Методические рекомендации "Организация мониторинга заносов и распространения гриппа птиц в природных условиях на территории Российской Федерации" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 26 декабря 2008 г. N 01/15701-8-34)

Методические рекомендации
"Организация мониторинга заносов и распространения гриппа птиц в природных условиях на территории Российской Федерации"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 26 декабря 2008 г. N 01/15701-8-34)

Дата введения: с момента утверждения

Взамен методических рекомендаций
от 17 ноября 2006 г. N 0100/12294-06-34

Список сокращений

ВГПА - вирус гриппа птиц типа А

Биобезопасность - биологическая безопасность

ИФА - иммуноферментный анализ

МФА - метод иммунофлуоресцирующих антител

ОТ-ПЦР - метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

1. Область применения

1.1. Методические рекомендации разработаны на основании Федерального закона Российской Федерации "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" N 52 от 30.03.99.

1.2. Настоящие методические рекомендации предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и других организаций независимо от организационно-правовой формы собственности.

2. Общие положения

2.1. Целью введения настоящих методических рекомендаций является регламентация мероприятий по эпизоотологическому мониторингу за гриппом птиц в природных условиях. Комплекс мероприятий по мониторингу включает в себя организацию сбора, хранения и транспортирования материала, проведение лабораторных исследований, а также обеспечение биологической безопасности проводимых работ. Основной задачей мероприятий по мониторингу за гриппом птиц является выявление заносов возбудителя и распространения этой инфекции в популяциях диких животных околоводного комплекса с целью проведения адекватных противоэпидемических и профилактических мероприятий среди людей.

2.2. Организация и проведение мероприятий по эпизоотологическому мониторингу гриппа птиц в природных условиях на территории Российской Федерации осуществляется органами и учреждениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека во взаимодействии с органами и учреждениями Минсельхоза и Россельхознадзора.

2.3. Объем, характер и направленность проведения профилактических мероприятий среди людей определяются результатами эпизоотологического обследования и прогнозом эпизоотической и эпидемической ситуации по гриппу птиц в конкретных субъектах Российской Федерации.

2.4. Управления Роспотребнадзора по субъектам Российской Федерации, на территории которых обнаружены эпизоотии гриппа птиц, совместно с органами исполнительной власти субъектов, органами Россельхознадзора, МЧС и другими заинтересованными службами и ведомствами планируют проведение мероприятий, направленных на предупреждение распространения вируса среди домашней птицы, на птицефабриках и среди людей, а также направленных на минимизацию последствий от возможных вспышек, если они уже возникли, и их подавление. Комплексный план профилактических мероприятий по гриппу птиц составляют управления Роспотребнадзора совместно с органами управления здравоохранением субъектов Российской Федерации, Россельхознадзором и другими заинтересованными службами и ведомствами сроком не менее чем на 2 года с ежегодным корректированием.

2.5. Прогноз эпидемиологической и эпизоотологической ситуации по гриппу птиц на территории Российской Федерации составляется научно-методическим центром по референс-диагностике и изучению высокопатогенных штаммов вируса гриппа - НМЦГ (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора). Прогноз составляется на основе предоставляемых в НМЦГ заключений об эпидемиологической и эпизоотологической обстановке по гриппу птиц в России (1-2 раза в год), подготовленных Центром экологии и эпидемиологии гриппа - ЦЭЭГ (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН) и Федеральным Центром по гриппу - ФЦГ (ГУ НИИ гриппа РАМН). Эти заключения формируются на основе представляемой в адрес ЦЭЭГ и ФПГ информации от курируемых ими соответствующих учреждений (противочумные станции и опорные базы, определенные Приказом Роспотребнадзора от 31.03.05 N 373). Сформулированный обобщенный прогноз и заключения об эпидемиологической и эпизоотологической обстановке в России направляются в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Данные прогноза эпидемиологической и эпизоотологической ситуации по гриппу птиц на территории Российской Федерации передаются в ВОЗ, на информационный сайт НМЦГ, в Национальные центры по гриппу стран СНГ и учреждения-разработчики (ЦЭЭГ и ФЦГ) после согласования с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2.6. Консультативно-методическая и практическая помощь управлениям Роспотребнадзора по субъектам Российской Федерации по вопросам профилактики и проведения противоэпидемических мероприятий среди людей на территориях, пораженных эпизоотией гриппа птиц, осуществляется НМЦГ, ЦЭЭГ и ФЦГ, Противочумным центром, региональными центрами по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I-II групп патогенности и Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней, созданных на базе противочумных учреждений.

3. Обоснование необходимости осуществления мониторинга за гриппом птиц

Необходимость проведения мониторинга за гриппом птиц определяется реальной опасностью заносов возбудителя этого заболевания перелетными птицами и формирования очагов инфекции во многих регионах Российской Федерации, а также возникновения эпизоотий среди домашних птиц и потенциальная способность вируса гриппа птиц вызывать заражение человека.

С 1997 г. отмечаются эпизоотии среди диких и домашних птиц, вызванных высокопатогенными вирусами гриппа А субтипа H5N1, способными вызывать также тяжёлые заболевания среди людей с высокой летальностью. В последние годы происходит расширение ареала вируса гриппа птиц, увеличение видового спектра носителей, повышение вирулентности циркулирующих штаммов. Способность выживать в окружающей среде в течение длительного времени, особенно при низких температурах, обусловливает расширение ареала распространения вируса и необходимость проведения мероприятий по мониторингу на обширных территориях Российской Федерации.

Случаи передачи вируса гриппа А субтипа H5N1 от человека к человеку не зарегистрированы, хотя семейные очаги заболеваний отмечались неоднократно. Однако совместная циркуляция штаммов вирусов гриппа человека и птиц повышает вероятность события реассортации и возникновения пандемичного варианта вируса гриппа.

Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор) контролирует обстановку по птичьему гриппу, решая в первую очередь проблемы профилактики эпизоотических вспышек среди домашних животных. Вместе с тем эпизоотологический мониторинг гриппа птиц в природных биотопах в настоящее время проводится в недостаточном объеме.

4. Организация эпизоотологического мониторинга за гриппом птиц в природных условиях

4.1. Эпизоотологические и эпидемиологические особенности гриппа птиц

Вирусы гриппа, которые принадлежат к семейству Orthomyxoviridae, классифицируются как А, В и С на основании антигенных различий в их нуклеопротеиновом (NP) и матричном (M1) белках. Из трех известных типов вирус гриппа А является наиболее патогенным и инфицирует разнообразные виды животных, включая свиней, лошадей, морских млекопитающих и птиц, периодически вызывая пандемии в человеческой популяции. Дальнейшее разделение вируса гриппа А на субтипы основано на антигенных свойствах двух поверхностных гликопрогеинов: гемагглютинина (Н) и нейраминидазы (N). В настоящее время известны 16 вариантов гемагглютининов (Н1-Н16) и 9 вариантов нейраминидаз (N1-N9). Только вирусы гриппа А вызывают инфекции птиц. Все известные на сегодняшний день комбинации из гемагглютининов (H1-H16) и нейраминидаз (N1-N9) гриппа были изолированы от птиц. Вирусы гриппа А, инфицирующие домашнюю птицу, могут быть разделены на две группы на основе их патогенности. Высоковирулентные вирусы вызывают "птичью чуму" - высокопатогенный грипп птицы (highly pathogenic avian influenza - HPAI), при которой смертность достигает 100%. Эти вирусы ограничены Н5, Н7 и Н9 субтипами, хотя не все штаммы этих субтипов вызывают HPAI. Все другие субтипы вируса, вызывающие более слабую форму респираторного заболевания, обозначаются как низкопатогенный грипп птицы (LPAI). Впервые вирус высокопатогенного гриппа птиц субтипа H5N1 был выделен от цыпленка в 1959 г. в Шотландии.

Вирусы гриппа птиц обладают высокой изменчивостью и способностью к мутациям, что приводит к постоянному возникновению новых штаммов вируса, в том числе обладающих повышенной вирулентностью. Важной особенностью вируса гриппа птиц субтипа H5N1 является способность выживать в окружающей среде в течение длительных периодов времени, особенно при низких температурах (например, в загрязненной пометом воде). В воде вирус может выживать до 4 дней при 22°С и более 30 дней при температурах 4-6°С, в фекалиях - в течение 35 дней при температуре 0°С. Длительная сохранность вируса в объектах внешней среды обусловливает расширение ареала распространения вируса и необходимость проведения мероприятий по мониторингу на большем количестве территорий Российской Федерации.

Основной путь передачи инфекции в природе - фекально-оральный. Вирусы в организме птиц локализуются в верхних дыхательных путях и кишечнике. Большое количество вирусов содержится в фекалиях инфицированных птиц, сохраняясь там до 3 месяцев. У птиц зарегистрирована также трансовариальная передача вирусов (птенцы вылупляются из яиц уже больными). Есть предположение о возможности трансмиссивного пути передачи вируса эктопаразитами птиц (комарами, пухоедами).

Основные носители вируса гриппа птиц в природе - дикие птицы околоводного комплекса (в основном представители отряда гусеобразных, ржанкообразных, чайкообразных и аистообразных). Зарегистрировано более 100 видов птиц из 15 отрядов, спонтанно заражённых этой инфекцией. У диких птиц, вирус, хотя и сохраняется в верхних дыхательных путях и лёгких, может не вызывать манифестных форм заболевания. Инфекция протекает как бессимптомно, так и со слабовыраженными одним (чаще энтеритом) или несколькими клиническими признаками. Больные птицы могут длительно выделять с экскретами большое количество активного возбудителя в окружающую среду, что приводит к заражению восприимчивых животных. Носителями могут стать и птицы антропогенного комплекса (сороки, вороны, грачи, скворцы, воробьи), транспортирующие вирусы на птичий двор, где кормятся вместе с курами. Вирусы гриппа птиц обнаружены также у млекопитающих - свиней, лошадей, северных оленей, тюленей, моржей, китов, кошек, тигров, норок и грызунов.

Из домашних птиц основная роль в качестве носителей вируса Н5N1 принадлежит уткам и гусям, которые зачастую сами не болеют или переносят инфекцию в лёгкой форме, но выделяют вирус в окружающую среду в большом количестве. Куры, особенно их молодняк и несушки, очень чувствительны к гриппу птиц. Именно в их популяциях возникают массовые эпизоотии, приводящие к 100% гибели поголовья. Болеют также индюки, перепёлки, куропатки, бойцовские петухи, павлины, цесарки, страусы и попугаи.

Инкубационный период болезни у птиц длится 1-7 дней. Клиническими признаками болезни являются вялость, снижение яйценоскости, отказ от пищи, взъерошенность перьев, истечения из носовой и ротовой полостей, понос, синюшность гребня и серёжек, раздутие и подкожное кровоизлияние шпор, судороги и паралич. Смерть наступает очень быстро, зачастую в течение первых суток после инфицирования. Чаще всего заболевают птицы на личных подворьях и фермах с открытым выпасом птицы. Крупные животноводческие хозяйства, где соблюдается режим закрытого содержания, поражаются гораздо реже.

Устойчивые природные очаги гриппа птиц находятся в странах Юго-Восточной Азии, где вирус инфекции способен циркулировать круглогодично в популяциях местных и зимующих перелётных птиц, скапливающихся на водоёмах. Мигрирующие с юга на север дикие птицы, совершающие дальние перемещения на места постоянных гнездовий (чайки, кулики, аистообразные и воробьиные), заносят вирус на водоёмы, где происходит заражение оседлых видов.

В настоящее время на территории России, Китая, Монголии, Казахстана, Азербайджана, Украины, Турции, Египта, Ирака, Румынии и других стран Евразии вдоль пролётных трасс мигрирующих птиц, сформировались и функционируют заносные природные очаги, откуда возможна дальнейшая экспансия гриппа птиц субтипа H5N1 на территорию России и сопредельных государств.

Первая документированная передача вируса гриппа птиц людям зарегистрирована в 1996 г., а передача субтипа Н5N1 - в Гонконге в 1997 г., когда из 18 заболевших 6 человек погибли. В настоящее время заболевание у человека, вызванное вирусом гриппа птиц - субтип H5N1, официально зарегистрировано в 13 странах - Азербайджан, Камбоджа, Китай, Джибути, Египет, Индонезия, Ирак, Лаос, Нигерия, Таиланд, Турция, Вьетнам, Мианмар.

Основной путь заражения людей вирусом гриппа птиц - при контактах с зараженной птицей, при разделке тушек больной птицы.

Длительность инкубационного периода при гриппе A (H5N1) составляет обычно 2-3 дня с колебаниями от 1 до 7 дней. Заболевание начинается остро - с озноба, миалгии, возможны боли в горле, ринорея. В странах Юго-Восточной Азии более чем у половины больных отмечалась водянистая диарея при отсутствии слизи и крови в фекалиях, в четверти случаев повторная рвота. Повышение температуры тела является одним из ранних и постоянных симптомов. Уже в первые часы болезни температура превышает 38°С и часто достигает высоких и гиперпире-тических значений. В разгар заболевания (на 2-3-й день болезни) характерно поражение нижнего отдела дыхательных путей (нижний респираторный синдром) с возможным развитием первичной вирусной пневмонии: кашель, одышка и дисфония. Кашель обычно влажный, в мокроте нередко отмечается примесь крови. Аускультативно-жесткое дыхание, хрипы. На рентгенограмме грудной клетки в ранние сроки находят неспецифические изменения в легких - диффузные, мультифокальные или отдельные инфильтраты, которые способны к быстрому распространению и слиянию. В некоторых случаях могут быть обнаружены сегментарные или долевые уплотнения. Профессирование заболевания сопровождается развитием дыхательной недостаточности и острого респираторного дистресс-синдрома.

В периферической крови больных определяется:

- лейкопения ;

- лимфопения; средний уровень (от 0,25 до при нижней границе нормы );

- тромбоцитопения; средний уровень (от 45,0 до при нижней границе нормы ).

Проявлениями пантропизма вируса, развивающегося в процессе интоксикации, может быть поражение печени и почек, более чем у 30% больных развивается острая почечная недостаточность. При биохимическом исследовании крови, как правило, выявляется повышение активности трансаминаз, нередко наблюдается креатининемия.

Дети младшего возраста переносят заболевание в тяжелой форме. К основным синдромам у них возможно присоединение симптомов энцефалита. В этом случае симптоматика дополняется сильной головной болью, рвотой, нарушением сознания и тошнотой.

4.2. Цель и задачи эпизоотологического мониторинга за гриппом птиц в природных условиях

Основной целью эпизоотологического мониторинга за гриппом птиц является своевременное выявление случаев заноса вируса гриппа птиц в природные биотопы и отслеживание особенностей распространения этой инфекции среди диких животных околоводного комплекса.

Для обеспечения цели необходимо решить следующие задачи:

- выбрать географические точки для мониторинга с составлением кадастра водоемов, где скапливается большое количество птиц лимнофильного комплекса для отдыха, гнездования и кормежки;

- организовать выездные мобильные бригады для сбора проб материала на исследование;

- установить видовой состав, численность, особенности размещения потенциальных носителей ВГП в биотопах околоводного комплекса;

- осуществлять сбор проб полевого материала для лабораторного исследования на наличие вируса гриппа птиц, обработку и оперативный анализ полученных результатов;

- изучить эпизоотологический статус отдельных видов и групп птиц и других животных околоводных биоценозов;

- изучить параметры эпизоотического процесса в очагах гриппа птиц (сезонные особенности, площади эпизоотий, видовой спектр зараженных животных и др.);

- оценить степень опасности инфицирования различных типов водоемов, располагающихся в непосредственной близости от сельских населенных пунктов и крупных птицеводческих хозяйств;

- составить список населённых пунктов, где возможно заражение домашних животных гриппом птиц от диких околоводных птиц;

- разработать мероприятия по предупреждению эпизоотических вспышек и заболеваний людей;

- проводить санитарно-просветительную и разъяснительную работу среди местного населения;

- составлять прогнозы развития ситуации;

- организовать оповещение органов здравоохранения и местных органов исполнительной власти о результатах эпизоотологического обследования территорий на наличие очагов вируса гриппа птиц и прогнозе развития эпидемической ситуации.

4.3. Тактика и методы эпизоотологического мониторинга за гриппом птиц в природных условиях

Основой эпизоотологического мониторинга за гриппом птиц в природных условиях является обследование водных и околоводных биоценотических комплексов, которое осуществляется в плановом порядке. Поиск возбудителя гриппа птиц должен проводиться, в первую очередь, в околоводных биотопах, расположенных как в местах концентрации и гнездования, так и вдоль, и внутри межконтинентальных трасс сезонных перелетов или кочевок птиц, относящихся, прежде всего, к отрядам гусеобразных, ржанкообразных, поганкообразных, веслоногих, голенастых, журавлеобразных, голубеобразных, куриных, воробьиных. При этом участки для сбора материала выбираются вблизи и (или) на территории населенных пунктов и мест рекреации, а также на территориях, где отмечался падеж птиц от гриппа и случаи заболевания людей. Здесь же подбирают и ключевые участки (пункты долговременного мониторинга - ПДМ), где исследования будут проводиться в течение нескольких сезонов. Каждый участок обследуют минимум 3 раза в год (в период весенних миграций, в гнездовой и послегнездовой периоды). По эпидпоказаниям проводят экстренные дополнительные эпизоотологические обследования.

Предпосылкой для начала эпизоотологического обследования околоводных биотопов является начало весенней миграции птиц околоводного комплекса, информация о случаях падежа среди болотных, озерных, речных птиц.

Эпизоотическая ситуация оценивается на основании эпизоотологического обследования, при котором регистрируется состояние численности фоновых видов животных околоводных биотопов, и по результатам лабораторных исследований, подтверждающих наличие возбудителя гриппа птиц в различных объектах. На основании этих данных дается мотивированное заключение об опасности эпизоотии.

При эпизоотологическом обследовании на грипп птиц в естественных природных биоценозах необходимо обращать внимание на водоёмы, где скапливаются одиночные, стайные и колониальные птицы. Особенно на непроточные пресные или слабоминерализованные водоёмы с обилием прибрежно-водной и кустарниковой растительности, где имеются оптимальные условия для укрытий, отдыха, кормёжки и гнездования птиц. При выборе мест обследования и определении состава и количества проб руководствуются особенностями гидрографической сети обследуемой местности: расположением водоёмов, их размерами. В первую очередь контролируются озёра, заболоченные низины, пруды, заливы, лиманы, ерики, плавни и др., располагающиеся в непосредственной близости от сельских населённых пунктов.

В процессе эпизоотологического обследования осуществляются наблюдения за погодными условиями, фенологическими явлениями, проводятся учёты птиц, характер их размещения, численности и активности. Необходимо выявлять и отслеживать сроки, длительность и трассы их массовых сезонных перелётов и кормовых кочёвок. При поиске очагов гриппа птиц обращают внимание на внешние признаки эпизоотий у диких птиц, особенно отмечая резкое снижение численности и активности пернатых, изменения в их поведении на водоёмах, появление вялых особей, взъерошенности перьев, малоподвижность и др. Учитывая высокую чувствительность птенцов к вирусу гриппа, больных особей вероятнее всего выявить в выводковый период.

Основными объектами при сборе проб для лабораторного анализа являются водоплавающие и околоводные птицы: гуси, лебеди, утки, кулики, чайки и крачки, цапли и пастушковые. Для получения полной информации следует добывать и других птиц, обитающих на водоёмах, включая дневных хищников (соколообразных) и воробьиных. Обязательно исследование птиц синантропных видов: голубей, сорок, ворон и воробьёв. Все павшие птицы, обнаруженные на водоёме или в прибрежной зоне, обязательно являются объектами сбора и лабораторного анализа. Необходимо отлавливать также мелких млекопитающих, обитающих по берегам водоёмов: водяную полёвку, ондатру, мышей, землероек и др.

Сроки и продолжительность экспедиционных полевых работ определяются погодным режимом, фенологическими явлениями года, особенностями экологии птиц. Оптимальными сроками для сбора материала при изучении гриппа птиц следует считать периоды массовых сезонных миграций перелётных птиц весной и осенью (апрель, сентябрь), а также гнездовой и выводковый периоды от появления птенцов до их подъёма на крыло (май-июль).

На предварительном этапе, перед выездом в поле, осуществляется изучение картографических материалов, приобретаются топографические, гидрографические, геоботанические или ландшафтные карты и схемы масштабов 1:25 000 - 1:200 000. На основании этих документов составляются календарно-территориальные планы и графики работы, намечаются места стоянок и маршруты движения зоологических групп.

Эпизоотологическое обследование осуществляется путем последовательного радиального объезда территории. Маршруты, последовательность переездов, места, количество и длительность стоянок определяются в зависимости от обстановки, характера местности, условий работы, удобства подъездов и транспортирования собранных проб в лабораторию.

В обязанности экспедиционной группы вменяется также наблюдение за населением: его численностью, хозяйственной деятельностью и характером пребывания на водоёмах. Особое внимание обращается на перемещение сельскохозяйственных рабочих, охотников, рыбаков, туристов и отдыхающих в период возможных ухудшений обстановки по гриппу птиц. Необходимо проводить активную разъяснительную и санитарно-просветительную работу среди местного и временного населения, тесно контактируя с представителями местных органов здравоохранения, власти, милиции, представителями ветеринарной службы.

Минимальный состав полевой группы: орнитолог, териолог, вирусолог, эпидемиолог, лаборант, водитель, повар. Отстрел птиц можно проводить на договорной основе силами специальной бригады охотников.

При эпизоотологическом обследовании используют общепринятые зоологические и экологические методы, регламентированные действующими нормативными документами (например, МУ 3.1.1029-01).

4.4. Правила сбора, хранения и транспортирования материала для лабораторного исследования

Все работы по сбору, хранению и транспортированию полевого материала, подозрительного на содержание вируса гриппа птиц типа А (субтипы Н5 и Н7), проводят в соответствии с действующими СП 1.2.036-95 и МУ 3.1.1027-01. Работу по сбору полевого материала проводят в сезонной защитной одежде, дополненной респиратором, защитными очками и резиновыми перчатками (прилож. 6 СП 1.3.1285-03).

Для лабораторного исследования из природных биотопов берут:

- птиц, птенцов;

- яйца птиц;

- фекалии птиц и (или) мазок из клоаки и трахеи;

- мелких млекопитающих околоводных биотопов;

- воду и ил в местах гнездований.

Добытых птенцов, мелких птиц и млекопитающих (живых и агонирующих особей предварительно умерщвляют с помощью корнцанга) помещают в мешочки из плотной белой ткани (каждое животное в отдельный мешочек), края мешочков два раза подворачивают и туго завязывают. Используют мешочки рубцом наружу. Их снабжают этикетками с указанием даты, точного адреса, стации, вида животного, фамилии сборщика. Для транспортирования тканевые мешочки с тушками животных помещают в клеенчатый мешок.

У крупных птиц берут мазок из клоаки и отсекают голову с участком шеи. Голову помещают в отдельный клеенчатый мешок, который снабжают этикеткой.

Условия хранения. При температуре от 2 до 8°С - в течение суток, при необходимости длительного хранения животных вскрывают, органы и ткани замораживают при температуре ниже минус 40°С.

Условия транспортирования. Тушки животных и головы - в течение суток при температуре от 2 до 8°С. Органы - в замороженном виде в сосуде Дьюара или термоконтейнере с сухим льдом.

Мазки из клоаки берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами. После забора материала тампон (рабочую часть зонда) помещают в стерильную одноразовую микропробирку с 500 мкл стерильного 0,9%-го раствора натрия хлорида или фосфатного буфера. Конец зонда отламывают или отрезают с расчетом, чтобы он позволил закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают и ставят в штатив, который затем помещают в термоконтейнер с охлаждающими элементами.

Условия хранения. При температуре от 2 до 8°С - в течение 3 сут. При необходимости длительного хранения замораживают материал при температуре ниже минус 40°С.

Условия транспортирования. При температуре от 2 до 8°С - в течение 3 сут. В замороженном виде - в сосуде Дьюара или термоконтейнере с сухим льдом.

Если птицу необходимо оставить живой (представители редких видов), у нее после отлова берут мазки из клоаки.

Яйца птиц забирают из гнезда (не более 50% кладки), маркируют и помещают в пластиковые емкости с углублениями для яиц, перекладывая ватой. Емкости помещают в металлический контейнер и доставляют в лабораторию.

Условия хранения. В течение 3 сут хранят при температуре от 2 до 8°С. При необходимости длительного хранения содержимое яиц переносят в стерильные пластиковые флаконы с завинчивающимися крышками и замораживают при температуре ниже минус 40°С.

Условия транспортирования. В течение нескольких часов после сбора - при температуре окружающей среды. В течение 3 сут - при температуре от 2 до 8°С. Содержимое яиц - в замороженном виде при температуре ниже минус 40°С в термоконтейнере с сухим льдом.

Фекалии птиц (4-5 г) собирают одноразовыми лопатками (шпателями) в стерильные пластиковые контейнеры (пластиковые флаконы с завинчивающимися крышками).

Условия хранения. При температуре от 2 до 8°С - в течение 3 сут, при температуре минус 40°С - 30 дней.

Условия транспортирования. При температуре от 2 до 8°С - в течение 3 сут. Замороженный материал - в термоконтейнере с охлаждающими элементами при температуре минус 70°С.

Воду и ил собирают в местах гнездовий в прибрежной зоне. Ил (5-10 г) собирают черпаками и переносят в стерильные пластиковые флаконы с завинчивающимися крышками. Воду в объеме 1 л собирают в стерильные пластмассовые бутылки с завинчивающимися крышками. Контейнеры и бутылки маркируют и помещают в металлический контейнер с поглощающим материалом, количество которого должно быть достаточным для адсорбции содержимого в случае нарушения целостности транспортной тары.

Условия хранения. При температуре от 2 до 8°С.

Условия транспортирования. При температуре от 2 до 8°С.

При заборе проб органов используют стерильный хирургический инструмент (ножницы, скальпели, пинцеты) и стерильную посуду.

Внутренние органы (фрагменты трахеи, легких, селезенки, мозга, синусы, воздухоносные мешки, кишечник) от забитой или павшей птицы, птенцов, а также мелких млекопитающих получают при вскрытии животных. Перед вскрытием тушку погружают в дезинфицирующий раствор (5% хлорамин Б) на 20-30 с. При взятии проб органов животных место будущего разреза обрабатывают 5%-м раствором йода или 70%-м раствором этилового спирта и стерильными инструментами разрезают кожу, мышцы брюшной стенки или кости черепа. Разрез стенки брюшной полости делают "фартуком", доводя боковые линии разреза по ребрам выше уровня сердца, и откидывают образовавшийся лоскут, чтобы обнажить внутренние органы. Перед взятием головного мозга срезают всю затылочную часть черепа. С помощью второго набора инструментов отсекают кусочки внутренних органов размером от небольшой горошины до лесного ореха, над пламенем горелки укладывают пробы в стерильные одноразовые пластиковые пробирки или контейнеры, герметично закрывают.

Условия хранения. Замораживают при температуре ниже минус 40°С.

Условия транспортирования. В замороженном виде - в сосуде Дьюара или термоконтейнере с сухим льдом.

Мазки-отпечатки, полученные со слизистой оболочки верхних дыхательных путей (лучше) и внутренних органов, готовят на чистых обезжиренных эфиром предметных стеклах, к которым прижимают слизистые или свежие срезы органов. Препараты высушивают на воздухе и фиксируют в течение 20 мин в охлажденном от 2 до 8°С химически чистом ацетоне. Помещают в штативы для предметных стекол (на ребро). Делают пометку, что мазки фиксированы.

Условия хранения. При температуре от 2 до 8°С в течение недели, при температуре минус 20°С - до 6 мес.

Условия транспортирования. При температуре от 2 до 8°С.

Температура ниже минус 40°С обеспечивается в сосуде Дьюара, наполненном жидким азотом (минус 196°С) или в термоконтейнере с сухим льдом (минус 70°С).

Транспортирование образцов осуществляют в соответствии с СП 1.2.036-95. Термоконтейнер и сосуд Дьюара обертывают бумагой (обшивают материалом), ошнуровывают, опечатывают и транспортируют в лабораторию с нарочным. К доставляемому материалу прилагают сопроводительное письмо, акт упаковки. На термоконтейнере и сосуде Дьюара должен быть особый знак (ярлык с отметкой) "Опасно! Не открывать во время перевозки". Если предполагается хранение и транспортирование материала в сосуде Дьюара или в термоконтейнере с сухим льдом, для забора материала используют герметичные пластиковые контейнеры, устойчивые к низким температурам, или криопробирки. Сосуды Дьюара и контейнеры с сухим льдом запрещается закрывать герметически, чтобы не препятствовать выходу медленно испаряющихся азота или углекислоты.

Перед выездом в полевые условия сосуды Дьюара должны быть проверены в лаборатории на соответствие паспортным данным и пригодность для эксплуатации и перевозки. При заправке, погрузке, выгрузке и переноске сосудов Дьюара необходимо иметь обычную спецодежду, обувь и брезентовые рукавицы, чтобы в случае разлива или разбрызгивания азота исключить возможность попадания его на открытые части тела. При транспортировании сосуды Дьюара должны быть тщательно закреплены, чтобы исключить опрокидывание, разбрызгивание или разлив азота.

Допускается только однократное замораживание и оттаивание любого материала.

5. Методы лабораторных исследований

Лабораторные исследования проводят в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами CП 1.3.1285-03, регламентирующими работу с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности), МУК 4.2.2136-06 "Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА).

Метод флуоресцирующих антител (МФА)

Для МФА используют фиксированные мазки-отпечатки органов животных и слизистых оболочек. Реакцию проводят в соответствии с инструкцией к диагностическому препарату "Флуоресцирующие иммуноглобулины для ранней дифференциальной диагностики гриппа А (Н5)", выпускаемого в ООО "Предприятие по производству диагностических препаратов" ГУ НИИ гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург).

В каждом мазке просматривают не менее 20-25 полей зрения.

Оценку степени яркости свечения вирусных антигенов, окрашенных люминесцирующими иммуноглобулинами, проводят по общепринятой шкале:

++++ (4+) - яркая флуоресценция внутри клеток тканей;

+++ (3+) - умеренная флуоресценция внутри клеток тканей;

++ и + (2+ и 1+) - слабая флуоресценция внутри (или вне) клеток тканей.

Положительным результатом иммунофлуоресцентного исследования является обнаружение в препарате не менее 5-8 клеток ткани органа, имеющих характерные включения со специфической флуоресценцией на три и четыре плюса.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Молекулярно-генетические исследования проводят в соответствии с действующими нормативными документами: МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности"; Рекомендациями ВОЗ по обнаружению вируса гриппа птиц субтипа H5N1 в образцах от людей с подозрением на заболевание (ВОЗ, Женева, август 2007); Инструкцией по применению тест-системы для выявления РНК вируса гриппа А и идентификации субтипов Н5 и Н7 методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (например, наборы "АмплиСенс Influenza virus A H5N1-FL" или "ГРИПП", производство ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора).

Набор "ГРИПП" позволяет выявлять РНК вируса гриппа А и идентифицировать субтипы Н5 и Н7 в материале от павших и больных животных и объектах окружающей среды. Материалом для исследования являются: помёт, мазки из клоаки и трахеи, внутренние органы (фрагменты трахеи и легких, селезенка, мозг), вода, смывы с яиц и белок яйца. Тест-система включает комплекты реагентов: для экстракции РНК, для получения кДНК на матрице РНК, для амплификации участков кДНК (проведения ПЦР) и детекции фрагментов амплификации в форматах электрофоретического анализа и гибридизационно-флуоресцентной детекции (FEP и FRT), а также содержит контрольные образцы.

Набор "АмплиСенс Influenza virus A H5N1-FL" позволяет выявлять РНК вируса гриппа А и идентифицировать субтип H5N1 в материале от павших и больных животных и объектах окружающей среды. Материалом для исследования являются: помёт, мазки из клоаки и трахеи, внутренние органы (фрагменты трахеи и легких, селезенка, мозг), вода, смывы с яиц и белок яйца. Тест-система включает комплекты реагентов: для экстракции РНК, для получения кДНК на матрице РНК, для амплификации участков кДНК (проведения ПЦР) и детекции фрагментов амплификации в форматах гибридизационно-флуоресцентной детекции (FЕP и FRT), а также содержит контрольные образцы.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Для исследования используют индивидуальные сыворотки крови птиц без признаков гемолиза и бактериальной контаминации объемом 0,3-0,5 мл. Постановку реакции осуществляют согласно временному наставлению по применению набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц (ВГП) иммуноферментным анализом (например, "Набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц методом ИФА" пр-во НПП "АВИВАК").

Учет результатов проводят на спектрофотометре при длине волны 492 им (при использовании ОФД) или 450 нм (при использовании ТМБ).

Все этапы инкубации проводят в течение 30 мин при температуре 20-30°С.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко