Приложение 1. Приготовление взвеси и количественный учет микроорганизмов

Приложение 1

Приготовление взвеси и количественный учет микроорганизмов

При проведении работ по исследованию штаммов-микроорганизмов необходимо использовать свежую культуру микроба-продуцента, выращенную с учетом скорости роста продуцента и того возраста культуры, при котором, согласно регламенту конкретного производства, наиболее вероятно попадание продуцента в воздух производственной и окружающей среды.

Питательные среды, используемые для выращивания, должны обеспечивать рост высеваемой культуры.

При приготовлении взвеси культуры продуцента следует учитывать особенности его строения и роста, различные размеры и неоднородность частиц во взвеси, что требует введения поправочного коэффициента при стандартизации микробной взвеси но стандарту мутности.

С этой целью полученный смыв (соскоб) микроорганизмов дезинтегрируют и отмывают от остатков питательной среды повторным центрифугированием в изотоническом растворе хлорида натрия. Определяют оптическую плотность полученной (исходной) микробной суспензии, после чего ее раститровывают последовательными десятикратными разведениями до предполагаемой концентрации 100-1000 клеток в 1 мл.

Из 3-5 последних разведений производят высев по 0,1 мл на 3-5 чашек Петри (можно по 2-3 разведения на 1 чашку). По истечении сроков инкубации по числу выросших колоний продуцента (учету подлежат чашки с ростом от 10 до 200 колоний) рассчитывается концентрация КОЕ (колониеобразующие единицы) в исходной суспензии и величина поправочного коэффициента. Расчет определяется по формулам:

где М - количество КОЕ в 1 мл исходной суспензии; а - среднее количество колоний на 1 чашке Петри с выбранным разведением суспензии; - степень разведения суспензии; 10 - постоянный коэффициент при посеве 0,1 мл суспензии.

где К - поправочный коэффициент; М - количество КОЕ в 1 мл "исходной" суспензии; С - концентрация клеток в "исходной" суспензии, определенная по стандарту мутности или другим нефелометрическим методом.

Пример расчета

По стандарту мутности исходная суспензия соответствовала 12 млрд микробных тел/мл (1,2 х ). Из разведения выросло 51, 74, 68, 45 и 62 колоний на 1 чашке Петри при посеве 0,1 мл.

Условия приготовления суспензии должны быть хорошо отстандартизированы для воспроизведения поправочного коэффициента (С 25%). Необходимо периодически проверять концентрацию КОЕ в суспензии, при этом истинная доза медленно растущих микроорганизмов-продуцентов, введенная животным, может быть определена ретроспективно на 6-12 сутки.

Для определения концентрации в суспензии дрожжевых клеток, спор бактерий и грибов можно использовать камеру Горяева или другие счетные камеры.

Для учета жизнеспособных клеток взвесь микроорганизмов разводят вдвое краской следующего состава: 0,1%-ный раствор эозина, приготовленный на 1,7%-ном растворе хлорида натрия, смешивается в соотношении 1:1 с 0,1%-ным раствором трипанового синего, приготовленным на дистиллированной воде. Готовой взвесью заполняют счетную камеру и, в соответствии с инструкцией для используемой камеры, ведут подсчет клеток, отдельно учитывая окрашенные (мертвые) клетки. Определяют процент живых клеток. Учитывая двойное разведение суспензии при окрашивании, в числитель соответствующей формулы для расчета количества клеток вводится коэффициент 2.