Приложение В (справочное). Руководство по валидации микробиологических методов оценки

Приложение В
(справочное)

Руководство
по валидации микробиологических методов оценки

B.1 Введение

В этом приложении приведены методы, которые могут быть использованы для валидации методов оценки бионагрузки. Могут быть использованы иные подходы.

Для точного применения этих методов необходим соответствующим образом подготовленный и квалифицированный персонал. Необходимо учитывать конфигурацию продукта и ситуации, в которых среди микроорганизмов, составляющих бионагрузку, находятся некоторые контаминанты.

В.2 Валидация методов удаления микроорганизмов из продуктов

Примечание - В этом приложении содержатся два метода валидации процесса удаления микроорганизмов из продукта, которые были введены в А.5.2; в В.2.1 приведен метод повторяющейся обработки (А.5.2.1.1), в В.2.2 - метод инокулированного продукта (А.5.2.1.2).

В.2.1 Валидация с использованием повторяющейся обработки

Примечание - При этом методе для валидации используют фактическую бионагрузку. Иногда этот метод именуется "избыточной регенерацией".

В.2.1.1 Перед началом валидации процесса удаления микроорганизмов из продукта бионагрузка должна быть определена и документирована.

Примечание - В процессе экспериментов принятый метод нельзя заменять другим. Поэтому необходимо провести предварительные эксперименты для поиска и оптимизации метода, который подлежит валидации.

В.2.1.2 Отбирается определенное количество продуктов или частей продуктов, для которых нужно определить коэффициент регенерации. Каждый продукт должен быть испытан (В.2.1.1). Этот метод используется для оценки числа микроорганизмов на продукте.

После определения микробной загрязненности продукта этот же метод может быть использован несколько раз для того же продукта, чтобы определить эффективность отбора.

Примечание - Точное число повторений, которое может быть сделано, зависит от множества факторов, включая природу продукта и микроорганизмов, составляющих бионагрузку, и исходного уровня контаминации. Для определения числа повторений могут быть проведены предварительные эксперименты.

В.2.1.3 Для некоторых продуктов полезно выяснить, остались ли жизнеспособные микроорганизмы на продукте после повторной обработки. Это можно сделать одним из следующих способов:

a) покрытие поверхности продукта расплавленной питательной средой, которая после затвердевания помещается в подходящие условия культивирования (А.4.2.4.9). Образовавшиеся колонии подсчитываются;

b) погружение продукта в жидкую питательную среду с последующим культивированием и исследованием роста. Если после погружения в жидкую питательную среду и культивирования на части продуктов присутствуют живые микроорганизмы, то результаты могут быть использованы для вычисления по методу НВЧ (А.4.2.6.7). Если на всех образцах отмечается рост, метод НВЧ нельзя использовать, и метод валидации должен быть пересмотрен.

В.2.1.4 Число колоний, подсчитанных после первичного применения методов удаления (В.2.1.2), выражают как часть общего числа подсчитываемых колоний.

Примечание - Часть общего числа колоний может быть рассчитана для каждого продукта и использована для определения эффективности отбора. В В.5.2.1.1 приведен рабочий пример.

В.2.2 Валидация с использованием инокулированного продукта

В.2.2.1 Используемый метод валидации должен быть определен и документирован перед началом валидации процесса удаления микроорганизмов из продукта.

Примечание - Важно не менять методы в процессе валидационных экспериментов. Поэтому может оказаться необходимым провести предварительные эксперименты для поиска и оптимизации метода, который подлежит валидации.

В.2.2.2 Должна быть приготовлена суспензия микроорганизмов, используемая для инокуляции продукта, и в ней должны быть подсчитаны жизнеспособные микроорганизмы.

Примечание - Выбор микроорганизмов, используемых для валидации путем инокуляции продукта, рассматривается в А.5.2.1.2. Микроорганизмы, выбранные для инокуляции, должны противостоять воздействию процесса высушивания. Поэтому обычно используются споры аэробных бактерий. Считаются подходящими по своим свойствам споры Bacillus subtilis var. niger; может быть пригодной водная суспензия Bacillus subtilis var. niger, приготовленная в соответствии с ISO 11138-2.

В.2.2.3 Должно быть приготовлено соответствующее разведение этой суспензии и определено количество жизнеспособных микроорганизмов в этом разведении. Инокулят должен иметь ту же концентрацию, что и естественная контаминация продукта. Для образцов с низкой бионагрузкой может быть подходящим объем суспензии с концентрацией, позволяющей расположить на продукте 100 живых микроорганизмов.

Примечание - Может оказаться необходимым проведение предварительных экспериментов (В.2.2.1).

В.2.2.4 Должно быть выбрано некоторое количество стерильных продуктов или их частей. Каждый продукт инокулируется определенным объемом суспензии микроорганизмов (В.2.2.3) и, если это допустимо для конкретного продукта, подвергается сушке в условиях ламинарного потока воздуха.

Примечание - Если образец был простерилизован оксидом этилена, то он должен быть полностью проветрен, чтобы уменьшить влияние каких бы то ни было остатков оксида этилена. Все возможные эффекты ингибирования, вызываемые выделениями веществ из продуктов, должны быть исследованы в предварительных экспериментах (В.2.2.1 и В.4).

Суспензия должна быть распределена в продукте таким образом, чтобы часть продукта, из которой наиболее трудно удалить микроорганизмы в естественном процессе, тоже была включена.

В.2.2.5 Установленные методы (В.2.2) используются для определения числа инокулированных микроорганизмов, удаляемых из продукта.

В.2.2.6 Число удаляемых микроорганизмов выражается как часть числа микроорганизмов, инокулированных в продукт. Такие части могут быть рассчитаны для каждого продукта (В.2.2.4) и использованы для вычисления эффективности отбора. В разделе В.5 приведен конкретный пример.

Примечание - Данные, отклоняющиеся от результатов валидации регенерации процесса отбора, использующей прямую инокуляцию, должны рассматриваться с осторожностью, так как этот метод может неточно имитировать истинную бионагрузку.

В.3 Оценка условий культивирования

Условия культивирования, т.е. питательная среда и условия инкубирования, выбранные для оценки бионагрузки, не могут обеспечить обнаружения всех потенциальных контаминантов. Поэтому на практике неизбежно занижение бионагрузки. Тем не менее решение об условиях культивирования должно быть принято. Эти условия следует определить при валидации метода оценки (7.2).

Рациональное определение условий культивирования базируется на знании процесса производства, производственной среды и материалов и последующем сравнении микроорганизмов, подсчитанных при этих условиях культивирования и альтернативных комбинациях питательной среды и условий инкубирования.

Если при этом подходе получена низкая бионагрузка, то предложенные условия культивирования должны быть пересмотрены с целью оптимизации количества подсчитанных микроорганизмов.

В.4 Проверка выделения веществ, противодействующих оценке бионагрузки

Эта проверка имеет целью изучение воздействия на потенциально чувствительные микроорганизмы веществ, которые могут выделяться в суспензирующую жидкость. Здесь приведен пример подхода, который может быть использован для оценки методов на соответствие 6.2 настоящего стандарта и А.4.2.6.1.

В.4.1 Должны быть выбраны стерилизуемые продукты, и каждый продукт должен быть подвергнут испытанию для определения эффекта удаления микроорганизмов с помощью процессов, которые надлежит использовать в текущей работе. Если в процессе удаления используют элюент, то следует использовать процедуру, описанную в В.4.2. Если продукт непосредственно вводится в питательную среду, то более подходящим является 4.3.

В.4.2 Если в процессе удаления микрооганизмов используется элюент (А.4.2.5), то в него вводится определенное количество потенциально чувствительных микрооганизмов. Число используемых микроорганизмов должно быть приблизительно равным 100. Бактериостатические тесты, в основном, описаны в фармакопеях.

Примечание - В фармакопеях указываются виды используемых микроорганизмов или указывается возможность применения альтернативных микроорганизмов, таких как Pseudomonas fluorescens. Получающаяся в результате суспензия должна выдерживаться в течение периода времени, равного, по крайней мере, максимально допустимому времени, которое применяется для оценки бионагрузки. Затем подсчитывается число живых микроорганизмов.

В.4.3 Если продукт непосредственно вводится в питательную среду (например, оценка по методу НВЧ; А.4.2.6.7), то могут использоваться бактериостатические тесты, описанные в фармакопейных монографиях.

В этих тестах продукт вводится непосредственно в питательную среду и инкубируется в течение указанного времени. Затем малое количество микроорганизмов (В.4.2) вводят в питательную среду, и инкубация продолжается. После указанного периода времени питательная среда исследуется на рост живых микроорганизмов.

В.4.4 Если число инокулированных и число регенерированных микроорганизмов по В.4.2 отличаются значительно или вообще роста микроорганизмов по В.4.3 не отмечается, то техника оценки бионагрузки должна быть пересмотрена. Может оказаться необходимым ввести стадию нейтрализации или фильтрации для удаления ингибирующих веществ (А.4.2.6.1).

В.5 Пример расчетов корректирующих коэффициентов

В.5.1 Введение

Ниже приведены два примера расчета корректирующего коэффициента. Полученные величины необязательно использовать для оценки результатов валидационных экспериментов.

В.5.2 Валидация техники выделения

В.5.2.1 Повторяющаяся обработка

В.5.2.1.1 Идеализированная группа данных приведена в таблице В.1. Данные содержат пять повторностей для медицинских изделий.

Таблица В.1 - Число колоний, определенных для медицинского изделия при повторяющейся обработке в пяти повторностях

Опыты	Число колоний в повторностях					Среднее число колоний
	1	2	3	4	5
1	60	50	70	55	45	56
2	10	12	5	2	3	6,4
3	1	0	2	0	0	0,6
4	0	1	0	0	1	0,4
Покрытие агаром	10	5	7	4	2	5,6
Общее число колоний	81	68	84	61	51	69

В.5.2.1.2 По данным таблицы В.1 эффективность выделения может быть рассчитана следующим образом:

Средняя эффективность выделения микроорганизмов равна 81,8%. Пределы колебаний составляют 74 - 90%.

Примечание - В расчеты включена идеализированная ситуация с использованием метода покрывающего агара. Применению этого метода может препятствовать природа некоторых видов медицинских изделий (В.2.1.3 а).

Первые выделения	60	50	70	55	45
Общие	81	68	84	61	51
Отбор, %	74	74	83	90	88

В.5.2.1.3 Используя среднюю эффективность выделения, получим корректирующий коэффициент

Примечание - В некоторых случаях может быть принято решение использовать меньший предел колебаний, чтобы получить расчет для наихудших условий. Решение будет зависеть от намеченного использования данных.

В.5.2.2 Инокуляция продукта

В.5.2.2.1 Выбран метод инокуляции продукта, так как предварительные эксперименты показали, что бионагрузка была очень мала.

В.5.2.2.2 Была приготовлена суспензия Bacillus subtilis var. niger и было определено число жизнеспособных микроорганизмов с использованием оптимальных условий культивирования.

В.5.2.2.3 Было приготовлено разведение суспензии, в котором 0,1 мл содержит 100 спор. Выбранная часть медицинских изделий была инокулирована этим разведением суспензии и оставлена для высыхания под ламинарным потоком воздуха.

В.5.2.2.4 Из инокулированных продуктов выбранным процессом выделены споры Bacillus subtilis, причем среднее число выделенных спор равнялось 35 с пределами колебаний от 25 до 40.

В.5.2.2.5 Корректирующий коэффициент для эффективности выделения равен:

В.5.3 Оценка бионагрузки

Оценка бионагрузки может быть выполнена умножением предстерилизационного числа на корректирующий коэффициент, вычисленный по В.5.2 настоящего стандарта.