Приложение 6.7.10. Совместное исследование токсичности при повторном воздействии с репродуктивной/эмбриональной токсичностью (скрининговый метод)

Приложение 6.7.10

Совместное исследование токсичности при повторном воздействии с репродуктивной/эмбриональной токсичностью (скрининговый метод)

Идентичен международному документу OECD TG N 422 "Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Reproduction/Developmental Toxicity Screening Test" (ОЭСР Руководство N 422 "Совместное исследование токсичности при повторном воздействии с репродуктивной/эмбриональной токсичностью (скрининговый метод)"). Принят 22 марта 1996 г. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает требования к проведению совместного исследования токсичности химических веществ и препаратов на их основе (далее - веществ) при повторном воздействии и репродуктивной/эмбриональной токсичности с помощью скринингового метода. Это исследование дает информацию о возможных опасностях для здоровья, которые могут появиться при повторном воздействии вещества за относительно короткий промежуток времени. Определение токсикологических характеристик вещества при повторном воздействии возможно только после получения информации, полученной в острых опытах.

1.2. Метод состоит из обычного тестирования с повторяющейся дозой, которое может быть применимо для веществ, для которых нельзя использовать 90-дневной тест (например, когда объем производства вещества не превышает определенные пределы), или как предварительное тестирование перед долгосрочным исследованием.

1.3. Метод также включает скрининговый тест на определение репродуктивной/ эмбриональной токсичности и, следовательно, может быть использован для получения предварительной информации о влиянии вещества на мужскую и женскую репродуктивную способность, включая функцию половых желез, брачное поведение, зачатие, развитие эмбриона и роды, либо для оценки токсических свойств веществ на ранней стадии, либо при исследовании веществ, вызывающих озабоченность.

1.4. Метод также делает акцент на неврологических эффектах как одному из видов специфических эффектов, поэтому существует необходимость проводить тщательные клинические наблюдения за животными, чтобы можно было получить как можно больше информации. Этот метод должен определить вещества с нейротоксическим потенциалом, а его результаты могут служить основанием для дальнейшего углубленного исследования данного аспекта. Дополнительно этот метод позволяет первоначально оценить иммунологические эффекты.

1.5. При отсутствии данных других исследований об общетоксическом действии, репродуктивной/эмбриональной токсичности, нейротоксичности и иммунотоксичности положительные результаты этого методы являются полезными для предварительных оценок опасности и способствуют принятию решений о необходимости и срочности проведения дополнительного тестирования. Данный тест может быть очень полезным как часть "Набора данных о скрининговой информации" (Screening Information Data Set (SIDS)) для оценки веществ, по которым существует мало информации, а также может служить альтернативой проведению двух других тестов: по исследованию токсичности при повторном воздействии (OECD TG N 407) и репродуктивной/эмбриональной токсичности (OECD TG N 421). Он также может быть использован как тест для определения диапазона доз для более углубленного исследования или в других уместных случаях.

2. Общие положения

2.1. Часть метода, касающаяся скрининга репродуктивной/эмбриональной токсичности, основана на опыте изучения химических веществ с большим объемом производства и поисковых исследований с позитивным контролем химических веществ. Раздел по исследованию токсичности при повторном воздействии принят в соответствии с OECD TG N 407.

2.2. Обычно считается, что существует разница между чувствительностью беременных и небеременных животных. Следовательно, может быть сложнее определить в этом совместном исследовании уровни доз, которые будут достаточными для определения как общетоксического действия, так и специфической репродуктивной/эмбриональной токсичности, чем когда два разных исследования проводятся раздельно. Более того, интерпретация результатов теста по отношению к общей системной токсичности может быть более трудной, чем когда проводятся раздельные исследования с повторным воздействием, особенно если биохимические и гистологические параметры не оцениваются в исследовании одновременно. Из-за всех технических трудностей существует необходимость в значительном опыте для проведения этого совместного исследования. С другой стороны, не беря во внимание, что используется меньше животных, совместный тест может обеспечить лучшие условия для дифференциации прямых эффектов на репродуктивность и пренатальное развитие и вторичных, обусловленных другими (системными) эффектами.

2.3. Настоящий метод тестирования предполагает пероральный способ введения тестируемого вещества. При использовании другого способа введения требуется обоснование.

2.4. Настоящий метод предполагает более продолжительный период дозирования, чем обычное 28-дневное исследование. Однако он позволяет использовать меньшее число животных каждого пола на группу, чем когда проводится обычный 28-дневный тест совместно с тестом по определению репродуктивной и эмбриональной токсичности.

3. Описание тестового метода

3.1. Принцип тестирования

3.1.1. Исследуемое вещество вводят градуированными дозами нескольким группам мужских и женских особей. Самцам следует давать дозу, как минимум, 4 недели и больше, включая день перед запланированным умерщвлением (включает минимум две недели до спаривания, время спаривания и примерно две недели после). В связи с ограниченным периодом дозирования до спаривания у самцов, фертильность может быть не очень чувствительным показателем тестикулярной токсичности. Следовательно, важно провести детальное гистологическое исследование яичек. Сочетание двухнедельного периода дозирования перед спариванием и последующего наблюдения спаривания/фертильности с общим периодом введения как минимум в 4 недели, за которым следует подробная гистопатология семенников, считается достаточным для обнаружения преобладающего воздействия на оплодотворяющую способность спермы и сперматогенез.

3.1.2. Женские особи должны получать дозы на протяжении всего исследования. Это включает две недели до спаривания (с целью охватить как минимум два астральных цикла), вариабельное время до зачатия, длительность беременности и, как минимум, четыре дня после родов, включая день усыпления.

3.1.3. Длительность исследования после акклиматизации зависит от поведения самок и продолжается не менее 54 дней (как минимум, 14 дней, перед спариванием, до 14 дней спаривания, 22 дня беременности и 4 дня лактации).

3.1.4. В течение периода введения вещества животных тщательно обследуют на предмет выявления признаков токсичности. Животным, которые умерли или были убиты в ходе тестирования, проводится аутопсия. По окончании исследования выживших животных умерщвляют и также проводят аутопсию.

3.2. Животные

Выбор вида

3.2.1. Данная методика предполагает использование крыс. Если используют другие виды животных, нужны соответствующие обоснования. Нельзя использовать виды с низкой плодовитостью или с высокой встречаемостью дефектов развития. В эксперименте должны быть использованы здоровые молодые половозрелые особи обычно используемых лабораторных линий, ранее не подвергавшиеся опытным испытаниям. Для исследования важны: вид, линия, пол, масса и/или возраст подопытных животных. Каждое животное на момент начала эксперимента должно быть в возрасте от 8 до 12 недель, а его масса должна составлять от средней массы исследуемых животных, задействованных в эксперименте. Если исследование проводят в качестве предварительного перед длительным исследованием или перед исследованием на нескольких поколениях, рекомендуется использовать животных одинаковых линий и полученных из одного питомника.

Условия содержания и кормления

3.2.2. Температура в помещении с экспериментальными животными должна быть . Относительная влажность должна быть, как минимум, 30% и не должна превышать 70% (если только не проводится уборка помещения), оптимальная влажность составляет 50-60%. Свет искусственный с последовательностью: 12 часов - свет, 12 часов - темнота. Для кормления могут использоваться традиционные лабораторные диеты с неограниченным количеством питьевой воды. На выбор пищи может влиять необходимость добавления к ней исследуемого вещества, когда введение осуществляется таким способом.

3.2.3. Животные могут находиться отдельно или содержаться в клетках небольшими группами одного пола; при групповом расселении следует помещать не более 5 животных в каждую клетку. Процедура спаривания должна осуществляться в подходящих для такого случая клетках. Беременных самок следует селить отдельно и обеспечить их материалами для гнездования.

Подготовка

3.2.4. Здоровые молодые половозрелые животные случайным образом распределяются на экспериментальные группы. Клетки надо размещать таким образом, чтобы свести к минимуму возможное влияние на них их местоположения. Животных помечают индивидуальными идентификаторами и содержат в клетках, как минимум, 5 дней перед началом исследования для акклиматизации к лабораторным условиям.

3.3. Процедура испытания

Количество и пол животных

3.3.1. Каждая экспериментальная и контрольная группа должна содержать достаточное количество животных, рекомендуется не менее 10. Исключая случаи, когда токсичность сильно влияет на беременность, ожидается, что из десяти, как минимум, 8 забеременеют, что является минимальным допустимым числом самок на группу.

3.3.2. Целью является получить достаточное количество беременностей и потомства, чтобы гарантировать значимую оценку потенциальной возможности вещества влиять на фертильность, беременность, материнское поведение и поведение грудного потомства, на рост и развитие потомства от зачатия до 4-го дня после родов. Если запланированы усыпление во время исследования, число животных в группе должно быть увеличено. Стоит рассмотреть использование группы-спутника из десяти животных (5 самцов и 5 самок) в контрольной группе и группе с самой высокой дозой для возможности оценки обратимости эффектов, а также для наблюдения за эффектами, как минимум, 14 дней после окончания введения дозы. Животные в этой группе не будут спариваться и, следовательно, не будут использоваться для оценки репродуктивной/эмбриональной токсичности.

Подготовка доз

3.3.3. Исследуемое вещество вводят перорально, если только другой путь введения не считается более подходящим. При пероральном пути исследуемый состав вводят через зонд, при этом в качестве альтернативы исследуемый состав может вводиться с пищей или питьевой водой.

3.3.4. При необходимости, тестируемое вещество растворяют или добавляют в подходящий носитель. Рекомендуется, когда это возможно, в первую очередь использовать водные растворы/суспензии, затем раствор эмульсии в масле (например, кукурузное масло) и затем искать возможное решение с использованием других сред. Для сред, отличных от воды, должны быть известны их токсические свойства. Следует определить стабильность исследуемого вещества в носителе.

Дозирование

3.3.5. В основном необходимо использовать, как минимум, три экспериментальные и одну контрольную группы. Если отсутствует предварительная информация о тестируемом веществе, можно провести исследование по определению диапазона доз. Кроме тех моментов, когда осуществляется введение, необходимо обращаться с животными в контрольной группе так же, как и со всеми остальными. Если вещество вводят в определенной среде, контрольная группа должна получать тот же носитель в самом большом из используемых объемов.

3.3.6. Уровни доз должны выбираться, принимая во внимание любые имеющиеся данные о токсичности и токсикокинетических свойствах исследуемого вещества. Необходимо также принимать во внимание, что может существовать разница между чувствительностью беременных и небеременных самок. Самая высокая доза должна быть выбрана с намерением вызвать токсические эффекты, а не смерть или тяжелые страдания животных. Следовательно, нисходящая последовательность уровней доз должна выбираться с целью выявить какую-либо зависимость ответа от дозы, а также отсутствие вредного эффекта при поступлении самой низкой дозы. Двукратный или четырехкратный диапазон чаще всего являются оптимальными, для очень больших интервалов между дозами (например, с диапазоном более 10) предпочтительно использование четвертой экспериментальной группы.

Испытание предельной дозы

3.3.7. Полное исследование с использованием нескольких уровней доз может не понадобиться, если процедура, описанная в этом руководстве, не дает видимых токсических эффектов при пероральном введении дозы на уровне минимум 1 000 мг/кг веса тела/день, или с эквивалентным содержанием в еде или в питьевой воде, а также, если токсичность не ожидается на основании данных о структурно сходных соединениях. Испытание на предельное содержание проводят только в тех случаях, когда данные о воздействии на людей свидетельствуют о необходимости использования более высокой дозы. При других способах введения, таких как ингаляционный или перкутанный, физико-химические свойства тестируемого вещества могут определять максимальную достижимую для тестирования концентрацию.

Введение доз

3.3.8. Животные должны получать дозу исследуемого вещества ежедневно в течение семи дней в неделю. Когда исследуемое вещество вводится принудительно, это следует делать разовой дозой, используя желудочный зонд или подходящую полую трубку. Максимальный объем жидкости, который может быть введен за один раз, зависит от размеров подопытного животного. Объем не должен превышать 1 мл/100 г, за исключением водных растворов, когда можно использовать 2 мл/100 г. За исключением веществ, вызывающих раздражение или коррозию, которые обычно проявляют более выраженный эффект при более высоких концентрациях, изменения тестируемого объема должны быть минимизированы путем регулирования концентрации для обеспечения постоянного объема при всех уровнях доз.

3.3.9. Для веществ, дозируемых с пищей или питьевой водой, важно, чтобы количество исследуемого вещества в носителе не препятствовало нормальному пищевому и водному потреблению. Когда тестируемое вещество вводится с пищей, могут быть использованы либо постоянная концентрация в пище (мг/кг или ррm), либо постоянный уровень дозы в зависимости от массы тела животного, другое использование должно быть обосновано. Для веществ, вводимых через зонд, доза должна вводиться в одно и то же время ежедневно и корректироваться, как минимум, еженедельно для поддержания постоянного уровня дозы по отношению к массе тела животного. Если настоящее исследование является предварительным перед более продолжительным, одинаковые диеты должны использоваться в обоих случаях.

3.4. Схема исследования

3.4.1. Введение дозы животным обоих полов необходимо начинать, как минимум, за 2 недели до спаривания, после прохождения ими пятидневной акклиматизации. Исследование должно быть запланировано таким образом, чтобы спаривание начиналось сразу, как только животные достигли половой зрелости. Этот период может слегка различаться для разных видов крыс. Самки с потомством должны умерщвляться на 4-й день после родов или вскоре после этого. День родов (т.е. когда роды завершились) считается 0-м днем после родов. Самки, не демонстрирующие признаков беременности, умерщвляются на 24-26 день после последнего дня периода спаривания. Введение доз животным обоих полов продолжается весь период спаривания. Самцам продолжают введение доз после периода спаривания, пока минимальный период дозировки не достигнет 28 дней. Затем их умерщвляют или сохраняют и продолжают дозирование для возможного второго спаривания, если необходимо.

3.4.2. Ежедневное введение доз беременным самкам следует продолжать всю беременность и, как минимум, до 3-го дня после родов включительно, или за день до умерщвления. Для исследований, где тестируемое вещество вводится ингаляционно или дермально, введение доз продолжается, как минимум, до 19-го дня беременности включительно.

3.4.3. Животным в группе-спутнике назначают повторные осмотры. Их нельзя усыплять, как минимум, 14 дней после усыпления первых самок, для выявления замедленных реакций или уменьшения токсических эффектов.

3.4.4. График-схема тестирования, предусматривающая максимальную длительность исследования при полной 14-дневной продолжительности спаривания, представлена в прилож. 6.7.10.1.

3.5. Процедура спаривания

В исследованиях используют спаривание 1:1 (одна самка на одного самца). Исключения могут быть сделаны в случае случайной смерти самцов. Самку следует помещать с одним и тем же самцом до наступления беременности или в течение 2 недель. Каждое утро самки должны проверяться на наличие спермы или вагинальной пробки. Нулевым днем беременности считается день обнаружения вагинальной пробки или спермы. В случае, если спаривание неуспешно, может быть проведено повторное спаривание с самцами, уже осуществившими успешное спаривание.

4. Наблюдения

4.1. В течение всего периода исследования ежедневно в одно и то же время должно проводиться общее клиническое наблюдение, принимая во внимание периоды максимума предполагаемого воздействия дозы. Все данные должны документироваться. Как минимум, два раза в день нужно проверять животных на наличие смертей и предсмертных состояний.

4.2. Детальный осмотр животных должен быть проведен один раз до начала дозирования и, как минимум, раз в неделю во время исследования. Осмотр должен проводиться каждый день вне клетки, в одинаковых условиях и в одно и то же время суток. Все наблюдения должны быть тщательно зафиксированы, желательно с использованием оценочной системы баллов. Необходимо минимизировать изменения условий тестирования, предпочтительно чтобы человек, наблюдающий за состоянием животных, не знал о введенном веществе. Записи о состоянии животных должны включать, но не ограничиваться, сведениями об изменениях на коже, шерсти, глазах, слизистых оболочках, появление секреций и экскреций и вегетативной активности (например, слезотечения, пилоэрекции, размера зрачков, нестандартного дыхания). Изменение в походке, осанке и реакции на прикосновение, присутствие клонических и тонических движений, стереотипии (например, излишний груминг, хождение по кругу), осложненные или затянувшиеся роды или странное поведение (самовредительство, хождение задом наперед) также должны быть зафиксированы.

4.3. Один раз за все исследование нужно провести оценку сенсорной реакции на различного вида раздражители (в т.ч. слуховой, визуальной и проприоцептивной реакций, оценку силы захвата и оценку двигательной активности с использованием десяти случайно выбранных самок и самцов (по пять животных каждого пола). Дальнейшие детали осмотра можно найти по соответствующим ссылкам. Для самцов эти наблюдения нужно проводить в конце периода дозирования, незадолго до усыпления, но перед взятием крови на гематологию или биохимический анализ. Самки должны находиться в похожем физиологическом состоянии на время проведения наблюдений, лучше всего во время лактации, незадолго до усыпления. Чтобы избежать гипертермии у потомства, нельзя отнимать их от самок больше чем на 30-40 минут.

4.4. Функциональные наблюдения в конце исследования могут не проводиться, если данное исследование осуществляется как предварительное перед соответствующим субхроническим 90-дневным исследованием. В этом случае функциональные наблюдения должны быть включены в последующее исследование. С другой стороны, наличие данных функциональных наблюдений в этом исследовании может улучшить возможность выбора адекватных уровней доз для последующих исследований.

4.5. В исключительных случаях функциональные наблюдения могут быть пропущены для групп животных, проявляющих признаки токсичности, которые будут мешать проведению исследования функционального состояния животных.

4.6. Длительность беременности должна фиксироваться и отсчитываться от 0-го дня беременности. Каждый приплод должен быть изучен как можно раньше после рождения для установления количества и пола детенышей, мертворожденных, родившихся живыми, малорослых (детеныши, которые заметно меньше, чем детеныши из контрольной группы) и наличия явных аномалий.

4.7. Живые детеныши должны быть подсчитаны, у них следует установить пол. Приплод следует взвешивать в течение 24 часов после родов (нулевой или первый день после родов) и на 4-й день после родов. В дополнение к наблюдению за родительскими особями любое аномальное поведение потомства должно быть зафиксировано.

4.8. Масса тела, потребление пищи и воды.

4.8.1. Самцы и самки должны взвешиваться в первый день введения дозы, как минимум, еженедельно в дальнейшем и по окончании исследования. Во время беременности самок следует взвешивать в 0-й, 7-й, 14-й и 20-й дни, в течение 24 часов после родов (нулевой или первый день после родов) и на 4-й день после родов. Все наблюдения должны фиксироваться отдельно по каждому взрослому животному.

4.8.2. Перед спариванием, во время беременности и лактации потребление пищи должно измеряться, как минимум, еженедельно. Измерение потребления пищи в период спаривания является необязательным. Потребление воды в этот период следует измерять, если исследуемое вещество вводится с питьевой водой.

4.9. Гематология.

4.9.1. Один раз во время эксперимента должны быть проведены следующие гематологические наблюдения (с использованием пяти самцов и пяти самок из каждой группы): гематокрит, концентрация гемоглобина, число эритроцитов, общее число лейкоцитов и лейкоцитарная формула, число тромбоцитов и время свёртывания крови.

4.9.2. Самки должны быть в одинаковых физиологических состояниях при проведении взятия крови. Для того чтобы избежать вариабельности показателей в связи с началом беременности, сбор крови у самок должен быть произведен перед началом спаривания или как часть процедуры усыпления животного. Сбор крови у самцов должен проводиться до или как часть процедуры усыпления животных. Сбор крови у самцов может быть проведен перед началом спаривания, т.е. в наиболее подходящий период для обследования самок.

4.9.3. Пробы крови должны храниться в надлежащих условиях.

4.10. Клиническая биохимия.

4.10.1. Определение клинических биохимических показателей, отражающих проявление токсических эффектов в тканях, и особенно в почках и печени, должно проводиться в крови пяти самцов и самок из каждой группы. Перед взятием проб крови рекомендуется голодание животных в течение ночи*. Исследование плазмы или сыворотки должно включать определение калия, натрия, глюкозы, холестерина, мочевины, креатинина, белка и альбумина, как минимум, двух ферментов, отражающих гепатоцеллюлярные эффекты (такие как аланинамино-трансфераза, аспартатаминотрансфераза и сорбитолдегидрогеназа) и желчных кислот. Иногда может быть полезно исследование других ферментов (печеночные и других).

4.10.2. Факультативно может быть проведен анализ мочи у пяти случайно выбранных самцов из каждой группы в последнюю неделю исследования, собирая ее за фиксированный промежуток времени; нужно исследовать вид, количество, осмоляльность или удельный вес, рН, белок, глюкозу, наличие крови/клеток крови.

4.10.3. В дополнение можно провести исследования сывороточных маркеров общего повреждения тканей. Можно провести другие анализы, такие как исследование на содержание кальция, фосфатов, триглицеридов, глюкозы натощак, специфичных гормонов, метгемоглобина и холинэстеразы.

4.10.4. В целом необходим гибкий подход, зависящий от наблюдаемого или ожидаемого эффекта исследуемого соединения.

4.10.5. Если накопленные данные о фоновом состоянии животных неадекватны, возможно проведение гематологических и биохимических исследований перед началом дозирования.

5. Патоморфология

Вскрытие животных

5.1. Все взрослые животные, задействованные в эксперименте, должны быть подвержены полному детальному вскрытию, которое включает внимательное исследование внешней стороны тела, всех отверстий, черепной, торакальной, брюшной полостей и их содержимого. Нужно уделить особое внимание репродуктивным органам. Число мест имплантации должно быть зафиксировано. Обязательно должно быть посчитано число желтых тел.

5.2. Яички и придатки яичек всех взрослых самцов должны быть взвешены. Яичники, яички, придатки яичек, дополнительные органы репродукции, а также все органы с признаками макроскопического поражения, отобранные у всех животных, должны быть законсервированы.

5.3. Дополнительно у случайно выбранных 5 самок и 5 самцов из каждой группы после вскрытия необходимо выделить печень, почки, надпочечники, тимус, селезенку, мозг и сердце, отделив их от окружающих тканей соответствующим образом, и как можно скорее взвесить все эти органы, не допуская их высыхания. Нужно законсервировать в подходящей среде следующие органы и ткани для проведения последующих гистопатологических исследований: любые органы с выявленными поражениями, мозг (наиболее важные области, включая большие полушария, мозжечок и Варолиев мост), позвоночник, желудок, тонкий и толстый кишечник (включая Пееровы бляшки), печень, почки, надпочечники, селезенка, сердце, тимус, щитовидная железа, трахея и легкие (перед погружением в консервирующий раствор необходимо накачать их воздухом и зафиксировать), матку, мочевой пузырь, лимфатические узлы (желательно один узел, располагающийся вблизи места введения вещества, и один, находящийся в удалении от места введения), периферические нервы (седалищные и большеберцовые), предпочтительнее расположенные ближе к мышцам, часть костного мозга (или часть аспирата костного мозга).

5.4. Для стандартных исследований яичек и придатков яичек не рекомендуется их хранение в формалине. Для хранения таких тканей подходящим способом является фиксатор Буэна. Клинические и другие исследования могут потребовать проведения анализа дополнительных органов. Также нужно сохранять любые органы, которые, основываясь на известных свойствах исследуемого вещества, могут являться органами-мишенями.

5.5. Мертворождённые детеныши и умерщвленные на 4-й день после родов или вскоре после этого должны быть внимательно изучены на наличие явных внешних аномалий.

Гистопатология

5.6. Нужно провести полное гистопатологическое исследование сохраненных органов и тканей животных из контрольной группы и группы с максимальной дозой (особое внимание уделить сперматогенезу у самцов и гистопатологии интерстициального строения клеток яичек). Эти исследования должны быть проведены для животных в других группах, если наблюдаются изменения в группе получавших максимальную дозу.

5.7. Все серьезные повреждения должны быть оценены. Для обоснования NOAEL должны быть исследованы органы животных из других групп, особенно тех, которые могут быть оценены как NOAEL.

5.8. Когда используется группа-спутник, проводится гистопатология органов и тканей, в которых наблюдались эффекты.

6. Данные, оценка результатов и отчет

6.1. Данные об испытании

6.1.1. Данные для каждого животного должны были предоставлены отдельно. В дополнение все данные должны быть сведены в табличную форму, отражающую для каждой тестовой группы количество животных на начало исследования; количество животных, умерших во время исследования или умерщвленных по гуманным соображениям и время каждой смерти или умерщвления; количество способных к деторождению животных; количество беременных самок; количество животных, демонстрирующих признаки токсичности; описание наблюдаемых признаков токсичности, включая время начала, продолжительность и тяжесть любых токсических проявлений; тип гистопатологических изменений и все соответствующие данные по приплоду. Табличная форма для отчета, одобренная в качестве наиболее подходящей для оценки воздействия на репродуктивную/эмбриональную токсичность, представлена в прилож. 6.7.10.2.

6.1.2. По возможности результаты должны быть оценены с применением подходящего и приемлемого статистического метода. Статистический метод должен быть выбран до начала тестирования при планировании исследования. В связи с ограниченным объемом исследования статистический анализ в виде тестов на "значимость" имеет ограниченную ценность для многих видов эффектов, особенно репродуктивного. Некоторые наиболее популярные методы, особенно параметрические тесты для определения центральной тенденции, являются неуместными. Если используется статистический анализ, выбранный метод должен соответствовать распределению исследованной переменной и должен быть определен до начала исследования.

6.2. Оценка результатов

6.2.1. Результаты исследования должны быть оценены, учитывая наблюдаемые эффекты, результаты вскрытия и микроскопические анализы. Оценка будет включать соотношение между дозой исследуемого вещества и наличием или отсутствием, количеством и тяжестью аномалий, включая макроскопические повреждения, определение органов-мишеней, бесплодность, клинические аномалии, воздействие на репродуктивность и потомство, изменения массы тела, влияние на смертность и любые другие токсические проявления.

6.2.2. В связи с непродолжительностью периода введения вещества самцам при оценке воздействия на их репродуктивность гистопатология яичек и придатков яичек должны рассматриваться вместе с данными по фертильности. Использование существующих контрольных данных по репродуктивности и развитию может быть очень полезно для интерпретации результатов исследования.

6.3. Отчет об исследовании

Отчет об исследовании должен включать следующие данные:

Исследуемое вещество:

- физическое состояние и при необходимости - физико-химические свойства;

- идентификационные данные.

Носитель (при необходимости):

- обоснование выбора носителя (если это не вода).

Подопытные животные:

- вид/линия используемых животных;

- число, возраст и пол животных;

- происхождение, условия содержания, питание и так далее;

- масса каждого животного в начале эксперимента.

Условия проведения исследования:

- обоснование выбора уровня доз;

- подробное описание приготовления состава тестируемого вещества/пищи, достигнутая концентрация, стабильность и однородность состава;

- подробное описание введения вещества;

- коэффициент перевода от концентрации исследуемого вещества в пище/питьевой воде (ррm) к фактической дозе (мг/кг в день), если возможно;

- качество пищи и воды;

Результаты:

- масса/изменения массы;

- потребление пищи и воды, если возможно;

- данные реакции на токсичность по полу и дозе, включая фертильность, беременность и любые другие признаки токсичности;

- длительность беременности;

- токсическое или иное влияние на репродуктивность, потомство, рост после рождения и т.д.;

- характер, объем и длительность клинических наблюдений (можно ли их однозначно интерпретировать или нет);

- сенсорная и двигательная активность животных, сила захвата и т.п.;

- результаты гематологических тестов с соответствующими значениями физиологической нормы;

- результаты биохимических тестов с соответствующими значениями физиологической нормы;

- количество живого потомства и постимплантационная гибель плодов;

- количество детенышей с явно наблюдаемыми аномалиями, количество малорослых;

- время гибели в течение исследования или дожившие до его окончания животные;

- количество зародышей, желтые тела (рекомендуется), размер и масса приплода на момент отчета;

- масса тела детенышей на момент умерщвления и данные по массе органов родительских животных;

- данные некропсии;

- подробное описание обнаруженных гистологических изменений половых путей и других тканей самцов, если имеются;

- данные по абсорбции, если имеются;

- статистическая обработка, когда требуется.

Обсуждение результатов.

Заключение.

6.4. Интерпретация результатов

Исследование дает возможность оценить репродуктивную/эмбриональную токсичность вещества при его повторном введении. В частности, так как особое внимание уделено и общетоксическому действию, и репродуктивной/эмбриональной токсичности, результаты этого исследования могут показать различия между репродуктивными/эмбриональными эффектами, появляющимися в отсутствии общей токсичности, и теми, которые проявляются только на уровнях воздействия, токсичных и для взрослых особей. Оно может показать необходимость проведения дополнительных исследований и стать основой для разработки программы последующих исследований.

______________________________

* Некоторые исследования сыворотки и плазмы, прежде всего для определения глюкозы, нужно проводить натощак. Главной причиной является то, что повышенная изменчивость, которая является эффектом от кормления, будет маскировать малозаметные эффекты и затруднять интерпретацию результатов. С другой стороны, голодание может мешать нормальному пищеварению беременных самок и лактации, а также мешать воздействию вещества. Если применяется голодание, клинические биохимические определения должны быть проведены после проведения функциональных наблюдений на четвертую неделю исследования.