Приложение 3. Микрометод токсико-биологической оценки рыбы и других гидробионтов

Приложение 3

Микрометод
токсико-биологической оценки рыбы и других гидробионтов

1. Общие сведения

1.1. Для предварительной экспрессной санитарно-биологической оценки гидробионтов и определения их безвредности в качестве тест-организма используют инфузорию Тетрахимена пириформис, штамм .

1.2. Метод не требует дефицитных дорогостоящих реактивов и оборудования, дает сопоставимые результаты с исследованиями на высших животных, а также позволяет оценить ветеринарно-санитарное качество и дать биологическую оценку рыбы и других гидробионтов в тех случаях, когда их невозможно изучить на высших животных.

1.3. Продолжительность исследования составляет 24-72 часа.

2. Принцип метода

2.1. Метод основан на посеве лабораторной культуры Тетрахимена пириформис во флаконы с исследуемыми пробами мяса рыб и других водных организмов.

2.2. Средой разбавления исследуемого материала служит 0,56%-ный раствор аптечной морской соли.

2.3. Оценку качества рыбы, других гидробионтов или продуктов из них проводят по выращенной культуре инфузорий.

2.3.1. Количество простейших подсчитывают под малым увеличением микроскопа в камере Фукс-Розенталя.

2.3.2. Качество инфузорий определяют по характеру движения, наличию измененных форм и мертвых клеток в культуре.

3. Выращивание маточной культуры инфузорий

3.1. Маточную культуру Тетрахимена пириформис выращивают на стандартной среде: пептона бактериологического - 2 г, глюкозы - 0,5 г, дрожжевого экстракта - 0,1 г, аптечной морской соли - 0,1 г на 100 мл дистиллированной воды, рН 7,0-7,5.

3.1.1. Приготовленную среду разливают в колбы Эрленмейера, емкостью 50 мл, чтобы слой жидкости был не выше 1,5 см и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 30 минут или дробно в аппарате Коха 3 дня подряд по 15 минут ежедневно.

3.1.2. Соблюдая правила асептики, вносят культуру в количестве 0,1 мл в колбы и выращивают в термостате при +25° или при комнатной температуре в темном шкафу .

3.1.3. Пересев на свежую среду осуществляют через 4-7 дней.

4. Способы хранения культуры инфузорий

4.1. Культуру Тетрахимены пириформис можно сохранить при комнатной температуре до 2 месяцев путем консервирования в 1%-ном растворе глюкозы (10 мл глюкозы + 0,5 мл культуры).

4.2. Четырехдневная культура инфузорий с добавлением 5-7 мг липоцеребрина аптечного сохраняется без пересева 3-4 месяца в холодильнике при температуре +4 - +5°С.

4.3. При посеве на 0,56%-ный раствор аптечной морской соли или углеводно-солевую дрожжевую среду (УСД) Тетрахимена пириформис сохраняет жизнеспособность в течение 1-1,5 месяцев.

5. Среда разбавления исследуемого материала

5.1. Для разбавления исследуемого материала применяют 0,56%-ный раствор аптечной морской соли, рН 7,0-7,5.

5.2. Приготовленный раствор разливают в колбы по 150-200 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 30 минут или дробно в аппарате Коха 3 дня подряд по 15 минут ежедневно.

5.3. В среде разбавления инфузории не размножаются, но сохраняют жизнеспособность в течение 30-45 дней.

6. Приборы, посуда, материалы и реактивы

6.1. Приборы: термостат, автоклав, аппарат "Шуттель", микроскоп световой МБС, рН-метр, весы аналитические, сушильный шкаф, центрифуга, водяная баня, аппарат Коха, мясорубка, гомогенизатор, камеры Фукс-Розенталя, штативы.

6.2. Посуда: фарфоровые ступки, колбы Кьельдаля, конические колбы Эрленмейера на 50 мл, пастеровские пипетки, стеклянные палочки, мерные пипетки на 0,1-10 мл, предметные и покровные стекла, флаконы из-под антибиотиков с резиновыми пробками, у которых в центре вставлены стеклянные трубки с ватными пробками с целью аэрации среды, воронки.

6.3. Материалы: вата, марля, индикаторная и фильтровальная бумага.

6.4. Реактивы: пептон бактериологический, дрожжевой экстракт, глюкоза в порошке, аптечная морская соль, хлористый натрий, 5%-ный спиртовой раствор йода, 10%-ный раствор натра едкого, стандартный казеин, порошок сублимированного куриного яйца.

7. Подготовка проб для исследования

7.1. От 10 экземпляров исследуемой партии рыб в области спины берут по 15-20 г мяса без кожи (всего 150-200 г средняя проба), 3-4 раза пропускают через мясорубку, тщательно перемешивают и гомогенизируют. Затем отвешивают 5-10 г гомогената, помещают в фарфоровые ступки и тщательно растирают. Срок хранения в холодильнике при температуре -10-15° до двух месяцев (пробы хранят в стаканчиках с притертыми крышками).

7.2. Подготовку проб от других гидробионтов производят аналогичным образом, отбирая от каждой исследуемой партии 30 экземпляров раков, лягушек, мидий и 50 моллюсков.

8. Контроль роста инфузорий

8.1, Ежедневно контролируют наличие роста инфузорий и его интенсивность. Предварительно просматривают пробы в пробирках или флаконах под микроскопом (МБС). Затем пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой берут каплю культуры, помещают на предметное стекло и под малым увеличением микроскопа (7x8) просматривают весь объем капли, все ее слои.

8.1.1. При этом определяют чистоту культуры, густоту роста, форму, подвижность и наличие погибших инфузорий.

8.2. Количественный учет выросших особей производят под микроскопом в счетной камере Фукс-Розенталя.

8.2.1. Подсчет инфузорий в счетной камере Фукс-Розенталя производят аналогично подсчету элементов крови в камере Горяева. На подсчет 40 проб этим способом необходимо 6-7 часов.

Предварительно инфузории фиксируют, внося во флаконы по одной капле 5%-ного спиртового раствора йода.

8.2.2. При густом росте (100 и более клеток в одном поле зрения микроскопа) культуру инфузорий разбавляют в 5-10 раз стерильным 0,56%-ным раствором аптечной морской соли и учитывают взятое разведение при окончательном подсчете числа выросших клеток, умножая среднее количество инфузорий в одном квадрате на разведение.

8.3. Количество инфузорий записывают по следующей форме:

Номер пробы	Повторы	Число клеток в квадратах										Среднее число клеток в 1 квадрате
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
	1	32	32	31	30	25	39	35	37	37	33	33,1
1	2	31	28	35	27	26	38	41	39	37	40	34,3
	3	24	32	31	27	26	25	42	39	37	24	30,7
Среднее в пробе из трех повторов												32,7

8.4. Количество выросших инфузорий учитывают в 1 мл культуры. Для этого среднее число клеток в пробе делят на два и умножают на .

Примечание: подсчет инфузорий в каждой пробе проводят в 3-х повторностях и за конечный результат принимают среднее из трех повторов.

9. Определение токсичности рыбы и других гидробионтов

9.1. Токсикологическим исследованиям подвергают рыбу и другие гидробионты, подозреваемые в отравлении, выловленные из загрязненных водоемов, а также те виды рыб, которые в определенное время года содержат биологические токсины.

9.2. Из приготовленной пробы (п. 7) берут навески 50, 100, 200 мг, помещают во флаконы, добавляют в каждый по 2 мл 0,56%-ного раствора аптечной морской соли и 0,04 мл 3-суточной культуры инфузорий, выращенных на пептонной среде. Каждый образец исследуют в трех повторностях.

Контролем при анализе служат флаконы:

- содержащие 0,56%-ный раствор аптечной морской соли,

- содержащие заведомо нетоксичные пробы мяса гидробионтов,

- содержащие стандартный казеин или сублимированное куриное яйцо.

9.2.1. Флаконы тщательно встряхивают и помещают в термостат при температуре +25°С или оставляют при комнатной температуре (+18 - +25°С) на 24 часа.

В течение суток флаконы 3-4 раза встряхивают с целью аэрации среды и взмучивания осевших частиц исследуемого материала.

9.3. Через 1, 4, 6, 24 часа посевы из каждого флакона просматривают под микроскопом.

10. Оценка токсичности рыбы и других гидробионтов

10.1. Токсичность исследуемых образцов определяют по наличию погибших инфузорий, измененных форм, по характеру движения и угнетенного роста Тетрахимены.

10.2. Наличие мертвых или деформированных клеток, замедление и изменение характера движения, угнетение роста и размножения инфузорий свидетельствует о токсичности исследуемого материала.

10.3. Отсутствие гибели инфузорий или других патологических изменений Тетрахимены за 24 часа свидетельствует об отсутствии токсичности мяса рыбы и других гидробионтов.

10.4. Одновременно проводят исследования токсичности воды из водоема, откуда выловлена рыба.

11. Определение токсичности воды

11.1. Аппаратура, материалы и реактивы такие же, как и при определении токсичности рыбы.

11.2. Пробы воды - 2-3 л берут непосредственно на месте гибели рыбы и других гидробионтов. Брать пробы надо так, чтобы образец соответствовал составу всей массы исследуемой воды: из поверхностных (30-50 см от поверхности) и глубинных слоев, на быстринах, перепадах, водосбросах и водоспусках. При этом необходимо исключить элементы случайности (временная взмученность, случайное загрязнение).

11.3. Пробы воды упаковывают, опечатывают и направляют в ветеринарную лабораторию для исследования.

12. Проведение анализа и оценка токсичности воды

12.1. Отобранные пробы разливают по 2 мл во флаконы, затем добавляют в каждый по 0,04 мл 3-суточной культуры инфузорий, выращенных на пептонной среде. Каждую пробу воды исследуют в трех повторностях.

Контролем при анализе служат флаконы:

- содержащие 0,56%-ный раствор аптечной морской соли,

- содержащие отстоявшуюся водопроводную воду,

- содержащие заведомо нетоксичные пробы воды из благополучных водоемов.

12.2. Флаконы тщательно встряхивают и помещают в термостат при температуре +25°С, или оставляют при комнатной температуре (+18 +25°С) на 24 часа.

В течение суток флаконы 3-4 раза встряхивают с целью аэрации среды.

12.3. Через 1, 2, 4, 6, 24 часа пастеровской пипеткой берут каплю культуры инфузорий и просматривают под микроскопом.

12.4. Оценка результатов проводится так же, как и при определении токсичности рыбы (см. раздел 10).

13. Определение токсигенности рыб и других гидробионтов

13.1. Для дифференциальной диагностики токсикозов рыб и других гидробионтов, вызываемых воздействием ядов микробного происхождения исследование проводят одновременно с прогреванием проб при +80° +120°С в течение 30-60 минут. Параллельно исследуют непрогретые пробы.

13.2. На токсигенность исследуют рыбу и другие гидробионты снулые, лежалые, травмированные, больные при наличии сомнений в отношении доброкачественности и невозможности определить пригодность их в пищу путем ветеринарно-санитарного осмотра.

13.3. Исследуемые образцы мяса и рыб других гидробионтов прогревают отдельно или в среде разбавления, охлаждают до температуры +18 +20°C и засевают инфузориями с последующим учетом результатов, как при определении токсичности рыбы (см. разделы 9, 10).

Контролем служат флаконы:

- содержащие 0,56%-ный раствор аптечной морской соли,

- содержащие свежие пробы мяса аналогичного вида гидробионтов,

- содержащие стандартный казеин или сублимированное куриное яйцо.

13.4. Если непрогретые пробы вызывают гибель и другие патологические изменения инфузорий, то проводят дополнительные исследования с использованием существующих бактериологических методов с целью определения видовой принадлежности микроорганизмов.

14. Определение питательной ценности гидробионтов

14.1. Из приготовленных проб (см. раздел 7) берут навеску 50 мг и вносят в фарфоровую ступку, добавляют 8 мл 0,56%-ного раствора аптечной морской соли и тщательно растирают пестиком в течение 2-3 минут до получения однородной массы. Градуированной пипеткой на 2 мл содержимое ступки вносят во флаконы. Каждую пробу исследуют в трех повторностях. Таким образом, для трех повторов берут 6 мл среды разбавления, а 2 мл для поправки на неизбежные потери.

14.2. Контролем при анализе служат флаконы, содержащие 0,56%-ный раствор аптечной морской соли без исследуемого образца, флаконы с казеином или сублимированным куриным яйцом (как стандарт) или же пробы сравниваемых образцов рыб и других гидробионтов. Контрольные пробы готовятся и исследуются аналогично опытным.

14.3. В каждый флакон добавляют по 0,04 мл (одну каплю) 3-суточной культуры инфузорий, выращенных на пептонной среде.

14.4. Флаконы закрывают пробками, тщательно встряхивают, помещают в специальные штативы и инкубируют в термостате 3 дня при температуре +25°С или оставляют при комнатной температуре.

14.5. В процессе инкубирования флаконы встряхивают 3-4 раза в день. При массовых исследованиях для встряхивания большого количества проб используют аппарат "Шуттель" с автоматическим режимом работы. Его помещают в термостат соответствующих размеров.

14.6. Ежедневно флаконы просматривают визуально и под МБС. Флаконы с видимой посторонней микрофлорой (плесень и др.) бракуют и исследование повторяют.

15. Оценка результатов определения питательной ценности гидробионтов

15.1. Питательную ценность гидробионтов определяют по интенсивности размножения инфузорий на питательном субстрате, содержащем в качестве источника белка и стимуляторов роста исследуемые образцы. Показателем питательной ценности служит число выросших за 3 дня инфузорий на опытном образце по отношению к числу клеток, выросших на контроле (п. 14.2), выраженное в процентах.

15.2. После инкубирования из каждого флакона пастеровской пипеткой берут по одной капле культуры на предметное стекло и просматривают под малым увеличением микроскопа. При этом определяют: наличие мертвых инфузорий, форму, величину, подвижность, густоту роста. При наличии мертвых и деформированных инфузорий флаконы бракуют и исследование повторяют.

15.3. После предварительной оценки образцов приступают к подсчету количества инфузорий в опытных и контрольных пробах (см. раздел 8).

15.4. Полученные результаты сравнивают. Вычисляют процент роста, что определяет питательную ценность по сравнению с контролем.

Пример подсчета: Среднее количество инфузорий, выросших в пробе с контрольным образцом (карп клинически здоровый) - шт. в 1 мл, а в пробе с опытным образцом (карп, погибший от асфиксии в результате отравления аммиаком) - шт. в 1 мл. Относительная питательная ценность мышечной ткани последнего равняется 80 процентам. Таким образом, можно сделать заключение, что рыба, отравленная аммиаком, на 20% менее питательна, чем здоровая (при всех отравлениях, а также у больной, лежалой, снулой, свежемороженой рыбы биологическая ценность обычно понижена).

Микрометод токсико-биологической оценки рыбы и других гидробионтов разработан Белоцерковским сельскохозяйственным институтом им. П.Л. Погребняка (П.В. Микитюк). Одобрен ГУВ Минсельхоза СССР 5.07.1985 г. N 115-6а, утвержден академиком-секретарем Отделения ветеринарии академиком ВАСХНИЛ В.П. Шишковым 8 сентября 1986 г.