Приложение А (справочное). Методы оценки популяции микроорганизмов на продукции

Приложение А
(справочное)

Методы оценки популяции микроорганизмов на продукции

А.1 Введение

Это приложение содержит руководство по реализации требований настоящего стандарта, служит для лучшего понимания этих требований, вносит ясность в важные вопросы, которым следует уделить внимание, но не является исчерпывающим.

Могут быть использованы другие методы, но эффективность их должна соответствовать требованиям настоящего стандарта.

А.2 Общие положения

Для того чтобы данные, полученные при оценке бионагрузки, были надежными и воспроизводимыми, важно, чтобы эти оценки проводились в контролируемых условиях. Лабораторные установки, используемые для получения оценок как у изготовителя медицинских изделий, так и в другом месте, должны обслуживаться и работать в соответствии с документированной системой качества.

Если бионагрузку оценивают в лаборатории под руководством изготовителя медицинских изделий, то в лаборатории должна быть введена система качества, действующая у изготовителя. Если используют внешнюю лабораторию, то рекомендуется ее официально сертифицировать по соответствующему документу ISO (например, ISO/IEC, Guide 25).

Любая лаборатория должна организовать службу качества, что должно быть квалифицировано как политика качества. Полномочия и ответственность внутри лаборатории должны быть официально установлены и документированы. Определенное лицо должно быть назначено ответственным за разработку системы качества лаборатории и должно иметь достаточные полномочия для внедрения этой системы.

Работа лаборатории должна быть предметом регулярного внутреннего аудита. Результаты аудита должны документироваться и рассматриваться руководством лаборатории.

ISO/IEC Guide 25 [1] дает основные принципы системы качества в лаборатории. Специфические требования к системам качества для изготовителей медицинских изделий даны в стандартах ISO 13485 [5] и ISO 13488 [6].

А.3 Оборудование и материалы

А.3.1 Оборудование электронной обработки данных

Компьютеры могут использоваться в лабораториях для прямого и непрямого сбора, обработки и/или хранения данных. Оборудование и программное обеспечение, используемое для этих целей, должно находиться под контролем.

Используемая компьютерная система, включая оборудование и программное обеспечение, должна быть идентифицирована, и любые изменения, касающиеся их, должны быть документированы и соответствующим образом утверждены.

Для программного обеспечения необходимо иметь следующую документацию:

- прикладные программы, используемые в компьютерной системе;

- операционные программы;

- используемые массивы данных.

Все программное обеспечение должно контролироваться на предмет пригодности до начала его использования.

Если компьютерное программное обеспечение разработано на месте, должны быть предусмотрены следующие процедуры, гарантирующие:

- сохранность документации, включая систему программирования;

- сохранность протоколов контроля пригодности;

- документирование изменения программ;

- документирование изменений в оборудовании и официальную проверку перед началом использования.

Этот контроль должен также применяться к любому измененному или изготовленному на заказ пакету программного обеспечения.

Необходимо предусмотреть процедуры определения и предотвращения несанкционированного изменения программного обеспечения.

Программное обеспечение, которое организует, классифицирует и представляет данные для статистических или других математических процедур, обрабатывает или анализирует электронные сохраняемые данные, должно позволять восстанавливать исходные входные данные. Могут потребоваться специальные процедуры архивирования компьютерных данных, и эти процедуры должны быть документированы.

А.3.2 Лабораторное оборудование

Должна быть предусмотрена система определения требований технического обслуживания для каждой части лабораторного оборудования.

Оборудование, не требующее калибровки, должно быть четко указано.

Любое оборудование или его части, контактирующие с продуктом во время испытаний, элюент (смывная жидкость), питательные среды и т.д. должны быть стерильными.

А.3.3 Микробиологические питательные среды

При приготовлении всех микробиологических сред и элюентов, используемых для удаления микроорганизмов из продукта, должна быть обеспечена их стерильность.

Должна быть показана способность микробиологической среды поддерживать рост микроорганизмов. Обычно это достигается применением теста роста для каждой серии питательной среды с использованием малого количества (между 10 и 100 колониеобразующих единиц) выбранных микроорганизмов. Тесты поддержки ростовых свойств обычно приведены в фармакопеях, указывающих, какие микроорганизмы могут считаться подходящими.

А.4 Выбор методов

А.4.1 Общие положения

Последовательность основных этапов методов оценки микробиологической контаминации следующая:

                           ВЫБОР ПРОБЫ

                                |

                                |

                   СБОР ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ИСПЫТАНИЙ

                                |

                                |

              ПЕРЕДАЧА ДЛЯ ИСПЫТАНИЙ В ЛАБОРАТОРИЮ

                                |

                                |

                  ОБРАБОТКА (если необходимо)

                                |

                                |

                   ПОСЕВ В ПИТАТЕЛЬНУЮ СРЕДУ

                                |

                                |

                          ИНКУБИРОВАНИЕ

                                |

                                |

            ПОДСЧЕТ И ХАРАКТЕРИСТИКА (если плакируется)

                                |

                                |

                       ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ДАННЫХ

Лицо, ответственное за проведение такой процедуры, должно иметь необходимые знания о сырье, материалах, производственной среде, процессе производства и свойствах продукции, чтобы выбрать соответствующие методы оценки для каждого из этих этапов.

Ответственное лицо должно принимать в расчет особенность ситуации, решая вопросы периодичности отбора проб, выбора вида питательной среды и условий культивирования, а также длительность проведения расчета и валидации. Документирование этих факторов и обоснований для принятия решений способствует последовательному рассмотрению методик.

Если оцененная бионагрузка предназначена для непосредственного определения условий стерилизации, то в программу оценки бионагрузки необходимо включить упаковочные материалы.

В идеале бионагрузка должна систематически оцениваться для каждого вида продукции. Однако учитывая разнообразие производимой продукции (часто в малых сериях), это не всегда бывает оправданным. В этих обстоятельствах виды продукции могут быть сгруппированы на основе типовой продукции, эквивалентной производственной среды и используемого сырья. Разумное отнесение продукции к таким группам должно быть документировано и должно обеспечивать репрезентативность данных, обосновывающих группировку продукции.

А.4.2 Элементы оценки бионагрузки

А.4.2.1 Общие положения

Методы отбора и обработки проб должны быть такими, чтобы исключить непредвиденную контаминацию и значительное изменение количества и вида микроорганизмов в пробе. Система отбора проб должна позволять проводить последовательное сравнение периодов времени отбора проб.

Обычно микроорганизмы переносят из испытуемых образцов или их представительных частей в питательную среду погружением, отмыванием или разведением в элюенте. Элюент может быть потом пропущен через мембранный фильтр, который сам помещен в питательную среду или прямо положен на плоскую поверхность питательной среды. Крупные неразделимые образцы могут контролироваться методами, применяемыми для контроля поверхностей (А.4.2.4.8 - А.4.2.4.10).

Выявление микроорганизмов с поверхности продуктов может быть улучшено в присутствии поверхностно-активных веществ в элюенте и при физическом воздействии на продукт в жидкости. Обычно используемые элюенты приведены в А.4.2.5.

А.4.2.2 Выбор пробы

А.4.2.2.1 Для определения предстерилизационного числа проба отбирается двумя способами:

a) отбор продукта случайным образом перед стерилизацией;

b) отбор непригодного для продажи продукта, который представляет собой часть продукции или иным образом забракованную продукцию.

Выбор образца может зависеть от множества факторов, но образец должен как можно ближе соответствовать продукции, предназначенной для стерилизации. Если принято решение использовать забракованную продукцию, она должна представлять собой продукцию, прошедшую все основные стадии производства, включая возможные процессы очистки и упаковки. Предпочтительно взять продукцию в соответствии с перечислением а).

Для различных целей, таких как валидация процесса очистки или оценка производственного процесса, при выборе образцов для оценки бионагрузки могут использоваться различные стратегии.

А.4.2.2.2 При необходимости для оценки бионагрузки используется весь продукт, хотя это может оказаться неосуществимым из-за того, что продукт не помещается в лабораторную посуду. Тогда следует взять максимально большую часть продукта, которая позволяет оценить полную бионагрузку всего продукта. Тщательный выбор части продукта необходим тогда, когда контролируемый продукт является большим, например, хирургическая одежда или наружный дренажный комплект.

А.4.2.2.3 Во время отбора проб для оценки бионагрузки продукт должен находиться в своей стандартной упаковке.

При отборе части продукта для оценки бионагрузки нужно соблюдать осторожность при манипуляции с продуктом. Это должно быть сделано в чистых условиях (например, внутри ламинарного шкафа), чтобы избежать дополнительной контаминации.

А.4.2.3 Периодичность отбора проб

Периодичность оценки бионагрузки должна быть установлена на основе анализа изменяющихся факторов, к которым относятся:

а)данные предыдущей оценки бионагрузки;

b) цель, для которой осуществляется оценка бионагрузки;

c) используемый процесс производства;

d) размер серии;

e) частота производства продукта;

f) используемые материалы;

д) колебания в оценках бионагрузки.

Отбор проб может осуществляться через определенные промежутки времени (например, ежемесячно), или в зависимости от конкретного объема продукции (например, оценка других серий). Общая практика состоит в том, что оценка бионагрузки осуществляется с большей частотой в начале производства нового продукта и затем со снижающейся частотой по мере накопления знаний о бионагрузке.

Частота оценки бионагрузки должна позволять оценивать ее изменения, вызванные, например, сезонными колебаниями, изменениями производства или изменениями материалов.

А.4.2.4 Обработка

А.4.2.4.1 Общие положения

Степень адгезии микроорганизмов к поверхности зависит от природы поверхности самих микроорганизмов и других присутствующих материалов (например, смазки). Причина контаминации будет также оказывать влияние на степень адгезии. Для удаления микроорганизмов может использоваться отмывание с принудительным физическим воздействием или прямой отбор пробы с поверхности. Для лучшего выявления микроорганизмов может использоваться поверхностно-активное вещество, при высокой концентрации оно может ингибировать микроорганизмы (А.4.2.5).

С отдельными материалами некоторые микроорганизмы могут образовывать биопленки, т.е. структуры, в которых микроорганизмы инкапсулированы в матрицы, прочно скрепляющиеся с поверхностью. Микроорганизмы в биопленках могут проявлять увеличенную резистентность к процессу стерилизации. Образование биопленок обычно не происходит при производстве медицинских изделий, хотя в некоторых случаях они могут образовываться, например, при работе с материалами животного происхождения. В таких случаях нужно обратить внимание на возможность образования биопленки и учесть, что методы обработки, изложенные в А.4.2.4.2 и А.4.2.4.10, не могут применяться для выделения микроорганизмов, находящихся в биопленках. Наличие биопленки может быть установлено при валидации методов выделения, если высокое число микробиологических частиц отмечено в повторном выделении (А.5.2.1.1).

Любая технология, применяемая при оценке бионагрузки, должна быть воспроизводимой. Следует избегать условий, которые могут понизить жизнеспособность микроорганизмов, таких как чрезмерная кавитация, механические воздействия, повышение температуры или осмотический шок.

Некоторые методы легче поддаются контролю, чем другие. Изменения метода и средств контроля этих изменений должны рассматриваться при выборе метода и выборе подходящей комбинации изменений. Например, для данного метода может быть увеличено время или изменен принцип механического воздействия для увеличения эффекта удаления организмов.

Некоторые методы могут дезагрегировать продукт при контроле (например, дезинтеграция, растворение и перемешивание). Присутствие дезагрегированного материала может затруднить подсчет количества микроорганизмов и потребовать дополнительной обработки, например, для отделения дезагрегированного материала от элюента. Полученные при этом данные должны быть представительными.

Образцы для тестирования следует передавать в лабораторию как можно скорее. Если задержка передачи образцов в лабораторию неизбежна, то необходимо выбрать условия хранения таким образом, чтобы предотвратить потерю микроорганизмов или изменения их популяции. Должно быть указано максимальное время хранения. Высушивание может быть причиной значительного снижения числа микроорганизмов и должно быть учтено при выборе условий и времени хранения.

А.4.2.4.2 Отмывание

Образец для контроля и известный объем элюента помещают в стерильную емкость для отмывания. В емкости работают двухлопастные мешалки, принуждая элюент проходить через образец и вокруг него. Метод особенно эффективен для мягких, волокнистых и/или абсорбирующих материалов, но неприменим для любых материалов, которые могут привести в негодность емкость, например, устройств, содержащих иглы и большие предметы.

Должно быть указано время обработки.

Этот метод может давать суспензию с низкой концентрацией микроорганизмов, поскольку используется относительно большое количество элюента. Для последовательного подсчета могут потребоваться другие методы, такие как фильтрация (А.4.2.6.2) или чашечный метод (А.4.2.6.3).

А.4.2.4.3 Использование ультразвука

Контролируемый образец погружают в элюент известного объема в соответствующем сосуде. Каждый сосуд и его содержимое обрабатываются в ультразвуковой ванне, или в содержащийся в сосуде элюент погружают ультразвуковой зонд.

Определяют номинальную частоту ультразвука, продолжительность обработки и позиции, в которых образцы находятся в ультразвуковой ванне. Может потребоваться ограничение числа одновременно обрабатываемых образцов, чтобы мощности ультразвука хватило для эффективной обработки.

Метод особенно подходит для твердых водонепроницаемых образцов и продуктов сложной формы. Он может быть деструктивным для некоторых медицинских изделий, в особенности для содержащих электронные компоненты, таких как имплантируемые кардиогенераторы.

Энергия ультразвука и продолжительность обработки не должны быть велики настолько, чтобы вызвать гибель микроорганизмов или перегрев элюента.

А.4.2.4.4 Шейкинг (перемешивание встряхиванием) со стеклянными бусами и без них

Контролируемый образец погружается в сосуд с элюентом известного объема и подвергается тряске на механическом шейкере (возвратно-поступательного, кругового или осевого действия) для удаления микроорганизмов. Может использоваться ручной шейкер, но его эффективность зависит от оператора. Для увеличения поверхностного трения и коэффициента выделения в шейкер могут добавляться стеклянные бусы определенного размера. Размер стеклянных бус, время и частота действия шейкера не должны вызывать перегрева и/или возможного повреждения микроорганизмов.

Добавление стеклянных бус может увеличить площадь поверхности, к которой могут прилипать микроорганизмы.

Должны быть указаны время и частота действия шейкинга.

А.4.2.4.5 Вихревое смешивание

Контролируемые образцы погружают в закрытый контейнер, содержащий известный объем элюента, на который воздействует вращающаяся лопатка вихревого миксера с образованием вихрей.

Должны быть указаны используемый контейнер, время и скорость перемешивания. Образующиеся вихри будут также зависеть от давления, создаваемого руками, которое может быть различным. Метод прост и скор в обращении, но подходит только для образцов с правильными поверхностями.

А.4.2.4.6 Промывание сильным потоком

Элюент проходит через внутренние полости контролируемого образца.

Поток может образовываться за счет гравитации либо с помощью насоса. Может использоваться другой метод, когда продукт наполняют элюентом, затем сжимают и встряхивают.

Должны быть указаны время контакта между устройством и элюентом, скорость промывания и объем жидкости.

А.4.2.4.7 Гомогенизация (дезинтеграция)

Тестируемый образец погружают в элюент известного объема, находящийся в соответствующем сосуде. Образец перемешивают или измельчают в течение заданного времени, которое зависит от размера образца, но время не должно быть настолько большим, чтобы приводить к перегреву элюента и возможному повреждению микроорганизмов. Метод обеспечивает способ разделения образца на столь малые части, что микроорганизмы могут быть пересчитаны соответствующим методом.

А.4.2.4.8 Метод смыва тампонами

Тампоны состоят из абсорбирующего материала для взятия пробы, намотанного на палочку или рукоятку соответствующей формы. Материал может быть растворимым или нерастворимым.

Стандартный метод заключается в увлажнении тампона буферным раствором или жидкой питательной средой и протирании им поверхности, предназначенной для взятия пробы. Коэффициент регенерации может быть повышен в некоторых случаях первичным увлажнением поверхности и затем протиранием ее сухим тампоном. Тампон помещают в буферный раствор или жидкую питательную среду и встряхивают для того, чтобы удалить микроорганизмы из тампона. Тампон растворяется в буферном растворе или жидкой питательной среде. Полученную суспензию анализируют с помощью фильтрации, чашечным методом или другим способом.

Метод смыва применяется для контроля поверхностей неправильной формы или относительно недоступных поверхностей. Он также применим и для контроля больших поверхностей. При использовании этого метода вероятность ошибки велика из-за разнообразия способов манипулирования тампонами. Более того, все микроорганизмы с поверхности не могут быть собраны тампоном. Некоторые из собранных микроорганизмов могут попасть внутрь структуры тампона и таким образом остаться необнаруженными.

В тампоне не должно быть бактерицидных или бактериостатических агентов.

А.4.2.4.9 Покрытие агаром

Покрытие поверхности продукта расплавленной агаровой питательной средой (при максимальной температуре 45°С) и инкубирование до получения видимых колоний применяют при малой бионагрузке и соответствующей конфигурации продукта.

Возможным недостатком метода является естественное образование конгломератов клеток на поверхностях, распределенных в колониях в контактных поверхностях агара, высыхание агара и возможность наличия анаэробов.

А.4.2.4.10 Контактные пластины

С помощью контактных пластин или слайдов затвердевшая питательная среда может прижиматься к поверхности для адгезии живых микроорганизмов к этой среде. Пластины и слайды инкубируются до появления колоний, которые затем подсчитываются.

Преимущество таких систем заключается в простоте. Результаты непосредственно относятся к поверхности контакта с твердой питательной средой.

Этот метод должен применяться только тогда, когда другие методы неприменимы, так как обычно он имеет низкую эффективность. Контактные пластины и слайды обычно применяются только для плоских поверхностей или поверхностей правильной формы.

А.4.2.5 Элюенты, разбавители и транспортные среды

Во время оценки бионагрузки элюент может использоваться для выделения микроорганизмов из продукта. Транспортные среды могут быть использованы для передачи выделенных микроорганизмов для подсчета. Разбавители могут использоваться для приготовления суспензий, содержащих микроорганизмы в счетных количествах.

Свойства смывных жидкостей и разбавителей могут оказывать заметное влияние на общую эффективность используемого метода. Выбирая элюенты и разбавители, нужно обратить внимание на их состав (например, составляющие компоненты и их концентрации, осмотическое давление и рН). Состав должен быть таким, чтобы не было ни пролиферации, ни инактивации микроорганизмов.

Для удаления микроорганизмов с твердых поверхностей с помощью жидкости в нее может добавляться поверхностно-активное вещество.

Основные элюенты и разбавители приведены в таблице А.1.

Таблица А.1 - Примеры элюентов и разбавителей

Раствор	Концентрация в воде	Применение
Рингера	0,25%	Общее
Пептон	0,1 - 1,0%	Общее
Пептонный буфер	0,067 М фосфат 0,43% хлористый натрий 0,1% пептон	Общее
Фосфатный буфер	0,02 М фосфат 0,9% хлористый натрий	Общее
Хлористый натрий	0,25 - 0,9%	Общее
Кальгон Рингера	0,25%	Растворение тампонов с алигинатом кальция
Тиосульфат Рингера	0,25%	Нейтрализация остатков хлора
Вода		Растворение водяных проб, приготовление изотонических растворов растворимых материалов до начала подсчета
Примечание - Этот перечень не является исчерпывающим. Детергент, такой как полисорбат (Твин 80), может добавляться к элюенту и к разбавителю. Как правило, используют концентрацию от 0,01 до 0,1%, в зависимости от специфики применения. Соответствующую концентрацию детергента в каждом случае выбирают с таким расчетом, чтобы избежать пенообразования.

А.4.2.6 Перенос в питательную среду

А.4.2.6.1 Общие положения

Процедура приготовления суспензии микроорганизмов должна предусматривать контроль наличия живых микроорганизмов в элюенте, который должен проводиться одним из методов, описанных в А.4.2.6.2 - А.4.2.6.7.

Перед переносом в питательную среду может потребоваться дополнительная обработка, чтобы дезагрегировать микроорганизмы и таким образом уменьшить разброс. В некоторых случаях метод, используемый для выделения микроорганизмов из контролируемого образца, может разрушать агрегаты. В некоторые моменты может быть необходимо проведение отдельной обработки.

Если в элюенте присутствуют бактерицидные или бактериостатические вещества, их концентрация может быть снижена до значения, не оказывающего никакого влияния на микроорганизмы при растворении, фильтрации или химической инактивации. Присутствие бактерицидных или бактериостатических веществ может по этой причине оказать влияние на выбор метода подсчета.

В методе подсчета колоний нужно принимать во внимание верхний предел колоний, появляющихся при инкубировании. Он должен быть таким, чтобы каждый живой микроорганизм мог быть выявлен как видимая колония, не испытывающая вредного влияния находящихся рядом микроорганизмов. Присутствие волокон может препятствовать образованию дискретных колоний и, следовательно, затруднять подсчет.

А.4.2.6.2 Мембранная фильтрация

Мембранная фильтрация и последующая инкубация фильтра на подходящей питательной среде для получения видимых колоний является эффективным средством оценки контаминации. Мембранные фильтры с соответствующими размерами пор способны удалять микроорганизмы из элюента, проходящего через них. Фильтр с порами размером 0,45 мкм обычно используется для улучшения условий образования колоний. Для инкубации мембранный фильтр может быть положен либо на поверхность агара, либо на абсорбирующую прокладку, пропитанную питательной средой. Образованные на поверхности мембранного фильтра колонии могут быть подсчитаны и изолированы для их классификации.

Мембранная фильтрация особенно пригодна для суспензий с низкой концентрацией микроорганизмов.

Фильтрацию используют, если жидкий субстрат содержит бактерицидные или бактериостатические вещества. Микроорганизмы удаляются из элюента и могут быть отмыты на мембранном фильтре перед инкубированием. Некоторые типы мембран могут абсорбировать или выделять вещества, которые могут ингибировать рост микроорганизмов, поэтому важно, чтобы использовались только мембранные фильтры, соответствующие целям подсчета микроорганизмов. Мембранный фильтр и элюент должны быть совместимы.

Обычно применяется вакуум или иногда сжатый воздух. Нужно проявлять осторожность, чтобы избегать избыточного противодавления, которое может вызвать изменение или повреждение мембранного фильтра.

Примечание - Мембранная фильтрация элюентов, содержащих остатки волокнистых продуктов, может быть затруднена, так как мембранный фильтр может быть блокирован.

А.4.2.6.3 Заливаемые пластины (метод разливок)

Отдельные части суспензии (аликвоты) каждого разведения смешивают с расплавленным агаром при температуре, не превышающей 45°С, которые затвердевают на пластине, например, на чашке Петри. Залитую чашку инкубируют и подсчитывают колонии.

Заливаемые пластины не отделяют микроорганизмы от элюента. При наличии бактерицидных или бактериостатических веществ нужно руководствоваться рекомендациями А.4.2.6.1.

А.4.2.6.4 Пластины с распределением суспензии

Определенное количество данного разведения распределяют на поверхности твердой питательной среды с помощью шпателя.

Количество суспензии, распределенное на поверхности среды, должно быть поглощено средой так, чтобы образовались отдельные колонии; условие абсорбции определяет объем суспензии, который может использоваться на чашке.

При наличии бактерицидных или бактериостатических веществ нужно руководствоваться рекомендациями А.4.2.6.1.

А.4.2.6.5 Метод наиболее вероятного числа (НВЧ) для серийных разведений

При достаточном количестве элюента может быть сделан ряд последовательных разведений, которые инокулируются в питательную среду так, что часть инокулированной среды не дает видимого роста при последующей инкубации. Статистическая обработка числа разведений, в которых наблюдается рост, обеспечивает оценку исходного количества микроорганизмов. Таблицы [14], построенные на основе соответствующих статистических положений, позволяют непосредственно определить наиболее вероятное число микроорганизмов (НВЧ).

Метод НВЧ прост, но диапазон условий культивирования, который может быть использован, ограничен, и статистическая основа метода делает его более приемлемым скорее для ориентировочных, чем для точных оценок.

Если присутствуют бактерицидные или бактериостатические вещества, то нужно руководствоваться рекомендациями А.4.2.6.1.

А.4.2.6.6 Спиральные пластины

Определенное количество суспензии микроорганизмов распределяется на поверхности твердой питательной среды. Распределение происходит с уменьшающейся скоростью по спирали от центра чашки к периферии с помощью автоматического устройства.

После последующей инкубации число микроорганизмов в исходной суспензии определяется с помощью специальной счетной сетки и счетной техники, когда основой расчетов является вся чашка или обсчитываемый сектор.

При наличии бактерицидных или бактериостатических веществ нужно руководствоваться рекомендациями А.4.2.6.1.

Техника спиральных пластин дает воспроизводимые результаты, которые соответствуют результатам, полученным по методу серийных разведений, и технике распределения суспензии. Благодаря конструкции устройства, использованию капиллярной трубки и малым объемам метод спиральных пластин в первую очередь оказывает благоприятное влияние на инокулированную суспензию, которая хорошо гомогенизируется и становится свободной от частиц материала.

А.4.2.6.7 Метод НВЧ для твердых образцов

Метод НВЧ может быть применен к небольшим отдельным образцам. Метод применим при достаточно низкой бионагрузке на образец и в случае, когда часть образцов, непосредственно введенных в питательную среду, не дает роста при инкубации. Результаты могут быть оценены по А.4.2.6.5. Для некоторых продуктов может быть подходящим введение более чем одного образца в каждую порцию среды роста.

При наличии бактерицидных или бактериостатических веществ нужно руководствоваться рекомендациями А.4.2.6.1.

А.4.2.7 Другие методы индикации микроорганизмов

Для определения бионагрузки, кроме метода подсчета колоний, могут применяться методы измерения метаболической активности (например, измерение сопротивления или эпифлуоресценция). Такие методы называют непрямыми. Эти методы должны быть калиброваны по числу колоний. Эти методы требуют относительно большого числа микроорганизмов в элюенте пробы, что ограничивает их применение. Как правило, минимальный предел обнаруживаемых частиц превосходит 100 колониеобразующих единиц (КОЕ).

А.4.3 Выбор питательных сред и условий инкубации

При выборе питательных сред и условий инкубации нужно учитывать следующее:

a) ни одна комбинация среды и условий инкубации не может обеспечить роста всех микроорганизмов, однако некоторые комбинации могут дать более представительные результаты, чем другие;

b) валидационные испытания могут потребовать более широкого диапазона питательных сред и условий инкубации, чем в текущем процессе;

c) прямой посев на селективные среды может не дать роста микроорганизмов, подвергшихся физиологическому стрессу, или поврежденных микроорганизмов;

d) выбор условий культивирования может быть сделан на основе оценки контролируемого продукта, вероятных источников микробной контаминации и вида предполагаемых микроорганизмов.

Примеры питательных сред и условий инкубации приведены в таблице А.2.

Дрожжи и плесени могут быть культивированы путем повторной инкубации чашек с аэробными бактериями и соответствующими питательными средами при более низких температурах, чем те, которые приведены в таблице А.2, дополнительно в течение от трех до семи дней. Этот метод требует более тщательного обращения.

Все методы неселективного культивирования анаэробов могут также выявить рост факультативных анаэробов.

Таблица А.2 - Примеры питательных сред и условий инкубации

Тип микроорганизмов	Твердая питательная среда	Жидкая питательная среда	Условия инкубации*(1)
Неселективные аэробные бактерии	Соево-казеиновый питательный агар Триптоно-соевый питательный агар Питательный агар Кровяной агар Глюкозо-триптоновый агар	Соево-казеиновый питательный бульон Триптоно-соевый бульон Питательный бульон	От 30 до 35°С, от 2 до 5 сут.
Дрожжи и плесени	Декстрозовый агар Сабуро Агар солодового экстракта Бенгальская роза Хлороамфениколовый агар (Соево-казеиновый питательный агар) Триптоно-соевый агар	Декстрозовый бульон Сабуро Бульон солодового экстракта Соево-казеиновый бульон Триптоно-соевый бульон	От 20 до 25°С, от 5 до 7 сут.
Анаэробные бактерии	Уплотненный агар для клостридий*(2) Агар Шидлера Предварительно восстановленный кровяной агар*(2) Обедненный анаэробный агар*(2) Агар Вилкена-Челгрена*(2)	Бульон Робертсона из жареного мяса Жидкий тиогликолиевый бульон	От 30 до 35°С, от 3 до 5 сут.
*(1) Указанные здесь условия инкубации являются обычными для типов микроорганизмов, приведенных в таблице. *(2) Культивируется в анаэробных условиях. Примечание - Этот список не является исчерпывающим.

А.5 Валидация методов оценки бионагрузки

А.5.1 Общие положения

Валидация методов оценки бионагрузки приводит к оценке микрофлоры, существующей на продукте. Для надежной оценки следует валидировать все используемые методы и определить эффективность регенерации.

А.5.2 Валидация методов удаления микроорганизмов

А.5.2.1 Подходы к валидации

Существуют два основных подхода к валидации эффективности удаления микроорганизмов из медицинских изделий. Эти подходы следующие:

a) повторяющаяся обработка пробы продукта;

b) инокуляция продукта определенным количеством микроорганизмов.

Повторяющаяся обработка пробы имеет преимущество при использовании естественной микробной контаминации, но требует относительно высокой начальной бионагрузки. Второй подход создает модель системы для испытаний, но ставит проблему применимости к естественной ситуации. Он может быть пригоден для продуктов с низким уровнем естественной контаминации.

А.5.2.1.1 Метод повторяющихся регенераций

Принцип метода заключается в том, что оценка бионагрузки повторяется до тех пор, пока число микроорганизмов, полученных при взятии проб, перестает увеличиваться. После каждой повторности элюент полностью смывают с продукта или его части и подсчитывают количество микроорганизмов. Аккумулированные результаты последовательных смывов сравнивают. Этот метод не обладает необходимой точностью. Нельзя определить точное соотношение между числом выявленных микроорганизмов и их действительным числом на продукте.

А.5.2.1.2 Метод инокуляции продукта

Для определения эффективности выделения может создаваться искусственная бионагрузка продукта инокуляцией известного количества выбранных микроорганизмов. Микроорганизмы могут быть вегетативными клетками или спорами; обычно используют аэробные бактериальные споры. Применение вегетативных микроорганизмов на практике затруднено из-за потери их жизнеспособности при высушивании.

Микроорганизмы, используемые для валидационных исследований, выбирают, исходя из естественной бионагрузки. Выбранные микроорганизмы могут включать представителей:

a) плесеней;

b) мезофильных вегетативных микроорганизмов (грам-положительных и/или грам-отрицательных);

c) спор спорообразующих грам-положительных бактерий.

Использование анаэробных спорообразующих бактерий для валидационных исследований может представлять большие практические трудности.

Жизнеспособные частицы должны быть установлены во время инокуляции. После высушивания инокулята, если это допустимо для конкретного продукта, используется выбранный для него метод выделения микроорганизмов. Отношение полученного титра к титру исходного инокулята дает эффективность регенерации для конкретного метода и продукта.

Микробная инокуляция имеет такие ограничения, как инкрустация, адгезия суспензии, группировка клеток в конгломераты и колебания уровня инокулята, и эти ограничения должны приниматься в расчет при инокуляции продукта.

Инокуляция продуктов из абсорбирующих материалов может совершаться погружением в суспензию выбранных микроорганизмов. Эта процедура может приводить к равномерному распределению микроорганизмов на продукте.

А.5.2.2 Элюент

Элюент не должен способствовать росту или ингибировать рост микроорганизмов, удаляемых с продукта. Чтобы установить такой эффект элюента, небольшое известное количество микроорганизмов должно быть инокулировано в продукт и оставлено в элюенте на время, представляющее худшие условия работы с ним. Тогда метод оценки бионагрузки может быть использован с учетом эффектов ингибирования или способствования росту.

А.5.2.3 Физические методы удаления

Для удаления микроорганизмов из продукта могут быть использованы физические воздействия (А.4.2.4). Должна быть установлена эффективность этого воздействия на оценку бионагрузки с использованием небольшого количества микроорганизмов (около 100 КОЕ). Эффективность определяется путем подсчета микроорганизмов. При этом должны приниматься во внимание возможные эффекты воздействия элюента на выживаемость удаляемых из продукта микроорганизмов (А.5.2.2).

А.5.3 Валидация методов подсчета

А.5.3.1 При валидации методов подсчета нужно учитывать:

a) вид введенных микроорганизмов;

b) число ожидаемых микроорганизмов-контаминантов. Для этого может потребоваться концентрирование или разведение элюента;

c) возможность использования метаболической активности для оценки числа микроорганизмов.

А.5.3.2 Валидация оценки бионагрузки зависит главным образом от следующих факторов:

a) способности выбранных питательных сред поддерживать выявленные микроорганизмы, составляющие бионагрузку;

b) соотношения выбранной температуры и времени инокуляции поддерживающих рост микроорганизмов в выбранной питательной среде.

А.6 Использование методов оценки

А.6.1 Общие положения

При использовании оценки бионагрузки для определения режима стерилизации важное значение имеет точность этой оценки. При текущем контроле процесса производства нужно пользоваться точным методом оценки бионагрузки, чтобы установить изменения до того, как будет достигнут уровень, при котором стерилизация окажется неэффективной.

Для подтверждения адекватности установленного процесса стерилизации на практике необходимо иметь общее представление о бионагрузке, причем оценка ее должна быть аккуратной и точной.

Оценка бионагрузки во время начальной валидации дает основу для обнаружения изменений в процессе эксплуатации. Эта оценка может служить для определения непредвиденных изменений или влияния изменений на производственный процесс или производственную среду. Установление контролируемых пределов процесса и анализ тенденций позволяют своевременно определять изменения бионагрузки.

А.6.2 Пределы контроля

Выбор пределов оценки бионагрузки при контроле основывается на ретроспективном анализе. Данные могут анализироваться на соответствие известному математическому распределению (например, нормальному, распределению Пуассона, биноминальному). Экспериментальные статистические данные могут быть преобразованы и использованы для построения известного математического распределения. Если это успешно сделано, то могут быть вычислены доверительные пределы для оценки. Неправильное преобразование полученных данных к известному математическому распределению может привести к неверному результату.

При невозможности получения известного распределения самый легкий и наиболее распространенный путь установления пределов - это ретроспективный анализ данных и нахождение уровня, ниже которого располагаются 95% числа выживших колоний микроорганизмов (или 90%, или 99%). Периодический обзор принятых пределов, соответствующих требованиям, указан в настоящем стандарте.

А.6.3 Анализ тенденций при контроле

Анализ тенденций проводят для подтверждения того, что процесс изменился, даже если оценки находятся в установленных пределах. Анализ выполняется путем изучения данных, отклоняющихся от обычного случайного распределения оценок.

Допускается применять стандартные принципы статистического контроля [20, 15, 17, 18, 21].

Тенденции изменений в процессе с постепенным увеличением числа подсчитанных микроорганизмов могут маскироваться случайными отклонениями или известными циклическими флуктуациями (например, сезонными колебаниями) и поэтому могут остаться незамеченными.

Очень часто микробиологические данные находятся на удовлетворительном уровне в течение определенного времени, после чего дают явный, обычно короткий пик. Следует контролировать частоту появления этих пиков.