 г;

дистиллированная вода - 900 .

В.5.2.2 Приготовление

Перемешивают компоненты и устанавливают рН 7,6. Охлаждают приблизительно до 50°С.

В.5.3 Раствор 2

В.5.3.1 Состав

целлобиоза - 10 г;

колистин - 400000 единиц;

полимиксин В - 100000 единиц;

дистиллированная вода - 100 

В.5.3.2 Приготовление

Растворяют целлобиозу в дистиллированной воде при нагревании. Охлаждают приблизительно до 50°С.

Добавляют антибиотики и перемешивают.

В.5.4 Готовая среда

В.5.4.1 Состав:

1000-кратный раствор красителя - 1 ;

Раствор 1 - 900 ;

Раствор 2 - 100 .

В.5.4.2 Приготовление

Прибавляют раствор 2 к раствору 1 и перемешивают.

Прибавляют 1  данного раствора на mCPC агара до конечной концентрации 40 мг бромтимолового голубого и 40 мг крезолового красного на .

В.5.5 Приготовление чашек с агаром

Наливают в чашки Петри по 15 - 20 . Перед использованием подсушивают поверхность агара.

В.5.6 Контроль среды

Для руководства см. [1], [2].

Для количественной оценки эффективности роста для каждой партии mCPC агара используют солевой питательный агар (SNA) как сравнительную среду и следующие штаммы:

- V. vulnificus: NCTC 11067 (АТСС 29307);

- V. cholerae: не О1/О139 NCTC 8042 (АТСС 14733);

- Escherichia coli: АТСС 25922, 8739 или 11775.

Эффективность роста рассчитывают по формуле:

,

где N - количество выросших колоний.

Эффективность роста должна составлять по меньшей мере 50% для каждых видов Vibrio и менее 1% для Е. coli. Колонии V. vulnificus: NCTC 11067 должны быть желтыми, окруженными окрашенной желтой зоной среды, а V. cholerae: NCTC 8042 - пурпурными, окруженными пурпурными зонами среды.

В.6 Солевой питательный агар (SNA)

В.6.1. Состав:

мясной экстракт - 5,0 г;

пептон - 3,0 г;

натрия хлорид - 10,0 г;

агар - 8 - 18 г*

вода - 1 000 .

В.6.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде, нагревая при необходимости. Регулируют рН так, чтобы после стерилизации он был на уровне 7,20,2 при 25°С.

Разливают среду в емкости подходящей вместимости. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при 121°С.

В.6.3 Приготовление чашек с солевым питательным агаром

Разливают в стерильные чашки Петри по 15 - 20  среды, охлажденной приблизительно до 50°С. Оставляют для застывания.

Непосредственно перед применением тщательно подсушивают поверхность агара в чашках (предпочтительнее после снятия крышек и переворачивания чашек).

В.6.4 Приготовление пробирок со скошенным агаром

Разливают примерно 10  среды, охлажденной приблизительно до 50°С, в пробирки подходящей вместимости. Оставляют до застывания в наклонном положении.

В.7 Реактив для определения оксидазы

В.7.1 Состав:

N, N, N', N' - Тетраметил-пара-фенилендиамин дигидрохлорид - 1,0 г;

вода - 100 .

В.7.2 Приготовление

Растворяют компоненты в холодной воде непосредственно перед использованием.

В.8 Солевой трехсахарный железистый агар (TSI)

В.8.1 Основная среда

В.8.1.1 Состав:

пептон - 20,0 г;

мясной экстракт - 3,0 г;

дрожжевой экстракт - 3,0 г;

натрия хлорид - 10,0 г;

лактоза - 10,0 г;

сахароза - 10,0 г;

глюкоза - 1,0 г;

железо (iii) цитрат - 0,3 г;

феноловый красный - 0,024 г;

агар - 8 - 18 г*;

вода - 1000 .

В.8.1.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде, нагревая, при необходимости. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 7,40,2 при температуре 25°С.

Разливают среду по 10  в пробирки подходящей вместимости. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре 121°С.

Оставляют для зас