Методические указания по фотометрическому измерению концентраций липазы микробной в воздухе рабочей зоны (утв. заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 12 декабря 1988 г. N 4802-88)

Липаза микробная является ферментным препаратом, предназначенным для расщепления жиров, применяется в медицине, в меховой, кожевенной промышленности, в животноводстве, и других отраслях народного хозяйства.

Липаза микробная - мелкий порошок светло-коричневого цвета и легким дрожжевым запахом, растворим в воде, в солевых растворах (в частности, фосфатном буфере), нерастворим в большинстве органических растворителей.

В воздухе находится в виде аэрозоля.

Ферментный препарат липаза микробная раздражает слизистые оболочки верхних дыхательных путей и легких, обладает аллергенным действием.

ПДК в воздухе 1 .

Характеристика метода

Метод основан на фотометрическом определении цветного комплекса меди, образуемого свободными жирными кислотами, которые выделяются в результате гидролитического действия липазы, с диэтилдитиокарбаматом.

Отбор проб производится с концентрированием на фильтр.

Нижний предел измерения содержания жирной кислоты 1 мкг/мл в фотометрируемом растворе.

Нижний предел измерения липазы в воздухе 0,3 (при отборе 4 л воздуха).

Диапазон измеряемых концентраций липазы в воздухе от 0,3 до 3,7 .

Измерению не мешают белковые вещества и фосфорнокислые соли.

Суммарная погрешность измерения не превышает 25%.

Время выполнения измерения, включая отбор проб, 1 час 30 мин.

Приборы, аппаратура, посуда

Спектрофотометр.

Аспирационное устройство.

Фильтродержатели, ТУ 95.72.05-77.

рН-метр типа ионометра ЭВ-74.

Размельчитель тканей РТ-2, ТУ 64-1-1305-79.

Аппарат инактивации сыворотки АИС, ТУ 64-1-1091-77 или лабораторная водяная баня.

Колбы конические, ГОСТ 10394-72, вместимостью 1000 мл.

Бюретка, ГОСТ 20292-74, вместимостью 25 мл.

Мерные колбы, ГОСТ 1770-74, вместимостью от 25 до 1000 мм.

Пипетки, ГОСТ 20292-74, вместимостью 1 и 5 мл.

Цилиндры мерные, ГОСТ 1770-74, вместимостью 100 мл.

Бюксы, ГОСТ 25336-82, вместимостью 2-5 мл.

Пробирки с пришлифованными пробками, ГОСТ 10515-75, вместимостью 15 мл.

Стаканы химические, ГОСТ 25336-82, вместимостью 50; 100; 250 мл.

Реактивы, растворы и материалы

Липаза микробная.

Оливковое масло, ГОСТ 7580-55.

Спирт поливиниловый (ПВС0#, ТУ 64-5-51-79, 2% водный р-р.

Натрий фосфорнокислый двухзамещенный, ГОСТ 4172-76, 1/15 М раствор (А).

Калий фосфорнокислый однозамещенный, ГОСТ 4198-75, 1/15 М раствор (Б).

Фосфатный буфер, 1/15 М раствор с рН 7,8. Готовят смешиванием растворов А и Б в соотношении 91,5:8,5. Величину рН проверяют на рН-метре.

Хлороформ, ГОСТ 215-74, хч.

Гептан, ГОСТ 5.395-78, хч.

Раствор экстракционный: готовят путем смешивания хлороформа и гептана 3:2.

Уксусная кислота, ледяная, ГОСТ 6175, 1 М раствор.

Медь азотнокислая трехводяная, ГОСТ 4163-68, чда.

Натрий хлористый, ГОСТ 4233-77, хч.

Триэтаноламин, ТУ 6-09-2448-72, ч.

Бутанол, ГОСТ 6006-78, чда.

Натрия N,N-диэтилдитиокарбамат, ГОСТ 8864-71, ч.

Реагент меди: готовят в мерной колбе на 200 мл, для этого к 10 мл 1 М раствора уксусной кислоты добавляют 12 мл триэтаноламина, 4,75 г меди азотнокислой и 100 мл воды, растворяют, добавляют 57 г хлористого натрия и 50 мл воды, затем 1 М уксусной кислотой устанавливают рН-8,1 и доводят до метки водой. Устойчив реагент месяц (до образования зеленого осадка).

Цветной реагент: в мерной колбе на 100 мл растворяют 100 мл натрия N,N-диэтилдитиокарбамата в 60 мл бутанола и доводят до метки хлороформом. Сохраняется при хранении в холодильнике в течение 2-х недель.

Эмульсия оливкового масла; готовят перемешиванием 40 мл оливкового масла с 60 мл 2% раствора ПВС в дистиллированной воде в стакане микроизмельчателя тканей при 3000 об/мин в течение 30-40 минут. Эмульсия готовится перед употреблением.

Пальмитиновая кислота, МРТУ 6-09-5841-69. Для стандарта возможно также применение олеиновой кислоты.

Стандартный раствор N 1 с концентрацией 1,5 мг/мл пальмитиновой кислоты готовят растворением кислоты в экстракционном растворе в мерной колбе на 50 мл. Раствор устойчив при хранении в холодильнике в течение недели.

Стандартный раствор N 2 и 3 с концентрацией 100 мкг/мл и 10 мкг/мл готовят путем соответствующего разбавления раствора N 1 экстракционным раствором. Готовят перед употреблением.

Фильтры АФА-ХА-20 или АФА-ХА-10.

Отбор пробы воздуха

Воздух с объемным раствором 1 л/мин аспирируют через фильтр АФА-ХА, укрепленный в фильтродержателе.

Для определения 1/2 ПДК достаточно отобрать 2,5 л воздуха.

Пробы устойчивы длительное время.

Подготовка к измерению

Градуировочные растворы готовят в пробирках, согласно таблице 12.

Таблица 12

N стандарта	Стандартный раствор N 3	Экстракционный раствор, мл	Концентрация пальмитиновой кислоты, мкг/мл
1	0,0	5,0	0
2	0,5	4,5	1
3	1,0	4,0	2
4	2,0	3,0	4
5	3,0	2,0	6
6	4,0	1,0	8
7	5,0	0,0	10

Во все пробирки с градуировочными растворами добавляют 0,5 мл насыщенного раствора натрия бромистого и 2,5 мл реагента меди. Пробирки закрывают и встряхивают при 1500 об/мин. По 3,5 мл органического слоя переносят в пробирки с 0,4 мл цветного реагента. Перемешивают и через 5-10 минут измеряют оптическую плотность при длине волны 440 нм. Измерение проводят в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм по отношению к раствору сравнения, не содержащего определяемого вещества (раствор N 1 по таблице). Окраска растворов устойчива 3 часа.

Строят градуировочный график зависимости значений оптических плотностей от соответствующих им концентраций жирной кислоты в градуировочном растворе (мкг/мл).

Проверка градуировочного графика проводится в случае использования новой партии реактивов, но не реже 1 раза в квартал.

Проведение измерения

Фильтр с отобранной пробой переносят в химический стакан, добавляют 5 мл фосфатного буфера и перемешивают интенсивно в течение 10 мин стеклянной палочкой или на магнитной мешалке. В пробирки вносят 1 мл эмульсии оливкового масла и 8-10 минут выдерживают в водяной бане при , затем не вынимая добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл раствора фермента (пробы), перемешивают и оставляют при 37°С на 1 час (точно) для проведения липолиза. По истечении этого времени в каждую пробирку добавляют 5 мл экстракционного раствора из бюретки и интенсивно встряхивают в течение 3 минут.

Определение содержания образовавшейся жирной кислоты проводят аналогично градуировочным растворам. Раствором сравнения служит эмульсия с добавлением фосфатного буфера, которым обработан чистый фильтр. Остальные реактивы добавляют в том же количестве, как при анализе проб. Концентрацию жирной кислоты находят по графику.

Расчет концентрации

Концентрацию липазы микробной (C) в воздухе (в ) вычисляют по формуле:

, где

а - концентрация жирной кислоты в анализируемом растворе, найденная по графику, мкг/мл;

- общий объем раствора для экстракции жирных кислот, мл;

- общий объем раствора пробы с ферментом, мл;

# - объем раствора пробы с липазой, взятый для инкубирования, мл;

V - объем воздуха, отобранный для анализа и приведенный к стандартным условиям, л (см. Приложение 1);

1000 - коэффициент пересчета на 1 ;

M - молекулярная масса жирной кислоты;

А - липолитическая активность липазы, ЛЕ/мг, ч. Единице липолитической активности (ЛЕ) соответствует такое количество фермента, которое освобождает 1 мкмоль жирной кислоты в течение часа при 37°С. Или это количество микроэквивалентов жирной кислоты, выделяющихся в результате гидролитического действия 1 мг фермента липазы. Использована липаза с активностью 200000 ЛЕ/гч (200 ЛЕ/мг ч).

Пояснение к формуле расчета:

- количество мкмоль жирной кислоты в градуировочном растворе. Так как 200 мкэквив. жирной кислоты дает 1 мг липазы, то мкэквивалентов дает

мг липазы.

Эти А мг липазы содержит мл пробы, объем всей пробы фермента мл.

V / 1000 количество воздуха, отобранного для анализа.

Заместитель Главного государственного санитарного врача СССР

А.И. Заиченко