Межгосударственный стандарт ГОСТ 31710-2012 (ISO 8870:2006) "Молоко и продукты на основе молока. Обнаружение термонуклеазы, образуемой коагулазоположительными стафилококками" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1770-ст)

Milk and mik-based products. Detection of themrmoneuclease produced by coagulase-positive staphylococci

Дата введения - 1 июля 2013 г.

Введен впервые

ГАРАНТ:

Курсив в тексте не приводится

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" совместно с ГУ "Ярославская государственная испытательная лаборатория молочного сырья и продукции" на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. N 51)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по MK (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Беларусь Казахстан Кыргызстан Молдова Российская Федерация Таджикистан	BY KZ KG MD RU TJ	Госстандарт Республики Беларусь Госстандарт Республики Казахстан Кыргызстандарт Молдова-Стандарт Росстандарт Таджикстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1770-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31710-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5 Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному стандарту ISO 8870:2006 Milk and mik-based products - Detection of themrmoneuclease produced by coagulase-positive staphylococci (Молоко и продукты на основе молока. Обнаружение термонуклеазы, образуемой коагулазоположительными стафилококками) путем изменения отдельных фраз (слов, значений показателей, ссылок), которые выделены в тексте курсивом.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52832-2007

6 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает качественный метод определения термонуклеазы, образуемой коагулазоположительными стафилококками в молоке и продуктах на основе молока.

Наличие в молоке и продуктах на основе молока термонуклеазы может использоваться как индикатор достижения роста стафилококков опасного уровня и может отражать вероятное присутствие стафилококкового энтеротоксина.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ ISO 7218-11 Микробиология продуктов питания и кормовых продуктов. Общие правила микробиологических исследований

ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1 термонуклеаза (thermonuclease): Фермент, образуемый коагулазоположительными стафилококками, гидролизирующий дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) при условиях, описанных в настоящем стандарте.

4 Сущность метода

Метод основан на расщеплении ДНК термонуклеазой, при котором цвет агара изменяется с синего на розовый. Цветная реакция обусловлена метахроматическими свойствами толуидинового синего О.

5 Подготовка к испытанию

5.1 Основные материалы

Для текущей лабораторной практики см. ГОСТ 9225.

Используют реактивы только аналитического качества, если не оговорено иначе, и только дистиллированную или деминерализованную воду, или воду аналогичной чистоты.

Если приготовленные среды и реактивы не используют немедленно, их хранят, если не оговорено иначе, в защищенном от света месте при температуре от 0°С до 5°С не более 1 мес в условиях, предотвращающих любые изменения в их составе.

5.2 Толуидиновый синий О-ДНК агар

5.2.1 Трис-буфер

5.2.1.1 Состав:

трис(гидроксиметил)аминометан () - 6,06 г;

хлорид кальция () - 0,11 г;

вода - 1000 .

5.2.1.2 Приготовление

Растворяют трис(гидроксиметил)аминометан и хлорид кальция в 980  воды. Доводят рН до 9,0 и воду до 1000 .

5.2.2 Основа среды

5.2.2.1 Состав:

дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) - 0,3 г;

хлорид натрия (NaCI) - 10,0 г;

агар - 10,0 г;

трис-буфер (см. 5.2.1) - 1000 

5.2.2.2 Приготовление

Компоненты нагревают на водяной бане (см. 6.2) до полного растворения ДНК и агара (около 1,5 ч).

5.2.3 Раствор толуидинового синего О

5.2.3.1 Состав:

толуидиновый синий О ()* - 0,31 г;

вода - 10 .

5.2.3.2 Приготовление

Толуидиновый синий О растворяют в воде при слабом нагревании и фильтруют через марлю (см. 6.12).

5.2.4 Полная среда

5.2.4.1 Состав:

основа среды (см. 5.2.2) - 1000 ;

раствор толуидинового синего О (см. 5.2.3) - 3 .

5.2.4.2 Приготовление

Основу среды охлаждают до (501)°С, добавляют профильтрованный раствор толуидинового синего О и перемешивают.

Полная среда может храниться маленькими порциями в закупоренных колбах или бутылях несколько месяцев в защищенном от света месте при температуре от 0°С до 5°С.

5.2.5 Приготовление чашек со средой

В чашки Петри (см. 6.8) вносят по 13  свежей полной среды (см. 5.2.4) или хранившейся среды, предварительно расплавленной при (501)°С. Дают агару застыть.

Приготовленные среды могут храниться не более 2 мес (дном кверху и защищенными от высыхания) в защищенном от света месте при температуре от 0°С до 5°С.

5.3 Соляная кислота, c(HCL) = 2 .

5.4 Гидроокись натрия, c(NaOH) = 2 .

5.5 Трихлоруксусная кислота, с() = 3 .

Растворяют 49,02 г трихлоруксусной кислоты в 100  воды.

5.6 Обезжиренное сухое молоко

Обезжиренное сухое молоко должно быть свободно от термонуклеазы. Наличие термонуклеазы проверяют в каждой новой партии, используя метод, приведенный в настоящем стандарте.

5.7 Бульон на основе сердечно-мозгового перевара (BHI бульон)

5.7.1 Состав:

ферментативный перевар животных тканей - 10,0 г;

обезвоженный перевар телячьего мозга - 12,5 г;

обезвоженный перевар бычьего сердца - 5,0 г;

глюкоза - 2,0 г;

хлорид натрия - 5,0 г;

моногидрофосфат натрия, безводный () - 2,5 г;

вода - 1000 .

5.7.2 Приготовление

Растворяют компоненты среды или готовую дегидратированную питательную среду в воде, при необходимости подогревают. Устанавливают такой уровень рН, чтобы после стерилизации он соответствовал 7,40,2 при температуре 25°С.

Среду разливают по 5  в пробирки (см. 6.11).

Среду стерилизуют при (1211)°С в течение 15 мин.

5.8 Тест-микроб (положительный контроль)

В качестве положительного контроля используют любой штамм Staphylococcus aureus, образующий термонуклеазу.

6 Оборудование и лабораторная посуда

Используют оборудование, необходимое для подготовки проб согласно ГОСТ ISO 7218, обычное лабораторное оборудование, а также следующее:

6.1 Термостат, поддерживающий температуру (371)°С.

6.2 Водяная баня, поддерживающая температуру (501)°С, а также температуру кипячения (для разогрева и охлаждения питательных сред и реактивов до необходимой температуры).

6.3 Центрифуга с частотой вращения более 27 000 .

6.4 Центрифуга с частотой вращения более 2 800 .

6.5 Металлический цилиндрический пробойник диаметром около 2 мм для прорезания лунок в толуидиновом синем О-ДНК агаре.

6.6 Микропипетки емкостью 0,01 .

6.7 Бактериологические петли из проволоки платино-иридиевого или никельхромового сплава диаметром около 3 мм.

6.8 Чашки Петри, стеклянные или пластиковые, диаметром 90 и 100 мм.

6.9 Мерные цилиндры вместимостью 10, 100 и 1000 .

6.10 Бутыли с пробками для хранения толуидинового синего О-ДНК агара.

6.11 Пробирки диаметром 15 мм и длиной 100 мм.

6.12 Марля.

При одинаковой спецификации одноразовое оборудование предпочтительнее многоразового.

Стеклянная лабораторная посуда должна выдерживать повторные циклы стерилизации и быть химически инертной.

7 Отбор проб

Отбор проб не является частью метода, приведенного в настоящем стандарте. Рекомендуемым методом отбора проб является метод, приведенный в ГОСТ 26809.

Образцы хранят в условиях, предотвращающих их порчу и любые изменения в составе.

8 Проведение испытания

Величину рН молока, восстановленного сухого молока или гомогенизированных продуктов на основе молока после добавки обезжиренного сухого молока доводят до 3,8 и центрифугируют. Супернатант осаждают трихлоруксусной кислотой. Центрифугируют, рН осадка доводят до рН 8,5 и добавляют трис-буфер. Раствор прогревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин и определяют наличие термонуклеазной активности на толуидиновом синем О-ДНК агаре.

8.1 Подготовка образцов

8.1.1 Молоко

рН пробы молока объемом 100  доводят соляной кислотой (см. 5.3) до 3,8.

8.1.2 Продукты на основе молока

Суспензируют 20 г образца и 5 г обезжиренного сухого молока (см. 5.6) в 50  воды. рН пробы доводят соляной кислотой (см. 5.3) до 3,8.

Добавление обезжиренного сухого молока не является обязательным для всех продуктов на основе молока. При исследовании, например, сухого обезжиренного молока, цельного сухого молока или казеинов его можно не добавлять. Добавление обязательно в случае сухой сыворотки, йогурта, фруктового йогурта и фруктового мороженого. Для остальных продуктов на основе молока добавление обезжиренного сухого молока также рекомендуется.

Для испытания сыра можно использовать альтернативную процедуру. Суспензируют с помощью блендера 20 г сыра в 100  теплой (45°С) воды. После смешивания рН пробы доводят соляной кислотой (6 моль/л) до 4,5. Суспензию переносят в плоскодонную колбу объемом 750 . Добавляют воды до конечного объема, в 12,5 раза большего массы сыра. Суспензию встряхивают в течение ночи (16 ч) на водяной бане при температуре (251)°С. Снова доводят рН до 4,5. Суспензию центрифугируют и фильтруют. Отбирают 100  фильтрата и проводят испытание согласно 8.1.3.

Если сухое обезжиренное молоко не добавляется, суспензируют 20 г в 40  воды. рН пробы доводят соляной кислотой (см. 5.3) до 3,8.

8.1.3 Общий ход испытания

8.1.3.1 Центрифугируют (см. 6.3) пробу с частотой вращения от 27000  до 34000  при 5°С в течение 20 мин.

8.1.3.2 Супернатант декантируют. Добавляют 0,05  холодной трихлорацетоуксусной кислоты (см. 5.5) на 1  пробы и смешивают.

8.1.3.3 Центрифугируют с частотой вращения от 27000  до 34000  при 5°С в течение 20 мин.

8.1.3.4 Осадок растворяют в 1  трис-буфера (см. 5.2.1). рН доводят до 8,5 с помощью гидроокиси натрия (см. 5.4). Раствор разводят трис-буфером до 2 , перемешивают.

8.1.3.5 Раствор прогревают в кипящей водной бане (см. 6.2) в течение 15 мин.

8.2 Приготовление тест-культуры (положительный контроль)

8.2.1 Тест-культуру (см. 5.8) засевают в бульон BHI (см. 5.7). Инкубируют 24 ч при (371)°С. Центрифугируют (см. 6.4) с частотой вращения от 2800  до 3500  в течение 15 мин. Надосадочную жидкость декантируют.

8.2.2 Супернатант прогревают на кипящей водяной бане (см. 6.2) в течение 15 мин. Прогретый супернатант может храниться при температуре 5°С не более четырех недель.

При необходимости любой штамм Staphylococcus aureus (например, выделенный из молока или продуктов на основе молока) может быть исследован на наличие термонуклеазы методом, приведенным выше для тест-культуры.

8.3 Приготовление толуидинового синего О-ДНК агара

Цилиндрическим пробойником (см. 6.5) в агаре (см. 5.2.5) прорезают две лунки. Агар поверхностью вниз подсушивают в термостате (см. 6.1) со снятой крышкой и в течение 60 мин при температуре (371)°С.

При испытании нескольких образцов в одном агаре прорезают до 10 лунок.

8.4 Определение термонуклеазы

8.4.1 В одну из лунок вносят 10  положительного контроля (см. 8.2.2), в остальные - по 10  проб (см. 8.1.3.5).

8.4.2 Чашки Петри с крышками сверху инкубируют (см. 6.1) 4 ч при температуре (371)°С. При отрицательном результате чашки инкубируют до 24 ч.

9 Обработка результатов

Розовое гало (ореол или зона свечения) диаметром более 1 мм вокруг лунки свидетельствует о наличии термонуклеазы (необходимо сравнить с положительным контролем). Гало любого иного цвета, кроме розового, не считается признаком термонуклеазной активности.

Положительный тест на термонуклеазу указывает на рост коагулазоположительных стафилококков в количестве до КОЕ/г и более, что приводит к образованию энтеротоксина.

Такое количество коагулазоположительных стафиллококков# может выработать энтеротоксин в концентрации, достаточной для развития заболевания. Молоко и продукты на основе молока, в которых при использовании настоящего метода испытаний выявлена термонуклеаза, образуемая коагулазоположительными стафилококками, в обязательном порядке подлежат проверке на наличие энтеротоксина.

10 Протокол испытания

В протоколе испытания указывают:

- всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;

- метод отбора проб;

- использованный метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт]

- все детали исследования, не оговариваемые в настоящем стандарте, или рассматриваемые как необязательные, а также детали иного свойства, могущие оказать влияние на результаты исследований;

- полученные результаты и повторяемость (если определялась), окончательный уточненный результат испытания.

____________________

* Толуидиновый синий О (цветовой индекс: C.I. основной синий 17; C.I. No. 52040).