Приложение. Основные методы, используемые для определения биохимических свойств Ps. аeruginosa

Приложение

Основные методы, используемые для определения биохимических свойств Ps. аeruginosa

1. Определение продукции пиоцианина. Исследуемую культуру засеять в пробирку с 4,0 мл жидкой питательной средой (мясопептонный бульон, бульон Хоттингера, 1% пептонную воду) и инкубировать в течение 18-24 часов при 37°С. При слабом помутнении бульона, отсутствии придонного роста и поверхностной серебристой пленки необходимо продолжить инкубирование культуры в термостате до 3-х суток. Затем к бульонной культуре добавить 1-1,5 мл хлороформа и довести рН до 7,8-8,0, после чего пробирку сильно встряхнуть. Синее окрашивание осевших на дно капель хлороформа свидетельствует о наличии пиоцианина и является абсолютным доказательством принадлежности данного микроорганизма к виду Ps. aeruginosa.

2. Цитохромоксидазный тест.

а) Приготовить смесь, состоящую из 3-х частей 1% водного раствора диметилпарафенилендиамина гидрохлорида (или парааминодиметиланиланилина гидрохлорида или оксалата) и 2-х частей 1% спиртового раствора -нафтола. Приготовленную смесь нанести каплями на выросшие на чашке колонии. Колонии, образующие фермент цитохромоксидазу, в течение 20-30 секунд становятся темно-синими.

б) Суточную агаровую культуру нанести в виде штриха платиновой петлей или стеклянной палочкой на диски или полоски фильтровальной бумаги (ватман 3ММ), пропитанные смесью, состоящей из тетраметилпарафенилендиамина дигидрохлорида - 3 части и -нафтола - 2 части. При положительной реакции появляется синяя окраска в течение 30 секунд.

3. Окисление глюкозы. Для определения способности культур синегнойной палочки к окислительному усвоению глюкозу (окисление без ферментации) исследуемую культуру засеять в 2 пробирки с 4 мл среды Хью Лейвсена или Гисса с глюкозой, в одну из которых предварительно наслаивают 0,5 мл стерильного вазелинового масла. Пробирки инкубировать в течение 24-48 часов, хотя положительная реакция, сопровождающаяся изменением цвета индикатора, в подавляющем большинстве случаев отмечается в первые сутки. Штаммы синегнойной палочки образуют кислоту без газа в аэробных условиях, в анаэробных условиях ферментации углевода нет.

4. Гидролиз (разжижение) желатины.

а) Исследуемую культуру петлей засеять уколом в столбик питательной желатины. Инкубировать при температуре 22°С в течение 30 дней с ежедневным наблюдением за ростом и наличием эффекта разжижения.

б) Культуру засеять уколом в столбик питательной желатины и инкубировать при 37°С в течение 14 дней. Каждые 2-3 дня пробирку с культурой охлаждать в холодильнике в течение 2 часов и наблюдать наличие разжижения. Параллельно с опытной пробой все те же манипуляции провести с контрольной пробиркой со столбиком желатины, не засеянной тест-культурой.

в) Культуру засеять на косяк или чашку с желатиновым агаром и инкубировать в течение 3-х дней при 37°С. Затем поверхность агара с областью бактериального роста оросить (смочить) 5-10 мл 1% раствора ртутно-хлористой кислоты. Образовавшаяся вокруг выросшей культуры светлая зона свидетельствует о наличии области гидролиза желатины.

5. Восстановление нитратов.

а) Культуру петлей засеять в нитратный бульон и инкубировать в течение 5 суток. Отмечать любое появление газа в поплавке. Добавить 1 мл нитрит-реагента А, затем 1 мл реагента В (Реагент А - 0,8% раствор сульфаниловой кислоты в 5н уксусной кислоте; Реагент В - 0,6% раствор диметил--нафтиламина в 5н уксусной кислоте или 0,5% в 5н уксусной кислоте; реагенты смешиваются путем легкого нагревания). Красное окрашивание, появившееся после добавления этих реагентов, указывает на присутствие нитритов и выявляет восстановление нитратов. Если красное окрашивание не появляется в течение 5 минут, в пробирку добавить порошкообразный цинк (5 мг на 1 мл) и дать постоять. Наличие красного окрашивания свидетельствует о присутствии нитрата в среде, т.е. его восстановления микроорганизмом не произошло. Если красное окрашивание отсутствует, это указывает на восстановление нитратов до нитритов с дальнейшей редукцией последних до газообразного азота. 5-дневная инкубация в ряде случаев необязательна. Необходимо лишь ежедневно испытывать исследуемый образец и повторно инкубировать в случае восстановления нитрата.

б) Brough использовал небольшие объемы (1 мл в пробирке размерами 75X10 мм) среды (0,1% в питательном бульоне), которую необходимо нагреть до 37°С перед засевом густой суспензии исследуемой культуры и после этого быстро помещать в водяную баню при 37°С. Через 15 минут испытывают, добавляя 3 капли сульфанилового и 3 капли -нафтиламинового реагентов.

в) Микрометод. Приготовить суспензии из предварительно выраженных в течение 18-24 часов на одной из плотных питательных исследуемых штаммов и добавить 0,04 мл их к смеси следующего состава: 0,05% - 0,04 мл, 0,025М фосфатный буфер рН = 6,8 - 0,04 мл. Полученную смесь инкубировать в водяной бане при 37°С в течение 1 часа, после чего добавить 0,06 мл реагента А для испытания нитритов и 0,06 мл реагента В (диметил--нафтиламина). Встряхнуть и наблюдать 1-2 минуты за появлением розового окрашивания, свидетельствующего о наличии нитритов. При осуществлении этой реакции в качестве контрольного используется образец без добавления микробной взвеси для исключения наличия примесей нитритов в субстрате.

6. Восстановление нитритов.

Суточную агаровую тест-культуру засеять петлей в нитритный бульон (0,1% в питательном бульоне) и инкубировать в течение 7-12 дней. Затем добавить реагенты, рекомендованные выше для выявления нитритов. В случае появления красного окрашивания реакция отрицательная. Отсутствие окрашивания указывает на восстановление нитритов данным микроорганизмом.

Рекомендуемые питательные среды

1. Среды с желатиной

а) Желатиновый агар

Желатина	- 4,0 г
Дистиллированная вода	- 100 мл
Питательный агар	- 1000,0 мл

Желатину поместить в дистиллированную воду и оставить для набухания на 15-30 минут. Медленно нагревая, растворить желатину и раствор прибавить к расплавленному питательному агару. Довести рН до 7,0, разлить в пробирки по 5,0 мл и стерилизовать при 115°С в течение 20 минут.

б) Питательная желатина:

Мясной экстракт	- 3,0 г
Пептон	- 5,0 г
Желатина	- 120,0 г
Вода дистиллированная	- 1000,0 мл

Добавить желатину к воде и оставить для набухания в течение 15-30 минут. Медленно нагревая, растворить желатину, добавить и растворить остальные компоненты среды. Довести рН до 7,0, разлить по 5,0 мл в пробирки и стерилизовать при 115°С в течение 20 минут.

2. Среда для усиления пигментообразования:

Среда Кинг А (для образования пиоцианина)

Пептон	- 20 г
Глицерин	- 10 г
Калий сернокислый	- 10 г
Магний хлористый	- 1,4 г
Агар-агар	- 20 г
Вода дистиллированная	- 1000 мл

Среду стерилизуют при 115°С в течение 20 минут

3. Среда с ацетамидом

Натрий хлористый	- 5,0 г
Магний сернокислый	- 0,2 г
Аммоний фосфорнокислый однозамещенный	- 1,0 г
Калий фосфорнокислый двузамещенный	- 1,0 г
Ацетамид	- 20,0 г
Агар-агар	- 15,0 г
Вода дистиллированная	- 1000,0 мл

Стерилизовать в автоклаве при 120°С 20 минут

Тесты для определения аргининдегидролазы, лизиндекарбоксилазы и орнитиндекарбоксилазы:

Полоски бумаги (ватман 3 М) размером 0,5X5,0 см пропитываются 0,03 М растворами аминокислот и подсушиваются.

Аргинин-HCl - 63 мг + 10 мл	фосфатного буфера 0,0125М рН = 5,0
Лизин-НСI - 54 мг + 10 мл	То же
Орнитин-HCl - 40 мг + 10 мл	-"-

Приготовление фосфатного буфера:

1,19 г мл диcт. воды (I) 1/15 М р-р

900 мг мл диcт. воды (II) 1/15 М р-р

2 мл (I) + 18 мл (II) - фосфатный буфер рН 5,91 (III) 1/15 М

10 мл (III) + 40 мл диcт. воды - 50 мл 0,0125 М р-р рН = 5,0

Ход реакции:

Приготовить густую суспензию исследуемой культуры и разлить ее в 3 агглютинационные пробирки. Затем в эти пробирки поместить бумажные полоски, пропитанные соответственно аргинином, лизином или орнитином и инкубировать при 37° С в термостате в течение 2-х часов, после чего в каждую пробирку добавить по 1-2 капли 0,04% раствора индикатора бромкрезол-пурпура. В случае ферментации аминокислоты окраска фильтровальной бумажки становится фиолетовой, в отрицательном случае - желтой.

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

5. Среда Хью Лейвсена

Пептон	- 2,0 г
Натрий хлористый	- 5,0 г
Калий фосфорнокислый двузамещенный	- 0,3 г
Агар-агар	- 3,0 г
Вода дистиллированная	- 1000,0 мл
Бромтимоловый голубой	- 15,0 мл 0,2% водного раствора.

Стерилизовать при 115°С 20 минут. Добавить стерильный раствор глюкозы (или другого углевода) до концентрации 1%, тщательно смешать и разлить по 10 мл в пробирки диаметром не более 10 мм.

6. Селективная среда для выделения культур Ps. aeruginosa

(А.Ф. Мороз, Б.М. Бекбергенов, Г.Е. Афиногенов, 1976)

Пептон ферментативный	- 20,0 г
Калий сернокислый	- 7,0 г
Магний хлористый	- 1,5 г
Магний сернокислый	- 1,5 г
N-цетилпиридиний хлорид (Киевский з-д РИАП)	- 2,0 г
Агар-агар	- 10,0 г
Вода дистиллированная	- 1000,0 мл
	рН = 6,8-7,0

Среду довести до кипения, кипятить 2-3 минуты и разлить по чашкам.

Дифференциально-диагностические тесты бактерий рода Pseudomonas

Вид бактерий		Ps. aeruginosa	Ps. fluorescens	Ps. cepacia	Ps. putida	Ps. stutzeri	Ps. maltophilia	Ps. diminuta	Ps. mallei	Ps. pseudomallei	Ps. alcaligenes
Тест
Подвижность		+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Пиоцианин		+	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Флуоресцеин		+	+	-		-	+	-	-	-	-
Оксидаза (индофенолаксидаза)		+	+	+	+	+	-	+	+		+
Разжижение желатины		+	+		-	-	+	+	-	+
Гемолиз		+		-	-	-	-	-	-		-
Рост при 5°С		-	+	-			-	-	-	-	-
Рост при 42°С		+	-		-	-	+	-	-	+	+
Рост на ацетамидном агаре		+	-	+	-	-	-	-	-	+
Образование кислоты из углеводов	Глюкоза	+	+	-	+	+	+	-	+	+	+
	Лактоза	-	-	+	-	-	-	-		+	-
	Маннит		+	+		+	-	-	+	+	-
	Мальтоза	-				+	-		+
	Галактоза		+	+	+	+	-	-	+	+	-
	Фруктоза		+		+	+	+	-	+	+	-
Восстановление нитратов до нитритов		+	-		-			-
Восстановление нитратов до азота		+	-	-	-	+	-	-	-	+	-
Аргининдегидролаза		+	+	-	+	-	-	-	+	+	-
Лизиндекарбоксилаза		-	-	+	-	-	+	-	-	-	-
Орнитиндекарбоксилаза		-	-		-	-	-	-	-	-	-