Приложение 6.1.1. Оценка острой токсичности при внутрижелудочном поступлении методом фиксированной дозы

Приложение 6.1.1

Оценка острой токсичности при внутрижелудочном поступлении методом фиксированной дозы

Идентичен международному документу OECD TG N 420 "Acute Oral Toxicity - Fixed Dose Procedure" (ОЭСР Руководство N 420 "Острая токсичность при внутрижелудочном поступлении - метод фиксированной дозы"). Международный документ принят 17 декабря 2001 года. Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает требования к исследованию острой токсичности при внутрижелудочном поступлении химических веществ и препаратов из них методом фиксированной дозы.

1.2. Метод обеспечивает получение информации об острой токсичности вещества при проглатывании и позволяет оценить и классифицировать его в соответствии с СГС.

2. Общие положения

2.1. Метод исследования острой токсичности основан на введении животным серий фиксированных доз. Данный подход позволяет избежать смерти животных как конечной точки эксперимента и основывается на наблюдении явных признаков токсичности в одной из серий введенных фиксированных доз.

2.2. Проведению испытания должен предшествовать анализ информации об исследуемом веществе. Такая информация включает сведения о составе и химическом строении вещества; его физико-химических свойствах; результатах токсикологических испытаний in vivo и in vitro; а также токсикологические данные по структурно родственным веществам и предполагаемые пути использования вещества. Эта информация нужна для подтверждения того, что испытание является необходимым для защиты здоровья человека и способствует выбору подходящей начальной дозы.

2.3. Принцип метода заключается в том, что в основной части исследования используются только средние токсичные дозы, введение которых, как ожидается, не может привести к летальному исходу. Исследуемые вещества не должны также применяться в дозировках, которые являются причиной возникновения выраженных болевых ощущений и недомоганий, оказывая разъедающее или сильно раздражающее действие. Агонизирующие животные или животные, испытывающие непереносимую боль или находящиеся в безнадежном физическом состоянии, должны быть умерщвлены гуманным способом и учтены при подведении результатов исследования так же, как и животные, погибшие во время исследования.

2.4. Принцип тестового метода заключается в том, что группе животных одного пола, используя пошаговую процедуру, дают фиксированные дозы 5, 50, 300 и 2 000 мг/кг (в особых случаях можно рассматривать дополнительную фиксированную дозу 5 000 мг/кг). Начальная доза подбирается на основе прицельного исследования, так как доза предполагает воспроизведение некоторых признаков токсичности, не причиняя сильных токсических действий или летального исхода. В зависимости от наличия или отсутствия признаков токсичности или летального исхода группам животных вводятся более высокие либо низкие дозы. Процедура продолжается до тех пор, пока доза не приведет к выраженной токсичности или пока не будет зафиксирован один случай смерти, а также до тех пор, пока не будет наблюдаться отсутствие реакции при введении наибольшей дозы или пока не наступит смерть при наименьшей дозе.

3. Описание тестового метода

3.1. Животные

Выбор вида

3.1.1. Наиболее предпочтительным видом грызунов является крыса, вместе с тем возможно использование и других видов грызунов. В основном используются женские особи, так как они являются более чувствительными к воздействию токсикантов. Однако если токсикологические и токсикокинетические данные для структурно родственных веществ показывают, что мужские особи являются более чувствительными, следует использовать животных данного пола. Проведение испытания с использованием мужских особей должно быть научно обосновано.

3.1.2. В эксперименте должны быть использованы здоровые молодые половозрелые особи обычных исследованных лабораторных линий. Женские особи не должны быть беременными или рожавшими. Каждое животное на момент начала эксперимента должно быть в возрасте от 8 до 12 недель, а его масса должна составлять от средней массы ранее исследованных животных.

Условия содержания и кормления

3.1.3. Температура в лабораторной комнате должна составлять . Относительная влажность должна быть как минимум 30% и не превышать 70%, за исключением времени уборки комнаты; оптимальное значение 50-60%. Освещение должно быть искусственным в последовательности: 12 часов - свет, 12 часов - темнота. При кормлении может быть использована обычная лабораторная диета с неограниченным количеством питьевой воды. Животных можно содержать группами в клетках в зависимости от дозы, однако количество животных в клетке не должно препятствовать наблюдению за каждым из них.

Подготовка

3.1.4. Животные должны быть разделены на группы методом случайной выборки, помечены и содержаться в клетках не менее пяти дней до начала введения тестируемого вещества, что позволит им привыкнуть к лабораторным условиям.

3.2. Процедура испытания

Приготовление доз

3.2.1. Изучаемое вещество вводится фиксированными объемами в диапазоне испытуемых доз путем изменения концентрации доз. Изучаемые продукты в жидком состоянии целесообразно использовать для тестирования без разбавления, т.е. в фиксированной концентрации, это может быть важно для последующей оценки риска использования вещества. Максимальный разовый объем жидкости зависит от размера подопытного животного. Вводимый грызунам объем не должен превышать 1 мл/100 г массы тела: между тем, в случаях с водными растворами объем дозы может составить 2 мл/100 г массы тела. В любом случае, максимальный объем вводимой дозы не должен быть превышен. Рекомендуется использовать водные растворы/суспензии/эмульсии химических продуктов, для продуктов, нерастворимых в воде, - другие растворители, отдавая предпочтение растворам/суспензиям/эмульсиям на масляной основе (растительные масла). В случае использования разбавителя (растворителя), не являющегося водой, его токсикологические характеристики должны быть известны. Дозы должны быть приготовлены незадолго до введения с учетом стабильности изучаемого препарата в период исследования.

Введение дозы

3.2.2. Испытываемый препарат вводится разовой дозой через зонд: желудочную трубку или интубационную канюлю. Если введение разовой дозы невозможно, доза может быть введена частями в период, не превышающий 24 часа.

3.2.3. Перед введением дозы животных необходимо ограничить в пище (т.е. крыс не кормить с вечера перед введением дозы, но поить; мышей не кормить три-четыре часа перед введением дозы, но поить). После голодания необходимо взвесить животных, затем ввести испытываемое вещество. После введения препарата крыс не кормить три-четыре часа, мышей - один-два часа. Если доза вводится порционно, в зависимости от периода введения дозы животным может потребоваться корм или питье.

3.3. Предварительное исследование

3.3.1. Целью предварительного исследования является подбор подходящей начальной дозы для основного исследования. Изучаемый препарат вводится одному животному последовательно в соответствии со схемой 6.1.1.1. Предварительное исследование завершается, когда может быть принято решение относительно начальной дозы для основного испытания (или если при минимальной установленной дозе отмечается смерть).

3.3.2. Начальная доза для предварительного исследования подбирается из установленных уровней доз (5, 50, 300 и 2 000 мг/кг) как доза, которая может оказаться токсичной на основе исследований данного препарата или структурно родственных веществ в опытах in vivo или in vitro. При отсутствии такой информации начальная доза составляет 300 мг/кг.

3.3.3. Между введением каждой дозы должно проходить, как минимум, 24 часа. Все животные должны наблюдаться в течение, как минимум, 14 дней.

3.3.4. В исключительных случаях, и только, когда это оправдано определенными условиями, может быть рассмотрено исследование дополнительного установленного уровня дозы в 5 000 мг/кг (раздел 3.6).

3.3.5. Из соображений гуманного отношения к животным исследования доз (2 000-5 000 мг/кг - класс 5 СГС) нецелесообразны и могут проводиться, только если результаты подобных исследований имеют значение для здоровья животных или человека.

3.3.6. В случаях, когда животное при самом низком установленном уровне дозы (5 мг/кг) в предварительном исследовании умирает, необходимо закончить исследование и присвоить веществу класс 1 согласно классификации СГС (схема 6.1.1.2). Однако если требуется дальнейшее подтверждение классификации вещества, необязательное дополнительное исследование может быть проведено следующим образом. Второе животное тестируется с использованием дозы 5 мг/кг. Если второе животное умирает, то класс 1 СГС подтверждается, и исследование немедленно завершается. Если второе животное выживает, то проводится дополнительное исследование на трех животных с использованием дозы 5 мг/кг. Поскольку в данном случае существует высокий риск смертности, дозировку проводят последовательным способом из соображений бережного отношения к животным. Временной интервал между дозированием каждого животного должен быть достаточным, чтобы установить, что предыдущее животное, вероятно, выживет. Если происходит вторая смерть, то последовательность дозирования должна быть немедленно завершена, и в дальнейшем тестирование на животных не проводится. Поскольку возникновение второй смерти (независимо от числа животных, протестированных ко времени завершения эксперимента) совпадает с результатом А (два или более смертельных случая), следует придерживаться правила классификации при установленной дозе 5 мг/кг (класс 1, если есть два или более смертельных случая, или класс 2 - не более одного смертельного исхода).

3.4. Основное исследование

3.4.1. Шаги, которые необходимо предпринять после исследования с начальным уровнем дозы, показаны в схеме 6.1.1.2. Необходимо проведение одного из трех действий:

- прекратить испытание и определить соответствующий класс опасности;

- провести испытание с более высоким уровнем дозы;

- провести испытание с меньшим фиксированным уровнем дозы.

3.4.2. Однако в целях защиты животных уровень дозы, который явился причиной смерти животного в предварительном исследовании, повторно в основном исследовании не рассматривается. Исследования показали, что наиболее вероятным результатом испытания с начальным уровнем дозы будет возможность классификации вещества и отсутствие необходимости проводить дальнейшие исследования.

3.4.3. В общей сложности пять животных одного пола следует использовать при проведении эксперимента с каждым уровнем доз. Из пяти животных в группе отбирается одно животное из предварительного исследования с выбранным уровнем дозы и четыре дополнительных животных (за исключением нестандартных случаев, когда рассматриваемый уровень дозы в основном испытании не был включен в предварительное исследование).

3.4.4. Временной интервал между приемом доз каждого уровня определяется началом, продолжительностью и тяжестью токсических признаков. Исследование животных со следующей дозой должно быть отложено до тех пор, пока не выживет одно из животных, принявших предыдущую дозу. Между принятием доз каждого уровня рекомендуется делать перерыв в три или четыре дня, если необходимо, для возможности наблюдения замедленной токсичности. Временной интервал может быть установлен как адекватный, например, в случае неубедительного ответа (реакции).

3.5. Испытание предельной дозы

3.5.1. Испытание предельной дозы проводится в случаях, когда исследователь обладает информацией о том, что вещество, вероятно, не является токсичным, например, обладает токсичностью только в дозах, превышающих предельные уровни. Информация о токсичности исследуемого вещества может быть получена из данных об исследовании родственных по физико-химическим свойствам веществ, смесей или продуктов с учетом того, что имеет значение наличие и процентное содержание компонентов. В тех случаях, когда информация о токсичности препарата отсутствует или недостаточна, или когда исследуемый препарат, вероятно, является токсичным, необходимо проводить основное исследование.

Схема 6.1.1.1. Предварительное исследование

Схема 6.1.1.1. Предварительное исследование (продолжение)

3.5.2. Используя обычную процедуру, начальное изучение препарата в дозе 2 000 мг/кг (в особых случаях 5 000 мг/кг) вещества в предварительном испытании с последующим тестированием других четырех животных является исследованием предельной дозы.

3.6. Исследования доз свыше 2 000 мг/кг

3.6.1. В исключительных случаях, и только когда это оправдано определенными рекомендациями, может быть рассмотрено исследование дополнительного установленного уровня дозы в 5 000 мг/кг. Из соображений защиты животных исследования доз, относящихся к классу 5 СГС (2 000-5 000 мг/кг), нежелательны и могут проводиться, только если результаты подобных исследований имеют значение для здоровья животных или человека.

3.6.2. Предварительное исследование. Правила проведения последовательной процедуры, представленные в схеме 6.1.1.1, также включают уровень доз 5 000 мг/кг. Таким образом, при использовании в предварительном исследовании в качестве начальной дозы 5 000 мг/кг в случае результата А (смерть) необходимо провести исследование второго животного с дозой 2 000 мг/кг; результатов В и С (явная токсичность или отсутствие токсичности) позволят выбрать для основной части исследования начальную дозу 5 000 мг/кг. Аналогично, если в качестве начальной дозы не используется доза 5 000 мг/кг, в случае результатов В и С при 2 000 мг/кг исследуется уровень дозы 5 000 мг/кг; последующий результат А при 5 000 мг/кг будет определять начальную дозу 2 000 мг/кг основной части исследования и результаты В и С - начальную дозу для основного исследования 5 000 мг/кг.

3.6.3. Основное исследование. Правила проведения последовательной процедуры, представленные в схеме 6.1.1.2, также включают уровень доз 5 000 мг/кг. Таким образом, при использовании в основном исследовании в качестве начальной дозы 5 000 мг/кг в случае результата А ( смертей) необходимо провести исследование второй группы с дозой 2 000 мг/кг; результата В (явная токсичность или смерти) или С (отсутствие токсичности) вещество не будет классифицировано по системе СГС. Аналогично, если используется начальная доза, отличная от 5 000 мг/кг, испытание продолжается с дозой 5 000 мг/кг в случае результата В при 2 000 мг/кг; последовательный результат А при 5 000 мг/кг приведет к отнесению вещества к классу 5 по СГС, а результаты В и С не позволят классифицировать вещество.

3.7. Критерии для классификации исследуемых веществ с ожидаемыми величинами , превышающими 2 000 мг/кг, без необходимости проведения испытания

3.7.1. Критерии для определения класса опасности 5 призваны идентифицировать исследуемые вещества, относящиеся к относительно низкому классу острой токсической опасности, но при определенных условиях представляющие опасность для более уязвимых популяций. Для этих веществ уровень предположительно находится в диапазоне концентраций 2 000-5 000 мг/кг при пероральном или накожном воздействии и эквивалентных концентраций для других путей воздействия. Исследуемые вещества могут быть отнесены к данному классу опасности, определяемому дозами: 2 000 мг/кг < < 5 000 мг/кг (класс 5 в СГС), в следующих случаях:

а) если отнесены к этому классу согласно любой схеме испытания на основании смертельных исходов;

б) если получены надежные доказательства, указывающие на отнесение к классу 5; или если другие исследования на животных или случаи острого токсического воздействия на человека свидетельствуют о влиянии на здоровье человека;

в) если посредством экстраполяции, оценки и измерения данных нет показаний к отнесению к классу более высокой опасности, и:

- доступна надежная информация, указывающая на значительную токсичность для человека, или

- наблюдался любой смертельный исход, зарегистрированный во время испытания веществ, входящих в классы опасности до класса 4, и вводимых перорально, или

- если экспертная оценка подтверждает наличие клинических признаков токсичности при тестировании с дозами, превышающими указанные в классе 4, кроме случаев диареи, пилоэрекции или вялости, или

- в случаях, когда экспертная оценка подтвердит надежность информации, указывающей на потенциальную значимость выраженного воздействия из других исследований на животных.

Схема 6.1.1.2. Основное исследование

Схема 6.1.1.2. Основное исследование (продолжение)

3.8. Наблюдение

3.8.1. Экспереминтальные животные должны наблюдаться индивидуально после введения дозы не менее одного раза в первые 30 минут, регулярно в течение первых 24 часов, причем особое внимание следует уделять первым четырем часам, и затем ежедневно в течение 14 дней, кроме случаев, когда они должны быть выведены из исследования и умерщвлены гуманным способом по медицинским показаниям или найдены мертвыми. Длительность наблюдения не должна быть жестко зафиксирована. Она зависит от токсических реакций, начала и длительности периода восстановления; таким образом, наблюдение при необходимости может быть продолжено. Необходимо зафиксировать время появления и исчезновения симптомов токсичности, особенно если есть тенденция к замедленному возникновению токсических симптомов. Наблюдения, включающие отдельные отчеты о каждом животном, систематически регистрируются.

3.8.2. Дополнительное наблюдение может потребоваться, если признаки токсичности у животных не исчезают. В ходе наблюдений фиксируются изменения в коже и шерсти, в глазах и слизистых, в респираторной, кровеносной, вегетативной и центральной нервной системах, нарушения в соматомоторике и поведении. Внимание должно фокусироваться на явлениях тремора, конвульсий, слюноотделения, диареи, летаргии, сна и комы. Агонизирующие животные или животные, испытывающие непереносимую боль или находящиеся в безнадежном физическом состоянии, должны быть умерщвлены гуманным способом. Если животные умерщвлены из соображений гуманности или найдены мертвыми, время смерти должно быть зафиксировано максимально точно.

Масса тела

3.8.3. Масса тела животного должна быть установлена незадолго до введения тестируемого вещества и контролироваться не менее чем раз в неделю после испытания. Изменения в массе тела должны быть вычислены и зафиксированы. Выжившие по окончании испытания животные должны быть взвешены и умерщвлены гуманным способом.

Патологическая анатомия

3.8.4. Всех подопытных животных (включая погибших во время испытаний, а также исключенных по медицинским показателям) необходимо подвергнуть общей аутопсии. Для каждого животного должны быть зарегистрированы все общие патологические изменения. Следует учитывать также результаты микроскопического анализа органов у животных, проживших 24 и больше часов после первого приема тестируемого вещества.

4. Данные и отчет

4.1. Данные

4.1.1. На каждого животного должны быть собраны данные. Кроме того, все данные должны быть оформлены в виде таблиц на каждую подопытную группу, содержащих сведения о количестве животных, демонстрирующих признаки токсичности, количестве животных, погибших во время испытания или умерщвленных из соображений гуманности, время смерти каждого животного, описание и временной график токсического действия и восстановления, результаты вскрытия.

4.2. Отчет

Отчет об исследовании должен содержать следующую информацию.

Исследуемое вещество:

- физическая природа, чистота и, при необходимости, физико-химические свойства (включая изомеризацию);

- идентифицирующие данные, включая CAS-номер.

Растворитель (если используется):

- обоснование выбора растворителя в случае, если это не вода.

Подопытные животные:

- вид/род;

- микробиологический статус животных, если таковой известен;

- количество, возраст и пол животных (включая обоснование предпочтения самцов самкам);

- происхождение, условия содержания, кормление и пр.

Условия испытания:

- технология приготовления испытываемого вещества (включая физические параметры используемых компонентов);

- подробности о введении тестируемого вещества, включая дозировку, объем и время приема;

- подробности о качестве корма и воды (включая способ/источник корма и воды);

- обоснование выбора начальной дозы.

Результаты отражают в отдельных таблицах:

- реакцию каждого подопытного животного на уровень введенной дозы вещества (т.е. животных с признаками интоксикации, в т.ч. летальный исход, изменение основных свойств, интенсивность и продолжительность токсикологически значимого эффекта);

- вес тела и изменения в весе тела;

- индивидуальную массу тела животного в день введения вещества, спустя неделю после введения вещества, на момент гибели или умерщвления;

- дату и время гибели, если она произошла раньше запланированного умерщвления;

- временной график появления признаков токсичности, сведения об обратимости признаков токсичности для каждого животного;

- результаты вскрытия и результаты гистопатологического исследования для каждого животного, если таковые имеются.

Обсуждение и интерпретация результатов.

Выводы.