Приложение А (справочное). Количественное определение молокосвертывающих ферментов в промышленных коагулянтах методом двойной иммунодиффузии

Приложение А
(справочное)

Количественное определение молокосвертывающих ферментов в промышленных коагулянтах методом двойной иммунодиффузии

А.1 Общие требования

Цель данного метода - определение возможного наличия одного или нескольких из следующих шести коагулирующих ферментов: химозина, говяжьего пепсина, свиного пепсина, ферментов из Rhizomucor (Mucor) miehei, Rhizomucor (Mucor) pusillus и Cryphonectria (Endothia) parasitica в ферментных препаратах.

Примечание - Метод, рассматриваемый в данном приложении, является дополнением к методу определения содержания химозина и говяжьего пепсина в ферментных препаратах из сычугов телят и крупного рогатого скота, при условии, что этот метод позволяет установить, только ли химозин и говяжий пепсин присутствуют в таких экстрактах или в них также имеются наиболее распространенные молокосвертывающие ферменты (кроме химозина и говяжьего пепсина). В последнем случае хроматографический метод неприменим. Не все молокосвертывающие ферменты можно идентифицировать с помощью этого метода, однако идентификация наличия химозина и говяжьего пепсина и отсутствие наиболее распространенных заменителей сычужного фермента дают высокую уверенность в том, что анализируемый ферментный препарат является натуральным ферментным препаратом животного происхождения.

Данный метод применим: а) ко всем ферментам из говяжьих и свиных желудков, способствующим коагуляции, и b) к ферментам, способствующим коагуляции и произведенным в промышленных целях из особых штаммов грибов Rhizomucor (Mucor) miehei, Rhizomucor (Mucor) pusillus и Cryphonectria (Endothia) parasitica.

A.2 Принцип

В агарозной среде преципитация специфических антигенов-антител позволяет визуально определить наличие вышеуказанных ферментов в ферментных препаратах [10]. Первый шаг - наносят слой агарозы на пластинку. После затвердения агарозы в слое агарозного геля вырезают маленькие лунки, одни из которых заполняют антигеном в разных концентрациях, а другие - антисывороткой. Каждый из антагонистов мигрируют по направлению друг к другу (двойная иммунодиффузия) и образуются иммунные комплексы, которые преципитируют в полях геля и становятся видимыми как линии преципитации, когда относительные концентрации антигена и антисыворотки являются оптимальными.

А.3 Оборудование и химическая посуда

Используют обычное лабораторное оборудование и химическую посуду, в частности, нижеприведенные.

А.3.1 Стеклянные пластинки (10 x 10 см) или покрытая агарозой полиэфирная пленка "Gelbond", имеется в наличии в FMC Corporation, Bio Products, Rockland, Maine 04841, USA*(1).

A.3.2 Микропипетки вместимостью 0,004  и 0,015 .

А.3.3 Штампы размером диаметра 2,5 и 4,0 мм.

А.3.4 Пластмассовые подносы для окрашивания и промывания пластинок.

А.4 Реактивы

Используют реактивы только установленного аналитического качества и дистиллированную или деминерализованную воду, либо воду эквивалентной чистоты.

Примечание - Любое упоминание или информация о праве собственности в настоящем стандарте приведены для удобства пользователей настоящего стандарта и не являются подтверждением таких прав со стороны ISO или IDF.

А.4.1 Агароза, Indubiose А37 (IBF), тип HSA (Litex)*(2) или эквивалентный.

Примечание - Выбор агарозы не является решающим.

А.4.2 Хлорид натрия (NaCI).

А.4.3 Этанол, 95%.

А.4.4 Уксусная кислота, 100% (кристаллизованная).

А.4.5 Моноспецифические антитела и эталонные ферментные растворы

Моноспецифические антитела и эталонные ферментные растворы вместе с необходимыми инструкциями по применению можно получить в INRA (FR) или CHR. HANSEN (DK)*(3).

А.4.6 Кумасси бриллиантовый голубой, краситель R-250 или Serva Blue R*(4).

А.5 Методика

А.5.1 Приготовление пластин с агарозой

А.5.1.1 Хлорид натрия, массовая доля 9 .

Растворяют 9 г хлорида натрия в 1 дистиллированной воды.

А.5.1.2 Раствор агарозы

Добавляют 1 г агарозы (А.4.1) к 100  0,9%-ного хлорида натрия (А.5.1.1) и растворяют на водяной бане при температуре 100°С. Готовят свежий агарозный раствор непосредственно перед использованием.

А.5.1.3 Приготовление пластин с агарозой

После промывания стеклянных пластин этанолом наносят кистью слой агарозы. Как только пленка агарозы высохнет полностью, устанавливают пластину горизонтально, пипеткой наносят слой раствора агарозы (А.5.1.2) на пластину при 60°С и оставляют отвердевать. Толщина слоя должна составлять 1,5 мм, например, для пластины размером 10 х 10 см требуется 15  раствора агарозы. Используя покрытую агарозой полиэфирную пленку, наливают 15  раствора агарозы на гидрофильную поверхность и оставляют отвердевать.

А.5.2 Диффузия

А.5.2.1 Приготовление проб

Можно анализировать неразведенные пробы, если их концентрация не превышает 200 , или анализировать пробы в разных разбавлениях водой (например, 1:20 и 1:100). Разводят эталонные ферментные растворы в соответствии с указаниями изготовителя, которые прилагаются к поставляемым антигенам и антисыворотке.

А.5.2.2 Приготовление пластин с агарозой

Непосредственно перед началом диффузии вырезают маленькие цилиндрические лунки в слое агарозы, используя штамп (А.3.3). В соответствии с объемом пробы (см. указания изготовителя) лунки должны быть диаметром 2,5 или 4,0 мм. Центр лунки с пробой должен располагаться на расстоянии 5 мм от центра лунки с антителом (см. рисунок А.1).

"Рисунок А.1 - Пример расположения пластин"

Примечание - , и могут быть тремя разными сычужными ферментами или одним ферментом в трех разных разведениях, т.е. неразведенные, разведенные в 20 и 100 раз соответственно.

А.5.2.3 Введение проб

В зависимости от диаметра лунки используют микропипетку (А.3.2) для введения 0,004 или 0,015  пробы в нужную лунку. Вводят антисыворотку в центральную лунку, эталонный фермент - в верхнюю лунку, а пробу для анализа и два разведения - в три другие лунки (см. рисунок А.1). Затем оставляют пластинки в атмосфере, насыщенной водяными парами, при комнатной температуре на период от 10 до 15 ч или следуют указаниям поставщика антисыворотки и эталонных ферментных растворов.

А.5.3 Окрашивание пластин (необязательно)

Рекомендуется окрашивать пластины, так как преципитат становится чище и он может проявиться в большей степени.

А.5.3.1 Приготовление красителя

Растворяют 5 г красителя голубого бриллиантового кумасси (А.4.6) в 1 растворителя, приготовленного из этанола (А.4.3), уксусной кислоты (А.4.4) и воды в объемах 4,5 + 1,0 + 4,5 соответственно. Нагревают полученный раствор до 60°С и фильтруют.

А.5.3.2 Промывание и окрашивание пластин

Каждую пластину покрывают одним слоем фильтровальной бумаги и несколькими слоями (например, 0,5 см) мягкой абсорбирующей бумаги, предварительно слегка спрессовав ее (например, с помощью книг) в течение не менее 10 мин. Бумагу удаляют и вымачивают пластину в растворе хлорида натрия массовой долей 9 (А.5.1.1) более 1 ч. Повторяют процедуру прессования в течение 10 мин. Промывают пластину раствором хлорида натрия массовой долей 9 при комнатной температуре всю ночь.

Пластину опять прессуют и вымачивают в дистиллированной воде в течение 30 мин. После вымачивания пластину заново прессуют и высушивают ее горячим воздухом.

Пустые лунки геля заполняют дистиллированной водой, чтобы предотвратить растрескивание геля во время прессования. Фильтровальную бумагу с геля удаляют после каждого прессования. Процедуру промывания можно изменить, используя более длительное время для промывания и меньше или совсем не применяя прессование геля, или используя более короткий промежуток времени промывания и более частое прессование геля (см. также инструкции поставщика).

Вымачивают пластину в красителе (А.5.3.1) не менее 15 мин.

Обесцвечивают пластину раствором этанола, уксусной кислоты и воды в объемах 4,5 + 1,0 + 4,5 соответственно, который применяют для приготовления красителя (А.5.3.1). Допускается после обесцвечивания пластину промыть водой и высушить горячим воздухом.

А.6 Интерпретация результатов

Кривые преципитации могут быть отмечены непосредственно после инкубации в виде матово-белой линии преципитации, но преципитат часто становится более заметным после окрашивания.

Возникновение линии преципитации между лункой, содержащей антитело против фермента А, и лункой, содержащей пробу для анализа Е, показывает присутствие фермента А в пробе Е. Между линией преципитации эталонного фермента и линией преципитации пробы должна быть непрерывность (см. рисунок А.2).

"Рисунок А.2 - Пример результатов двойной иммунодиффузии"

Пластина оценивается следующим образом:

- Преципитат между каждой сывороткой и соответствующей эталонной пробой (см. А.5.2.2) показывает, что испытание состоялось.

- Проба содержит химозин (СН), говяжий пепсин (ВрА) и протеазу Rhizomucor miehei (Rmp).

- Проба содержит только протеазу Rhizomucor miehei (Rmp).

- Ни одна из проб не содержит свиной пепсин (РрА).

- Пробы не было на этой пластине.

А.7 Чувствительность

Чувствительность метода меняется в зависимости от используемой антисыворотки, но в сычужном ферменте молокосвертывающей активностью 200 присутствие фермента можно легко обнаружить в смеси. В целом, может быть достигнуто пороговое значение 1% общей активности фермента.