Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 15163-2014 "Молоко и молочные продукты. Сычужный фермент из сычугов телят и ферментный препарат из сычугов крупного рогатого скота. Определение содержания химозина и говяжьего пепсина методом хроматографии" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 июля 2014 г. N 718-ст)

Milk and milk products. Calf rennet and adult bovine rennet. Determination of chymosin and bovine pepsin contents by chromatography

Дата введения - 1 января 2016 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" на основе собственного аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 5

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 мая 2014 г. N 67-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Молдова	MD	Молдова-Стандарт
Россия	RU	Росстандарт
Таджикистан	TJ	Таджикстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 июля 2014 г. N 718-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 15163-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2016 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 15163:2012 Milk and milk products - Calf rennet and adult bovine rennet - Determination by chromatography of chymosin and bovine pepsin contents (Молоко и молочные продукты. Сычужный фермент из желудка телят и взрослых коров. Определение содержания химозина и говяжьего пепсина методом хроматографии).

Международный стандарт разработан подкомитетом SC 5 "Молоко и молочные продукты" Технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO) и Международной федерацией по молочному животноводству (IDF).

Перевод с английского языка (en).

Официальный экземпляр международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, имеется в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации.

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам приведены в дополнительном приложении ДА.

Степень соответствия - идентичная (IDT)

6 Введен впервые

Введение

Препараты на основе сычужного фермента из сычугов телят и взрослых животных (КРС) содержат в разных количествах в качестве основных молокосвертывающих ферментов: химозин и говяжий пепсин. Доля химозина по отношению к пепсину в сычуге (четвертый отдел желудка жвачных) с возрастом и отлучением теленка от молока матери уменьшается.

Соотношение сычугов молодняка к сычугам взрослых животных в сырье для производства фермента сильно влияет на соотношение химозина и пепсина в конечном сычужном ферменте. Чем больше доля сычугов молодых вскормленных молоком телят, тем выше доля химозина в сычужном ферменте и наоборот [5], [6].

Как химозин, так и пепсин характеризуются различной молокосвертывающей активностью и пригодностью для производства сыров. Молокосвертывающая активность пепсина, например, намного больше зависит от показателя рН, чем активность химозина, кроме того, пепсин также имеет более общую протеолитическую активность, чем химозин.

Поэтому важно проанализировать содержание химозина и пепсина в дополнение к концентрации (общей молокосвертывающей активности) сычужного фермента [6], [7].

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения количества химозина и говяжьего пепсина в пробе ферментных препаратов из сычугов телят и крупного рогатого скота. Кроме того, стандарт может применяться при приготовлении молокосвертывающих ферментных препаратов на основе сычужного фермента телят и смеси ферментов, полученных в процессе ферментации сычугов взрослых особей крупного рогатого скота.

2 Нормативные ссылки

Следующие ссылочные нормативные документы являются обязательными при применении данного документа. Для датированных ссылок применяется только цитированное издание документа. Для недатированных ссылок необходимо использовать самое последнее издание нормативного ссылочного документа (включая любые изменения).

ISO 11815|IDF 157:2007 Milk - Determination of total milk-clotting activity of bovine rennets (Молоко. Определение общей молокосвертывающей активности говяжьего ферментного препарата)

3 Принцип

На первом этапе пробу сычужного фермента обессоливают, а химозин и говяжий пепсин разделяют на анионообменной колонке [8], [9]. На втором этапе определяют молокосвертывающую активность каждого из двух разделенных ферментов в соответствии с ISO 11815|IDF 157 (восстановленного молока с рН 6,5). Ферментативный состав пробы сычужного фермента выражают в процентах активности химозина и пепсина от суммы активностей обоих компонентов в соответствии с Международными молокосвертывающими единицами (ММЕ), или результаты выражают в миллиграммах на 1 активного химозина и миллиграммах на 1 активного пепсина.

Общая молокосвертывающая активность первой партии контрольного сычужного фермента из сычугов телят и первой партии контрольного сухого ферментного препарата от взрослых животных была установлена на уровне 1000 ММЕ/г. Будущие контрольные стандартные пробы должны быть установлены относительно предыдущих стандартных проб (см. ISO 11815|IDF 157).

В настоящем стандарте приведено описание ручных средств для проведения анионообменной хроматографии, а также автоматизированных средств.

Это контрольный метод, поэтому изменения могут быть сделаны только при получении такого же результата, а повторяемость и воспроизводимость будет соответствовать исходному контрольному методу. Любые изменения установленного в настоящем стандарте метода должны быть указаны в протоколе испытаний (см. раздел 10).

4 Реактивы

Если не указано иное, используют реактивы только установленной аналитической чистоты и дистиллированную или деминерализованную воду, или воду эквивалентной чистоты.

4.1 Смола, EMD DEAE (М) (Merck cat. no. 1.16883)*(1) или Mono 1  предварительно упакованной колонки (HR 5/5 или 5/50 GL от GE Healthcare)*(2) или эквивалентная смола.

Примечания

1 EMD DEAE (М) - подходящая смола для ручного ввода проб, a Mono подходит для автоматического ввода.

2 Если смолу или Mono заменить другой смолой, то скорее всего появится необходимость заменить и буферные растворы по 4.12, что приведет к необходимости повторной оценки метода.

4.2 Пиперазина гексагидрат ().

4.3 Хлорид натрия (NaCI).

4.4 Тимол, необязательный консервант.

4.5 Гидроксид натрия (NaOH).

4.6 Раствор соляной кислоты, c (HCI) = 1 .

4.7 Этанол (), с объемной долей не менее 96%.

4.8 Этанол (), с объемной долей не менее 20%.

Добавляют 105  96%-ного этанола (4.7) к 400  воды и перемешивают. Если требуется стерильная фильтрация, воду до перемешивания с этанолом фильтруют.

4.9 Мочевина, c () = 8

Растворяют 48 г мочевины в воде и доводят до общего объема 100 .

4.10 Система трубок для диализа, диаметром около 1 см (Union Carbide)*(3) или эквивалентного (необязательно).

Примечание - Качество системы трубок для диализа не является решающим.

4.11 Колонки для обессоливания, Bio-Rad-Econopac 10DG (cat. no. 732-2010)*(4) или эквивалентные (необязательно).

Используют или систему трубок для диализа (4.10), или колонки для обессоливания сычужного фермента.

4.12 Буферные растворы

4.12.1 Буферный раствор I, пиперазин , с = 0,025

В лабораторный стакан отвешивают 4,85 г пиперазина (4.2) и 42,8 г раствора соляной кислоты (4.6) и перемешивают. Содержимое стакана количественно переносят в мерную колбу с одной меткой вместимостью 1000  (5.5), доводят водой до метки и перемешивают. Активная кислотность раствора должна быть (5,300,05) ед. рН. При необходимости ее регулируют пиперазином или соляной кислотой. Перед использованием дегазируют и консервируют буферный раствор по 4.12.5.

4.12.2 Буферный раствор II, c (NaCI) = 0,25

В мерную колбу с одной меткой вместимостью 1000  (5.5) помещают 14,6 г NaCI. Добавляют буферный раствор I (4.12.1) до метки и перемешивают. Активную кислотность (рН) не регулируют. Буферный раствор II используется только для ручного метода. Перед использованием буферный раствор дегазируют и консервируют по 4.12.5.

4.12.3 Буферный раствор III, c (NaCI) = 0,50

В мерную колбу с одной меткой вместимостью 1000  (5.5) помещают 29,2 г NaCI. Добавляют буферный раствор I (4.12.1) до метки и перемешивают. Активную кислотность (рН) не регулируют. Буферный раствор III используется только для ручного метода. Перед использованием дегазируют и консервируют буферный раствор по 4.12.5.

4.12.4 Буферный раствор IV, c (NaCI) = 1,0

В мерную колбу с одной меткой вместимостью 1000  (5.5) помещают 58,4 г NaCI. Добавляют буферный раствор I (4.12.1) до метки и перемешивают. Активную кислотность (рН) не регулируют. Буферный раствор III используется только для ручного метода. Перед использованием дегазируют и консервируют буферный раствор по 4.12.5.

4.12.5 Дегазация и консервация

Перед использованием буферные растворы от I до IV (4.12.1 - 4.12.4) дегазируют в вакууме или используют ультразвуковую водяную баню. Консервируют буферные растворы от I до IV для ручного метода, добавляя несколько кристаллов тимола, а для автоматического метода применяют стерильную фильтрацию, используя фильтр размером 0,2 мкм.

Буферные растворы с I до IV хранят не менее пяти дней при комнатной температуре или в течение двух месяцев в холодильнике.

5 Оборудование и химическая посуда

5.1 Многоканальный перистальтический насос или другой подходящий насос (только для ручного ввода).

5.2 рН-метр, пределы допускаемого значения основной (абсолютной) погрешности не более 0,01 ед. рН.

5.3 Хроматографическая колонка, диаметром 1,0 см и длиной 10 см, с адаптером потока в одном направлении или эквивалентная колонка, подходящая для слоя геля высотой 5 см (только для ручного ввода).

5.4 Магнитная мешалка.

5.5 Мерные колбы с одной меткой, нужной вместимости по [2].

5.6 *(5), *(6) или HPLC оборудование, пригодное для поставленной цели, используется только для автоматического ввода.

5.7 Лабораторное оборудование, для определения времени свертывания (см. IS011815|IDF 157).

6 Отбор проб

Отбор проб не является частью метода, рассматриваемого в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора проб приводится в [1].

Примечание - Отбор проб жидкого ферментного препарата установлен в [1], разделе 9, а порошкового (сухого) ферментного препарата - разделе 13.

Репрезентативную пробу следует направить в лабораторию. Проба не должна быть повреждена или изменена при транспортировании или хранении.

Примечание - Порошковые продукты могут легко разделяться.

Пробы хранят в темном месте при температуре от 0°С до 5°С.

7 Методика

7.1 Проверка

Перед проведением анализа проверяют ферментный препарат на отсутствие основных молокосвертывающих ферментов не животного происхождения, используя подходящий метод (см. приложение А). Проверку можно не проводить, если известно, что фермент содержит химозин и пепсин только животного происхождения.

7.2 Подготовка чистой колонки со смолой Fractogel

Готовую к использованию суспензию смолы Fractogel (4.1) после дегазации в вакууме разливают непосредственно из бутыли поставщика или, используя ультразвуковую водяную баню, заполняют ею колонку (5.3), установленную вертикально, с открытым выпуском, пока слой осажденной смолы Fractogel не достигнет высоты от 4,5 до 5,5 см. Во время проведения процедуры гелевая основа не должна быть сухой.

Закрывают выпускную трубку. Погружают конец впускного отверстия трубки перистальтического насоса в лабораторный стакан с буферным раствором I (4.12.1). Подсоединяют трубку адаптера к отводной трубке насоса. Регулируют скорость потока до (1,30,1) . Заполняют трубку адаптера буферным раствором I (4.12.1), не превышая общий внутренний объем трубок 1,5 .

Закрывают колонку адаптером, как указано изготовителем колонки. Сжимают адаптером несколько миллиметров гелевой основы, чтобы ликвидировать свободное пространство над ней. Следует предупредить попадание пузырьков воздуха в колонку. Промывают колонку буферным раствором I (4.12.1) в течение 5 мин при скорости потока 1,3 .

7.3 Регенерация и уравновешивание смолы Fractogel в колонке

После подготовки новой колонки и после каждого цикла проводят регенерацию и приведение в равновесие смолы Fractogel (4.1) в колонке следующим способом.

Регенерируют смолу Fractogel в колонке, используя не менее 15  буферного раствора IV (4.12.4), подавая его в течение 11 - 12 мин со скоростью потока 1,3 . Колонку приводят в равновесие, используя не менее 40  буферного раствора I (4.12.1), подавая его в течение 30 мин. После этого колонка готова для загрузки пробы для анализа.

Одну и ту же колонку можно использовать более 20 раз. После частого использования колонку очищают более тщательно, промывая ее раствором NaOH молярной концентрации 0,1 в течение 10 мин, а затем водой в течение 10 мин. Затем проводят обычную процедуру регенерации и приведения в равновесие, как описано выше.

7.4 Хранение колонки со смолой Fractogel

Если колонка должна храниться более одной недели, ее промывают 15  20%-ного этанола (4.8) с помощью перистальтического насоса (5.1). Хранят колонку с плотно закрытыми впускными и выпускными каналами.

Колонку можно хранить несколько месяцев при комнатной температуре, стараясь избегать попадания прямого солнечного света.

7.5 Приготовление пробы для испытания

7.5.1 Общие требования

Жидкие пробы ферментных препаратов анализируют после подготовки по 7.5.2.

Пробу порошковых ферментных препаратов готовят следующим образом. Сухие пробы перед обессоливанием растворяют в подходящем количестве буферного раствора I (4.12.1) или с использованием буферного раствора с рН 5,5 (см. IS011815|IDF 157), чтобы получить раствор с общей молокосвертывающей активностью 200 .

Перед обессоливанием определяют время свертывания растворенной пробы фермента в соответствии с ISO 11815|IDF 157. Проводят приблизительную оценку активности пробы, выраженную в , устанавливая ее относительно эталона сычужного фермента, чтобы определить количество пробы на колонку (7.6.1 или 7.6.2).

Если результаты выражаются в миллиграммах на , при определении времени свертывания пробы сычужного фермента проводят два параллельных определения в соответствии с ISO 11815|IDF 157. В этом случае измеряют время свертывания одновременно или в быстрой последовательности до и после обессоливания.

Перед внесением пробы для анализа в колонку ее обессоливают путем диализа (7.5.2) или гель-фильтрации (7.5.3).

7.5.2 Обессоливание путем диализа

Диализную трубку (4.10) погружают в кипящую воду на 5 мин и промывают ее внутри и снаружи водой.

Диализ 5  приготовленной анализируемой пробы (7.5) (активностью около 900 ММЕ) по отношению к 500  буферного раствора I (4.12.1) проводят при температуре 4°С в течение от 5 до 20 ч. Диализную трубку очень крепко сжимают рукой, чтобы перекрыть ее в целях сокращения разбавления, которое происходит во время диализа. Во время диализа буферный раствор перемешивают магнитной мешалкой (5.4).

Если результаты выражаются в миллиграммах на , при определении времени свертывания пробы сычужного фермента, подвергнутой диализу, проводят два параллельных определения в соответствии с ISO 11815|IDF 157.

7.5.3 Обессоливание путем гель-фильтрации

Следуют инструкциям поставщика.

Колонку обессоливания (4.11) уравновешивают буферным раствором I (4.12.1). На колонку используют 3,3  приготовленной пробы (7.5). Элюируют пробу буферным раствором I (4.12.1) объемом 4,0 .

Для проб с низким содержанием химозина или пепсина иногда необходимо выполнить вышеуказанную процедуру дважды, чтобы получить достаточную активность фермента и иметь возможность адекватно определить низкое содержание компонента.

Если результаты выражаются в миллиграммах на , при определении времени свертывания пробы сычужного фермента путем гель-фильтрации проводят два параллельных определения в соответствии с ISO 11815|IDF 157.

7.5.4 Срок службы колонки

Чтобы продлить срок службы колонок и избежать закупоривания, рекомендуется выполнять регулярную очистку обессоливающих колонок.

После каждого дня использования всю колонку промывают чистой водопроводной или дистиллированной водой. В колонку вводят 5  раствора мочевины молярной концентрации 8 и затем сливают. Промывают колонку один раз водопроводной водой и уравновешивают, пропуская через колонку полный объем резервуара с буферным раствором I (4.12.1).

Хранят уравновешенные колонки в прохладном месте с небольшим количеством буферного раствора над поверхностью геля. При длительном хранении рекомендуется хранить колонку в буферном растворе или дистиллированной воде с добавлением консервантов (см. инструкцию поставщика). При соблюдении этой процедуры можно использовать каждую колонку до двух лет или пока значительно не снизится скорость потока.

7.6 Анализ обессоленного сычужного фермента

7.6.1 Разделение химозина и пепсина в обычной колонке. Ручной ввод

После приведения колонок в равновесие в соответствии с 7.3 с помощью насоса (5.1) в колонку вводят определенное количество обессоленной пробы для анализа (7.5.2 или 7.5.3), погружая конец входной трубки насоса в трубку с пробой. Устанавливают скорость потока 1,3 .

Количество пробы должно быть достаточным, чтобы после разделения время свертывания наиболее слабой фракции составляло от 350 с до 550 с и чтобы можно было обнаружить активность в промежуточной фракции или в элюате после второй фракции. В большинстве случаев объем пробы после обессоливания составляет от 3 до 5 . При этом общая молокосвертывающая активность на колонку не должна превышать 900 ММЕ. Если результаты выражаются в миллиграммах на , необходимо точно знать объем пробы, добавляемый в колонку. Этого не требуется, если результаты выражаются только в процентах.

Когда проба почти полностью введена во входную трубку, промывают трубку для анализа буферным раствором II объемом 1  (4.12.2). Следует избегать попадания пузырьков воздуха в трубку. Повторяют промывание после того, как первый раствор для промывки введен во входную трубку.

Погружают конец входной трубки в стакан, содержащий не менее 50  буферного раствора II (4.12.2). Собирают первую фракцию элюата в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50  (5.5). Собирают точно до метки 50  или до объема 47 . В последнем случае объем доводят до метки буферным раствором II (4.12.2).

Затем собирают пробу в количестве 3  в небольшой стакан, которую обозначают как промежуточную фракцию.

Далее погружают конец входной трубки перистальтического насоса (5.1) в стакан, содержащий не менее 50  буферного раствора III (4.12.3). Собирают вторую элюированную фракцию в другую мерную колбу с одной меткой вместимостью 50  (5.5). Собирают точно до метки 50  или до объема 47 . В последнем случае объем доводят до метки буферным раствором III (4.12.2).

Затем собирают пробу в количестве 3  в небольшой стакан, которую обозначают как вторичную фракцию.

Примечание - Первая злюированная фракция содержит химозин. Промежуточную фракцию используют для проверки правильности разделения двух ферментов. Вторая злюированная фракция содержит говяжий пепсин. Используя вторичную фракцию, проверяют полноту извлечения пепсина.

Если известно, что проба содержит очень малое количество химозина или пепсина, элюированные фракции 1 и 2 можно собрать в небольшие мерные колбы, например вместимостью 25 .

7.6.2 Разделение химозина и пепсина на оборудовании для . Автоматический ввод

7.6.2.1 Следуют общим инструкциям к оборудованию (5.6) и колонке Mono Q (4.1), используя только буферные растворы I (4.12.1) и IV (4.12.4).

Составляют программу проведения анализа. Проверяют правильность разделения и соответствие полученных результатов ручному контрольному методу. При автоматическом вводе хроматограмма дана с уменьшением на коэффициенте, то есть собирают 10  фракции вместо 50 , отбираемых ручным способом. Кроме того, нет необходимости собирать промежуточную фракцию, потому что хроматограмма показывает, разделены ли химозин и пепсин полностью на фракции с одним ферментом в каждой.

Если колонка не использовалась в течение последних 24 ч, проводят "слепой" опыт, используя буферный раствор I (4.12.1) в качестве пробы для анализа.

7.6.2.2 При объеме пробы 0,5 или 1,0  следуют указанным рекомендациям по программе испытаний.

a) Начинают со 100%-ного буферного раствора I (4.12.1) при скорости потока 2  и регистрируют его на длине волны 280 нм. Вводят пробу объемом 0,500  или 1,000 , которая была предварительно введена в петлю, в колонку.

b) После элюирования 0,60  буферного раствора I (4.12.1) начинают собирать фракцию 1 (фракция химозина).

c) После элюирования 1,50  буферного раствора I его заменяют на буферную смесь, состоящую из 80% буферного раствора I (4.12.1) и 20% буферного раствора IV (4.12.4) для элюирования фракции химозина.

d) После элюирования смеси, состоящей из соответственно 10,60  буферного раствора I и буферного раствора IV, останавливают сбор фракции 1 (объем 10 ) и для элюирования и сбора фракции 2 (фракция пепсина) заменяют смесь буферов I и IV на смесь, состоящую из 50% буферного раствора I (4.12.1) и 50% буферного раствора IV (4.12.4).

e) После элюирования 20,60  буферной смеси останавливают сбор фракции 2 (объем 10 ) и для промывания колонки заменяют смесь из 50% буфера I и IV на 100%-ный буферный раствор IV (4.12.4).

f) После элюирования 25,60  буферной смеси для уравновешивания колонки заменяют полностью буферный раствор IV на буферный раствор I (4.12.1).

g) После элюирования 32,60  буферного раствора I завершают программу.

7.6.2.3 Хроматографию пробы проводят следующим образом.

Предварительно вводят обессоленный ферментный препарат в петлю объемом 0,500 или 1,000  с молокосвертывающей активностью не более 180 ММЕ. Начинают проведение хроматографии и собирают две фракции. Определяют время свертывания первой и второй фракций в соответствии c ISO 11815|IDF 157.

Если известно, что образец содержит очень небольшое количество химозина (фермент из сычуга телят) или пепсина (фермента из сычугов крупного рогатого скота), размер фракции может быть изменен на 5 , так как небольшое количество одного из ферментов элюируется в первые 5  фракции, которые могут быть проверены на хроматограмме. Если весь фермент элюируется в первые 5  фракции, то активность измеряют только в этой фракции и расчет корректируют путем деления молокосвертывающей активности на два. При этом время свертывания остальных 5  фракции должно быть не более 1800 с.

В целом рекомендуется вводить пробу известного состава через равные промежутки времени, в частности, при использовании автоматизированного метода.

Регулируют программу, если разделение фракции химозина и пепсина не является полным.

7.7 Определение времени свертывания

Тщательно перемешивают содержимое каждой фракции, полученной в соответствии с 7.6.1 или 7.6.2 до отбора пробы для анализа. Проводят необходимые разведения буферным раствором II (4.12.2) для первой фракции и буферным раствором III (4.12.3) для второй фракции.

Определяют время свертывания первой и второй элюированных фракций в соответствии с ISO 11815|IDF 157 с учетом следующего.

Определяют первую фракцию вместе с контрольным рабочим раствором сычужного фермента и вторую фракцию вместе с контрольным рабочим раствором говяжьего пепсина. Определяют время свертывания дважды в быстрой последовательности для каждой пары контрольных рабочих растворов и фракции, используя среднее время для вычислений.

Для анализа молока на свертываемость в соответствии с ISO 11815|IDF 157, при необходимости, допускается пятикратно увеличивать объем пробы, чтобы получить время свертывания в пределах от 350 до 550 с.

При этих условиях разводят соответствующий эталонный рабочий раствор сычужного фермента тем же буфером, который использовался для элюирования конкретной фракции, чтобы сохранить те же условия коагуляции для пробы и эталонного рабочего раствора сычужного фермента. Если требуется в три раза больший объем пробы (1,5  вместо 0,5 ), то для испытания молока на свертываемость следует использовать в три раза больший объем эталонного рабочего раствора фермента (1,5  вместо 0,5 ) (см. ISO 11815|IDF 157, 9.5.1).

Для фракций пробы с очень низким уровнем химозина или пепсина допускается время свертывания более 550 с только после увеличения в пять раз объема пробы на испытание.

Определяют время свертывания промежуточной и конечной фракций путем добавления пятикратного объема пробы (2,5  на 25  молока). Время свертывания должно быть более 1800 с, меньшее время показывает, что разделение было неудовлетворительным.

Выполняют все анализы как можно быстрее после разделения химозина и пепсина из-за вероятности денатурации ферментов в разбавленных растворах.

8 Вычисление и представление результатов

8.1 Вычисление активности химозина и пепсина, выражаемой в процентах

Активность химозина и говяжьего пепсина, выраженную в международных единицах свертываемости , как указано в ISO 11815|IDF 157, можно пересчитать на активность химозина , %, и говяжьего пепсина , %, используя формулы соответственно

,

(1)

,

(2)

где - содержание химозина, выраженное в ;

- содержание пепсина, выраженное в .

8.2 Вычисление активности химозина и говяжьего пепсина, в миллиграммах на

Концентрацию активного химозина и говяжьего пепсина выражают в миллиграммах на , если для приготовления субстрата используется стандартный молочный порошок. Коэффициенты , , и для стандартного молочного порошка предоставлены поставщиком (Cecalait)*(7). Концентрацию (или или ) химозина или говяжьего пепсина в ферментном препарате, , вычисляют по формуле

,

(3)

где (или , или ) - коэффициент, применяемый для вычисления концентрации активного химозина или говяжьего пепсина, ;

(или , или ) - время свертывания, полученное с использованием 0,5  фракции 1, с;

- поправочный коэффициент или для времени задержки коагуляции, с;

- объем обессоленного препарата, используемого для анализа (7.6), ;

V - объем собранной фракции (V = 50 ), ;

d - коэффициент разбавления или концентрации анализируемой фракции (например, d = 3, когда 1  фракции был разбавлен 2  буфера для проведения испытания на свертываемость, и d = 0,25, когда вместо 0,5  использовались 2  для 25  молока при испытании на свертываемость);

- время свертывания, полученное с разбавленным ферментным препаратом (7.5), с;

- время свертывания, полученное с обессоленным ферментным препаратом в том же разбавлении (7.5.2 или 7.5.3), с.

Для конкретного порошкового молока и конкретного ферментного препарата поправочный коэффициент f получают путем построения графика времени свертывания относительно (см. пример). В соответствии с формулой Хольтера t = f + b/с, где f - это экстраполированное значение f для b/с = 0. Поставщик стандартного порошкового молока также дает коэффициент f.

Пример - Для определения константы f для фракции химозина готовят 100  концентрированного раствора чистого химозина в буферном растворе II (4.12.2). Этот препарат может быть получен из одного или нескольких разделений телячьего сычужного фермента (первая фракция) на хроматографе. Затем готовят не менее шести разных разбавлений этого препарата буферным раствором II (4.12.2).

Определяют время свертывания разных разбавлений в соответствии с методом, установленным в IS011815|IDF 157. Время свертывания следует равномерно распределить от 240 до 1200 с.

Значение для наименьшего разбавления (время свертывания около 300 с) принимают за 1,00, а значения для других разбавлений устанавливают в зависимости от этого, например, 0,50 (1/2), 0,33 (1/3), 0,25 (1/4), и т.д. Строят график t = d () и вычисляют поправочный коэффициент r. Если r равен или больше 0,999, можно определить константу f; если r меньше 0,999, делают новые разбавления и повторяют измерение времени свертывания.

Для определения константы f для фракции говяжьего пепсина готовят 100  концентрированного раствора чистого говяжьего пепсина в буферном растворе III (4.12.3). Этот препарат может быть получен из одного или нескольких разделений ферментного препарата из сычугов крупного рогатого скота (вторая фракция) на хроматографе. Затем готовят не менее шести разных разбавлений этого препарата буферным раствором III (4.12.3).

Определяют время свертывания в тех же временных пределах, как указано для фракции химозина, и вычисляют r. Если r равно или больше 0,999, можно определить константу f.

8.3 Выражение результатов

Выражают результат испытания с точностью до целых значащих цифр.

9 Прецизионность

9.1 Межлабораторные испытания

Значения параметров прецизионности получены по результатам межлабораторных испытаний жидких ферментных препаратов, проведенных в 1995 г. в соответствии с ISO 5725*(8) Результаты межлабораторных испытаний были статистически проанализированы вновь в марте 2009 г. в соответствии с [3] и [4]. Полученные значения не могут быть применимы к диапазонам концентраций и матрицам, кроме указанных.

Результаты исследования приводятся в приложении В.

Примечания

1 Значения повторяемости и воспроизводимости выводят из значений среднеквадратических отклонений , которые являются оценками истинного среднеквадратического отклонения метода. Каждое значение повторяемости и воспроизводимости представляет максимальную разницу между двумя результатами испытаний, ожидаемых в 95% случаев, при сравнении двух результатов. Если, в конечном итоге, значительно меньше, чем 95% случаев находятся в пределах значений, указанных ниже (9.2 и 9.3), то рекомендуется проанализировать условия выполнения анализа.

2 Из-за некоторых различий растворяющей способности и определенной степени неоднородности порошкового ферментного препарата, процентные значения параметров прецизионности, повторяемости и воспроизводимости могут быть несколько выше при анализе порошкового сычужного фермента.

9.2 Повторяемость

Среднеквадратическое отклонение коэффициент вариации повторяемости , выражающие изменчивость независимых аналитических результатов, полученных одним и тем же оператором, на одном и том же оборудовании, в одних и тех же условиях, на одной и той же пробе для анализа жидкого ферментного препарата, в течение короткого промежутка времени, не более чем в 5% случаев будет больше, чем а) или b):

a) 0,7% в абсолютном значении, выражая активность химозина и говяжьего пепсина в процентах;

b) 3,6% по отношению к среднеарифметическому содержания химозина, выраженному в миллиграммах на , и 8,4% по отношению к среднеарифметическому содержания говяжьего пепсина, выраженному в миллиграммах на .

Если два результата получены в этих условиях, то абсолютная разница r между двумя результатами анализа жидкого ферментного препарата не будет превышать 2,0% в абсолютном значении активности химозина и говяжьего пепсина в процентах.

9.3 Воспроизводимость

Среднеквадратическое отклонение и коэффициент вариации воспроизводимости , выражающие изменчивость независимых аналитических результатов, полученных операторами в разных лабораториях, на разном оборудовании, в разных условиях анализа одной и той же пробы ферментного препарата, не более чем в 5% случаев будет больше, чем а) или b):

a) 1,2% в абсолютном значении, выражая активность химозина и говяжьего пепсина в процентах;

b) 6,9% , по отношению к среднеарифметическому содержания химозина, выраженному в миллиграммах на , и 12,0% по отношению к среднеарифметическому содержания говяжьего пепсина, выраженному в миллиграммах на .

Если два результата получены в этих условиях, то абсолютная разница R между двумя результатами анализа жидкого ферментного препарата не будет превышать 3,3% в абсолютном значении активности химозина и говяжьего пепсина в процентах.

Примечания

1 Если, например, в одной лаборатории было установлено, что содержание химозина близко к 80%, то результат, полученный в другой лаборатории, не должен отклоняться более чем на 3,3% в абсолютном значении от 80%, т.е. результаты должны находиться между 76,7% и 83,3%.

2 Значения показателей прецизионности действительны при оценке результатов широкого круга лабораторий. Опыт показывает, что высококвалифицированные специалисты лабораторий способны проводить анализ с воспроизводимостью R между лабораториями, равной 1,9% абсолютного значения, выраженного как процент активности химозина.

10 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен содержать следующую информацию:

a) всю информацию, необходимую для идентификации пробы, включая подробности о фазе (жидкая или сухая);

b) применяемый метод отбора проб, если он известен;

c) применяемый метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

d) все подробности проведения испытания, не указанные в настоящем стандарте или считающиеся необязательными, а также подробности, касающиеся любых инцидентов, которые могут повлиять на результат(ы);

e) полученный(е) результат(ы) испытания;

f) в случае проверки повторяемости, окончательный полученный зарегистрированный результат.

_____________________________

*(1) EMD DEAE (М) - это пример имеющегося в продаже подходящего продукта. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о поддержке этого продукта со стороны ISO или IDF.

*(2) Mono 1  предварительно упакованной колонки - это пример имеющегося в продаже подходящего продукта. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о поддержке этого продукта со стороны ISO или IDF.

*(3) Union Carbide - это пример имеющегося в продаже подходящего продукта. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о поддержке этого продукта со стороны ISO или IDF.

*(4) Bio-Rad - Econopac 10DG - это пример имеющегося в продаже подходящего продукта. Информация при ведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о поддержке этого продукта со стороны ISO или IDF.

*(5) - это пример имеющегося в продаже подходящего продукта. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о поддержке этого продукта со стороны ISO или IDF.

*(6) - это пример имеющегося в продаже подходящего продукта. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о поддержке этого продукта со стороны ISO или IDF.

*(7) Cecalait, rue de Versailles, B.P. 70129, 39802 POLIGNY, FRANCE (e-mail: secretariat@cecalait.fr). Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о поддержке поставщика этого продукта со стороны ISO или IDF.

*(8) ISO 5725:1986, в настоящее время отменен и заменен (в частях) на [3] и [4].

_____________________________

*(1) "Gelbond" является примером имеющегося в продаже подходящего продукта. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о поддержке этого продукта со стороны ISO или IDF.

*(2) Indubiose A37 - это пример имеющегося в продаже подходящего продукта. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о поддержке этого продукта со стороны ISO или IDF.

*(3) INRA, place du Champ de Foire, 39800 POLIGNY, France and Chr. Hansen A/S, 1-27 Jernholmen, 2650 HVIDOVRE, Denmark (fax + 45 36 86 77 76) - организации, поставляющие эти продукты.

*(4) Dye R-250 или Serva Blue R - это пример имеющихся в продаже подходящих продуктов. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о поддержке этих продуктов со стороны ISO или IDF.

Библиография

[1]	ISO 707|IDF 50:2008 Milk and milk products - Guidance on sampling
[2]	ISO 1042 Laboratory glassware - One-mark volumetric flasks
[3]	ISO 5725-1 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 1. General principles and definitions
[4]	ISO 5725-2 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 2. Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method
[5]	Andrn, A., Rennets and coagulants. In: Fuquay, J.W., Fox, P.F., McSweeney, P. editors. Encyclopedia of dairy sciences, 2nd edition, pp. 574 - 578. Elsevier, 2011
[6]	Harboe, M., Broe, M.L., Ovist, K.B. The production, action and application of rennet and coagulants. In: Law, B.A., Tamine, A.Y., editors. Technology of cheesemaking, second edition, pp. 98 - 129. Oxford: Wiley-Blackwell, 2010
[7]	Andrn, A. Milk-clotting activity of various rennets and coagulants: Background and information regarding IDF Standards. In: The use of enzymes in dairying, Document No. 332, pp. 9 - 14. Brussels: International Dairy Federation, 1998
[8]	Garnot, P., Thapon, J.L., Mathieu, СМ., Maubois, J.L., Ribadeau-Dumas, B. Determination of rennin and bovine pepsins in commercial rennets and abomasal juices. J. Dairy Sci. 1972, 55, pp. 1641 - 1650
[9]	Collin, J.C., Martin, P., Garnot, P., Ribadeau-Dumas, В., Mocquot, G. Determination of chymosin and bovine pepsin A in commercial bovine rennets and pepsins. Milchwissenschaft 1981, 36, pp. 32 - 35
[10]	Collin, J.C., Musetde Retta, G., Martin, P. Immunological identification of milk-clotting enzymes. J. Dairy Res. 1982, 49, pp. 221 - 230
[11]	International Collaborative Study on Calf Rennet and Adult Bovine Rennet - Determination of Chymosin and Bovine Pepsin Contents - Bull. IDF