Приложение 6.3.4. Токсикокинетические исследования

Приложение 6.3.4

Токсикокинетические исследования

Идентичен международному документу OECD TG N 417 "Toxicokinetics" (ОЭСР Руководство N 417 "Токсикокинетические исследования"). Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает требования к проведению токсикокинетических исследований.

1.2. Регламентирующие инстанции имеют различные цели и требования в отношении измерения конечных точек и параметров, связанных с токсикокинетикой различных классов химических веществ (например, пестициды, биоциды, промышленные химические вещества). Данный метод описывает токсикокинетическое (ТК) исследование, в котором используются многократные измерения и множество конечных точек. В будущем могут быть разработаны новые методы исследования и/или руководящие документы для описания каждой конечной точки по отдельности и более подробно. Применительно к данному документу выбор методов исследования и оценки определяется требованиями и/или задачами каждого регулирующего органа (регламентирующей инстанции).

Существует множество исследований, которые можно провести, чтобы оценить ТК-поведение химического вещества с целью его регламентирования. Однако в зависимости от конкретных ситуаций и потребностей регламентирования, не все имеющиеся в распоряжении исследования будут необходимы для оценки химического вещества. При планировании ТК-исследований необходимо проявлять гибкость, учитывая особенности исследуемого вещества. В некоторых случаях, лишь определенный ряд вопросов требует исследования для оценки химической опасности и проблем риска. В некоторых ситуациях данные по ТК могут быть взяты из других токсикологических исследований. В других случаях могут потребоваться дополнительные и/или более обширные исследования ТК, в зависимости от потребностей регламентирования и/или если возникнут новые вопросы по части химической оценки.

Вся имеющаяся информация о тестируемом веществе, соответствующих метаболитах и аналогах должна быть учтена до проведения исследования, чтобы повысить качество исследования и избежать избыточного использования животных, сверх необходимого количества. Сюда могут входить данные, полученные другими подходящими методами тестирования (исследования in vivo, in vitro, компьютерное моделирование in silico). Физико-химические свойства, такие как коэффициент разделения н-октанол/вода (выраженный как log Pow), рKа, растворимость в воде, давление пара и молекулярная масса химиката могут оказаться полезными для планирования исследования и интерпретации его результатов. Их можно определить с использованием надлежащих методов, как описано в соответствующих документах ОЭСР.

1.3. Ограничения.

1.3.1. Данный метод не предназначен для использования в особых обстоятельствах, например, для беременных или кормящих животных и его детенышей или для оценки остатков токсичного вещества в животных, употребляемых в пищу, подвергшихся воздействию. Однако результаты, полученные в исследованиях соответствующим методом, могут послужить исходной информацией при разработке отдельных методов исследований для этих специальных условий.

1.3.2. Данный метод не предназначен для исследования наноматериалов.

2. Общие положения

2.1. Исследования токсикокинетики (ТК) химических веществ, проводятся, чтобы получить достоверную информацию об их поглощении, распределении, биотрансформации (т.е. метаболизме) и выделении, чтобы соотнести концентрацию или дозу с наблюдаемой токсичностью и способствовать пониманию механизма токсичности тестируемого вещества. ТК может способствовать пониманию токсикологических исследований, демонстрируя, что животные систематически подвергаются воздействию тестируемого вещества и, выявляя, какие из них находятся в циркуляции (исходное вещество/метаболиты). Основные параметры ТК, изучаемые в этих исследованиях, также дают информацию о возможности накопления тестируемого вещества в тканях и/или органах и индукции биотрансформации в результате действия изучаемого вещества.

2.2. Результаты ТК позволяют оценить адекватность и релевантность экстраполяции данных о токсичности, полученных при исследовании на животных, на людях, а также дать оценку степени риска. Вдобавок, ТК-исследования могут дать полезную информацию для определения уровней доз в исследованиях токсичности (при "линейной" и "нелинейной" кинетике), величины эффекта в зависимости от способа введения веществ, биодоступности и особенностей проведения исследования.

2.3. Отдельные результаты ТК-исследований могут найти применение при разработке физиологически обусловленной ТК-модели.

2.4. Информация по метаболитам и ТК имеет важное применение для оценки возможной токсичности, характера действия и их связи с уровнем дозы и маршрутом воздействия. Кроме того, данные о метаболизме могут дать информацию, полезную для оценки токсикологически значимого воздействия, оказываемого эндогенными метаболитами тестируемого вещества.

2.5. Соответствующие ТК-данные будут полезны для дальнейшего подтверждения приемлемости и возможности применения, количественных структурно-функциональных, перекрестных или групповых подходов для оценки безопасности веществ. Данные по ТК могут также использоваться для оценки токсикологической значимости других исследований (например, in vivolin vitro).

2.6. В данных методических рекомендациях рассматривается пероральный прием химического вещества, если явным образом не упомянут иной путь введения.

2.7. При проведении всех in vivo и in vitro исследований, описанных в данных методических рекомендациях, следует использовать документы по гуманному обращению с животными [45].

3. Описание метода

3.1. Подготовка копыту

3.1.1. Предварительные исследования.

Желательно проведение предварительных исследований с целью выбора экспериментальных параметров для основных ТК-исследований (например: метаболизм, баланс масс, аналитические процедуры, подбор дозы, выдыхаемый , и т.д.). Оценка некоторых из этих параметров возможна и без использования радиоактивно меченого тестируемого вещества.

3.1.2. Выбор вида животных.

Вид животных

Желательно, чтобы вид (и линия) животных, используемые для ТК-исследования, совпадали с теми, которые использовались в других токсикологических исследованиях с тем же тестируемым веществом. Обычно, должны использоваться крысы, поскольку они широко применяются в токсикологических исследованиях. Допустимо использование других видов животных вместо или в дополнение к крысам, если критические токсикологические исследования на них показали существенную токсичность, или наблюдаемая токсичность\токсикокинетика в большей степени применима к людям. Выбор вида и линии животных должен быть обоснован.

В данном методе исследования в качестве экспериментальных животных рассматриваются крысы (если явно не указаны иные животные). Возможно определенные разделы данного метода потребуется изменить применительно к использованию других видов экспериментальных животных.

Возраст и вид животных

В исследовании должны использоваться молодые здоровые взрослые животные (как правило, в возрасте 6-12 недель на момент начала эксперимента). При использовании животных, не являющимися молодыми и половозрелыми, необходимо представить надлежащее обоснование. Все животные должны быть одного возраста, и различия в весе отдельных животных не должно превышать среднего веса испытательной группы. Идеально было бы использовать ту же самую линию животных, которая использовалась при получении токсикологической базы данных для химического вещества.

Количество и пол животных

Для каждой проверяемой дозы необходимо использовать не менее четырех животных одного пола. Необходимо обосновать выбор пола используемых животных. Использование обоих полов (четыре самца и четыре самки) должно рассматриваться, если имеются свидетельства в пользу существенных различий между полами при токсическом воздействии.

Условия содержания и питания животных

Обычно, при проведении эксперимента, животные размещаются индивидуально. В особых случаях может быть оправдано размещение группой. Освещение должно быть искусственным с чередованием: 12 ч света и 12 ч темноты. Температура в помещении, предназначенном для экспериментов на животных, должна составлять , относительная влажность - от 30 до 70%. Для кормления могут использоваться обычные лабораторные диеты с неограниченным доступом к питьевой воде.

3.1.3. Тестируемое вещество.

Для всех процедур, связанных с определением баланса масс и идентификацией метаболитов, необходимо использовать тестируемое вещество, меченное радиоактивным углеродом .

Однако использования радиоактивных соединений можно избежать, если показано, что:

- баланс масс и идентификация метаболитов может адекватно определяться/оцениваться с использованием немеченного тестируемого вещества;

- специфичность и чувствительность аналитического метода, при использовании нерадиоактивного тестируемого вещества, является равнозначной или превышает таковые, достигаемые с радиоактивной меткой.

Кроме того, можно использовать другие радиоактивные или устойчивые изотопы, особенно если этот элемент ответственен за токсичность или входит в состав токсичной части используемого соединения. По возможности, радиоактивная метка должна находиться в основной, метаболически устойчивой части молекулы (т.е. не должна замещаться, удаляться в виде , или становиться частью углеродного пула организма). Может потребоваться пометить различные участки или фрагменты молекулы, чтобы проследить последующие метаболические превращения вещества.

Чистоту и идентичность радиоактивно меченных и немеченных тестируемых веществ проверяют с использованием соответствующих методов. Чистота радиоактивного тестируемого вещества должна быть максимально возможной для данного соединения (в идеале - более 95%). Необходимо постараться идентифицировать примеси, составляющие 2% и более. Для тестируемого вещества необходимо указать чистоту, идентичность и долю любых идентифицированных примесей. Специальные регламентирующие документы могут содержать дополнительную информацию по определению и спецификации тестируемых веществ, являющихся смесями, и по выбору методов для определения их чистоты.

3.1.4. Выбор дозы.

Предварительное исследование

Как правило, для предварительного исследования достаточна единичная оральная доза. Доза должна быть нетоксичной, но достаточно высокой, чтобы можно было выявить метаболит в выделениях (и в плазме крови, если исследуется). Также доза должна соответствовать заявленным целям предварительного исследования.

Основные исследования

Для основных исследований предпочтительно использовать, по крайней мере, два уровня дозы, поскольку информация, полученная в таком эксперименте, может помочь выбрать дозы для других исследований токсичности, и помочь в оценке эффекта доза-ответ для уже проводившихся тестов токсичности.

В тех случаях, когда используют две дозы, обе должны быть достаточно высокими для идентификации метаболита в выделениях (и в плазме крови, если исследуется). Для выбора дозы следует учитывать имеющиеся данные по токсичности. Если такие данные отсутствуют (например, в случае исследований острого токсического воздействия на ротовую полость, когда имеются записи клинических признаков токсичности, или при исследованиях токсичности повторных доз), тогда при выборе дозы можно ориентироваться на наибольшую дозу, которая ниже (при попадании через рот или через кожу) или (при ингаляции), либо на дозу, ниже нижнего значения диапазона острой токсичности. Более низкая из доз должна быть в несколько раз меньше более высокой дозы.

Если проверяется только один уровень дозы, то, в идеальном случае, доза должна быть достаточно высокой, чтобы позволить идентифицировать метаболит в выделениях (и плазме, если также исследуется), но при этом не вызывать явного токсического эффекта. Необходимо привести обоснование, почему не используется второй уровень дозы.

В случае, если требуется выявить влияние дозы на кинетику процесса, то двух доз может оказаться недостаточно, и, по крайней мере, одна доза должна быть достаточно высокой, приводящей к насыщению. Если площадь под кинетической кривой концентрации вещества в плазме (AUC) не линейна в диапазоне между двумя дозами, то это прямо указывает, что где-то между двумя уровнями дозы, используемыми в основном исследовании, происходит насыщение одного или нескольких кинетических процессов.

Для проверки веществ низкого уровня токсичности следует использовать максимальную дозу 1 000 мг/кг живого веса (перорально или через кожу). Однако, если исследование проводится путем ингаляции, то следует руководствоваться OECD TG-403, как правило, эта доза не превышает 2 мг/л. Особенности употребления вещества могут потребовать использования и более высокой дозы в зависимости от конкретной необходимости. Выбор дозы должен быть всегда обоснованным.

Данные по ТК и распределению в тканях, полученные для одиночной дозы, могут быть достаточны для определения возможного накопления и/или устойчивости. Однако в ряде случаев может потребоваться повторное введение дозы: 1) для более полной картины накопления и/или сохранения вещества, или изменений ТК (например, при индукции и ингибировании ферментов); или 2) если того требуют регламентирующие инстанции. В исследованиях с повторением дозы обычно бывает достаточно низкой дозы, но при определенных обстоятельствах повторение высокой дозы может быть также необходимым.

3.2. Введение вещества

Тестируемое вещество следует растворить или гомогенно суспендировать в том же носителе, который использовался для кормления через зонд в других исследованиях токсичности, проводившихся с тестируемым веществом, если такая информация о носителе доступна. Для выбора носителя должно быть приведено обоснование. Выбор носителя и объем дозирования должны обсуждаться на стадии планирования исследования. Общепринятый метод введения исследуемого вещества - через зонд, однако в определенных случаях введение вещества предпочтительнее осуществлять в желатиновой капсуле или в виде питательной смеси (в обоих случаях, должно быть приведено обоснование). Должна проводиться проверка фактической дозы, которая вводится каждому животному.

Максимальный объем жидкости, который можно одномоментно вводить через зонд, зависит от размера животных, типа носителя дозы и от того, было ли накормлено животное перед приемом тестируемого вещества. Должно быть представлено обоснование для кормления или ограничения в еде перед введением дозы вещества. Обычно объем вводимого вещества должен быть настолько низким, насколько это практически приемлемо при использовании водного или неводного носителя. Объем дозы обычно не должен превышать 10 мл/кг массы тела для грызунов. Объем носителя, используемого для более липофильных тестируемых веществ, может начинаться с 4 мл/кг массы тела. Для повторного введения дозы, когда воздержание от пищи в течение дня противопоказано, нужно предусмотреть меньшие объемы дозы (например, 2-4 мл/кг массы тела). При возможности следует использовать объем дозы, соответствующий объему, применявшегося при оральном приеме вещества в других исследованиях.

Внутривенное (IV) введение тестируемого вещества и его измерение в крови и/или выделениях могут использоваться для определения его биодоступности или относительного усвоения при введении через рот. Для IV введения единственную дозу тестируемого вещества (обычно эквивалентную, но не превышающую меньшую оральную дозу - см. выбор дозы) вводят, используя соответствующий носитель. Вещество должно вводиться в соответствующем объеме (например, 1 мл/кг массы тела), заданное место введения, по крайней мере четырем животным одного пола (оба пола могут использоваться, если необходимо). Для IV введения тестируемого вещества необходимо его полное растворение или суспендирование. Носитель для IV введения не должен нарушать целостность крови или мешать кровотоку. Если используется насос для инфузии, необходимо указать скорость введения дозы и поддерживать ее одинаковой для всех животных. Если для введения химического вещества и/или для забора крови используется канюля в яремной вене или феморальная артерия, то необходимо использовать анестезию. Должное внимание должно быть уделено типу анестезии, поскольку это может повлиять на ТК. Животным нужно обеспечить соответствующее восстановление перед введением тестируемого вещества.

Другие пути введения, такие как кожный и ингаляция (п. 4.4 "Альтернативные пути поступления"), могут использоваться при тестировании определенных химических веществ в зависимости от их физико-химических свойств и предполагаемого способа применения или экспозиции на людях.

3.3. Измерения

3.3.1. Баланс масс.

Баланс масс определяют суммированием процента вещества от введенной (радиоактивной) дозы, выделяемой с мочой, фекалиями и выдыхаемым воздухом; процента вещества, содержащегося в выделенных тканях, в остальном теле животного, и обнаруживаемого в смыве при мытье клетки. Обычно достаточной считается суммарно выделенная радиоактивность, близкая к 90% от введенного тестируемого вещества.

3.3.2. Всасывание.

Начальную оценку абсорбции вещества получают, вычитая процент дозы вещества, содержащегося в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) и/или фекалиях, из общего количества вещества, определенного при расчете баланса масс. Расчет процента поглощения дозы представлен ниже. Если баланс масс не позволяет определить точный уровень абсорбции после орального введения дозы (например, когда больше 20% введенной дозы присутствуют в фекалиях), могут потребоваться дополнительные исследования. Эти исследования включают или 1) пероральное введение тестируемого вещества и измерение тестируемого вещества в желчи, или 2) пероральное и IV введение тестируемого вещества, и суммарное измерение тестируемого вещества в моче, плюс в выдыхаемом воздухе и плюс в тушке животного при каждом из способов администрирования. При любом из вариантов постановки эксперимента в качестве замены специфического химического анализа тестируемого вещества и его метаболитов проводится измерение радиоактивности.

При проведении исследования выделения с желчью, как правило, используется пероральный способ введения вещества. В этом случае, желчные протоки, по крайней мере, четырех животных соответствующего пола (или обоих полов, если это обосновано) канюлируют, и животным вводится единственная доза тестируемого вещества. После введения тестируемого вещества выделение радиоактивности или тестируемого вещества в желчи проверяют настолько длительное время, насколько это необходимо для оценки процента введенной дозы, которая выводится этим путем, что можно использовать для непосредственного вычисления степени оральной абсорбции вещества следующим образом:

Процент поглощения = (количество вещества в желчи + в моче + в выдыхаемом воздухе + тушка без содержимого ЖКТ) / доза введенного вещества х 100

Для некоторых классов тестируемых веществ может наблюдаться непосредственная секреция поглощенной дозы через мембраны кишечника. В таких случаях измерение процента дозы в фекалиях после перорального введения дозы крысе с канюлированным желчным протоком для определения неабсорбированной дозы является некорректным. Если предполагается, что происходит секреция дозы в кишечник, тогда процент абсорбированной дозы определяют на основе абсорбции, рассчитанной как отношение выделения при пероральном введении вещества к выделению при IV способе введения (интактные крысы или крысы с канюлированным желчным протоком). Для определения количества секреции в кишечник также необходимо измерять выделения у крыс с канюлированным желчным протоком после введения вещества IV способом.

3.3.3. Биодоступность.

Биодоступность определяют по кинетике вещества в плазме (крови) у групп с пероральным и IV введением вещества. При этом можно использовать специфичный химический анализ для количественного определения тестируемого вещества и/или соответствующего метаболита(ов) без использования радиактивно-меченного тестируемого вещества. Биодоступность (F) исследуемого вещества или соответствующего метаболита(ов) вычисляют следующим образом:

, где

AUC - область под кинетической кривой концентрации вещества в плазме;

DOSE - доза вещества;

ехр - введение тестируемого вещества перорально, через кожу или ингаляцией;

IV - введение тестируемого вещества внутривенно.

В целом для оценки риска системного воздействия предпочтительнее измерять биодоступность токсичного компонента, а не процент его абсорбции, если сравнивают системные концентрации, полученные в исследованиях на животных, с аналогичными данными биомониторинга экспозиции людей. Ситуация усложняется, если дозы оказываются в нелинейном диапазоне, поэтому важно проводить ТК-скрининг в линейном диапазоне доз.

3.3.4. Распределение в тканях.

Данные о распределении тестируемого вещества и/или его метаболитов в тканях важны для идентификации тканей-мишеней, понимания основных механизмов токсичности и оценки способности тестируемого вещества и его метаболитов к накоплению и сохранению.

По завершении эксперимента по выведению из тканей (как правило, 7 дней или менее после введения дозы, в зависимости от особенностей поведения тестируемого вещества) должен быть измерен суммарный процент (радиоактивной) дозы в тканях, а также в остатках тушки животного.

Может оказаться, что по завершении исследования вещество в тканях не обнаруживается (например, вещество могло быть полностью выведено еще до завершения исследования из-за короткого времени полужизни). В таком случае необходимо исследовать время пиковой концентрации тестируемого вещества (и/или метаболита) в плазме/крови (Тmах) или пикового уровня выделения в моче соответственно. Кроме того, может потребоваться выделять ткани в дополнительные моменты времени, чтобы определить количество тестируемого вещества и его метаболитов, оценить (если требуется) его действие во времени, определить баланс масс, или в соответствии с требованиями регламентирующих инстанций. В ходе эксперимента должны быть выделены следующие ткани: печень, жир, желудочно-кишечный тракт, почки, селезенка, цельная кровь, остатки тушки, ткань органов-мишеней и любые другие разновидности тканей, потенциально значимые для токсикологической оценки тестируемого вещества, например: щитовидная железа, эритроциты, половые органы, кожа, глаза (особенно у пигментированных животных). Для максимально полного использования экспериментальных животных, а также в экспериментах с целью определения токсичности при субхронических или хронических исследованиях, следует предусмотреть анализ дополнительных тканей в те же самые временные точки. Также необходимо представить данные о концентрации (радиоактивных) продуктов в тканях и соотношение их количества в ткани по отношению к плазме (кровь).

Оценка распределения вещества в тканях в дополнительные моменты времени, например, во время пиковой концентрации в плазме/крови (например, Тmах) или во время пикового выделения с мочой, (определенные из кинетики плазмы/крови или эксперимента по выделению), может быть также необходима или затребована регламентирующими инстанциями. Эта информация может быть полезной для понимания токсичности и способности тестируемого вещества и его метаболитов к накоплению и сохранению действия. Должно быть приведено обоснование выбора образцов тканей (анализируемые образцы, как правило, должны принадлежать к упомянутым выше).

Определение количества радиоактивности для изучения распределения в тканях выполняют путем диссекции органа, его гомогенизации, сжигания и/или растворения с последующим использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика радиоактивности. Ряд других методов, в настоящее время находящихся на различных стадиях разработки, могут оказаться полезными для определения исследуемого вещества в органах и/или тканях, например, количественная авторадиография всего тела и микроскопическая авторадиография рецепторов.

Если использован не оральный, а другой путь введения вещества, то необходимо собрать и проанализировать соответствующие ткани, например: легкие - при введении вещества методом ингаляции и кожу - при нанесении на кожу (п. 4.4 "Альтернативные пути поступления").

3.3.5. Метаболизм.

Выделения (и плазму, если это необходимо) собирают для идентификации и количественного определения исходного тестируемого вещества и метаболитов как описано в п. 3.3.6. Допускается объединять выделения, чтобы облегчить идентификацию метаболита в пределах группы с одинаковой дозой. Рекомендуется определять метаболиты в каждой временной точке. Однако при нехватке образца и/или радиоактивности допускается объединение мочи и фекалий, взятых в нескольких временных точках. При этом недопустимо объединение образцов в случае животных разного пола или при использовании разных доз. Для анализа мочи, фекалий, выдыхаемой радиоактивности и, если необходимо, желчи у исследуемых животных используют соответствующие качественные и количественные методы.

Следует постараться идентифицировать все метаболиты, присутствующие в количестве 5% или более от используемой дозы, для получения схемы метаболизма тестируемого вещества. Соединения в выделениях необходимо идентифицировать, если они составляют 5% или более от введенной дозы. Под идентификацией понимают определение точной структуры веществ и продуктов. Как правило, идентификация достигается при помощи совместной хроматографии метаболита с известными стандартами, использованием двух различных систем или методов, дающих однозначную структурную идентификацию, таких как масс-спектрометрия, ядерный магнитный резонанс (NMR) и т.д. В случае совместной хроматографии, методы, использующие одну и ту же стационарную фазу, но два различных растворителя, не могут считаться двумя различными методами идентификации метаболита, поскольку они не являются независимыми. Идентификация с помощью совместной хроматографии должна быть получена с использованием двух несходных, аналитически независимых систем, таких как нормальная или обратнофазная тонкослойная хроматография (TLC) и высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC). При условии, что обеспечено хроматографическое разделение соответствующего качества, дополнительное подтверждение спектроскопическими средствами не требуется. Для однозначной идентификации веществ также можно использовать методы, предоставляющие структурную информацию, такие как жидкостная хромато-масс-спектрометрия (LC-MS) или жидкостная тандемная хромато-масс-спектрометрия (LC-MS/MS), газовая хромато-масс-спектрометрия (GC-MS) и NMR-спектрометрия.

Если идентификация метаболитов, присутствующих в количестве 5% или более от используемой дозы, невозможна, это должно быть объяснено/обосновано в итоговом отчете. Для лучшего понимания метаболических путей, с целью оценки степени риска и/или опасности тестируемого вещества, было бы хорошо идентифицировать метаболиты, представляющие менее 5% используемой дозы. По возможности должно быть обеспечено структурное подтверждение. Оно может включать анализ метаболита в плазме, крови, других тканях.

3.3.6. Выведение.

Скорость и степень выведения введенной дозы определяют, измеряя процент (радиоактивной) дозы в моче, фекалиях и выдыхаемом воздухе. Эти данные также используются при определении баланса масс. Количества тестируемого вещества (радиоактивность), выводимые с мочой, фекалиями и выдыхаемом воздухом, определяют с подходящими интервалами времени (см. ниже). Эксперименты с повторным введением дозы планируют так, чтобы обеспечить сбор всех данных о выделениях. Это позволит провести сравнение с экспериментами, в которых использовались одиночные дозы.

Если предварительное исследование показало, что с выдыхаемым воздухом не выделяется сколь-нибудь существенное количество тестируемого вещества (радиоактивность), то тогда не требуется проверять выдыхаемый воздух в основном исследовании.

Каждое животное помещают в отдельный метаболический бокс для сбора выделений (моча, фекалии, выдыхаемый воздух). В конце каждого периода сбора выделений метаболические боксы ополаскивают соответствующим растворителем (эта процедура называется "мытье клетки"), чтобы гарантировать максимально полный сбор тестируемого вещества (радиоактивности). Сбор выделений животных заканчивают или на седьмой день, или после того, как по крайней мере 90% введенной дозы было собрано, в зависимости от того, что наступит раньше.

Количество тестируемого вещества (радиоактивность) в моче определяют, по крайней мере, дважды за первый день ее сбора, причем один из замеров - через 24 ч после введения дозы, далее ежедневно, вплоть до завершения исследования. Выбор более, чем двух временных точек забора образцов в первый день (например, в 6, 12 и 24 ч) только приветствуется. Результаты предварительных исследований анализируют с целью модификации протокола забора образцов или введения дополнительных временных точек. Необходимо представить обоснование для использования альтернативного расписания сбора данных.

Количество тестируемого вещества (радиоактивность) в фекалиях определяют ежедневно, начиная с 24 ч после введения дозы и вплоть до завершения исследования. Предварительные исследования могут потребовать модификации расписания забора образцов или введения дополнительных временных точек сбора фекалий. Необходимо представить обоснование для использования альтернативного расписания сбора данных.

Сбор выдыхаемого и других летучих веществ в текущем эксперименте можно прекратить, если за 24-часовой период сбора в выдыхаемом воздухе окажется менее 1% от введенной дозы.

3.4. Исследования динамики

3.4.1. Кинетика вещества в плазме/крови.

Целью этих исследований является оценка основных ТК-параметров тестируемого вещества (например: Сmах, Тmах, период полувыведения (t1/2), AUC). Эти исследования проводят с одной дозой или, что более вероятно, при использовании двух или более доз. Выбор дозы должен определяться природой эксперимента и/или его задачей. Кинетические данные могут потребоваться, чтобы ответить на такие вопросы, как биодоступность вещества и/или прояснять влияние дозы на последующее очищение от токсического вещества (например, выяснить, происходит ли насыщение механизма очищения в зависимости от величины дозы).

В этих исследованиях для каждой проверяемой дозы используют группу как минимум из четырех животных одного пола. Необходимо привести обоснование по выбору пола используемых животных. Использование обоих полов (четыре самца и четыре самки) рассматривают при наличии свидетельств в пользу существенных различий по воздействию токсичности между полами.

После введения тестируемого вещества (радиоактивность) производят забор образцов крови от каждого животного в соответствующие временные точки, используя соответствующий метод забора. Объем и число образцов крови, которые можно взять при исследовании каждого животного, ограничены возможным влиянием повторного забора на здоровье/физиологию животных и/или чувствительность метода анализа. Образцы анализируют отдельно для каждого животного. В некоторых ситуациях (например, для характеристики метаболита), может потребоваться объединить образцы, полученные больше, чем от одного животного. Объединенные образцы необходимо четко идентифицировать и представить обоснование для объединения. При использовании радиоактивно меченого вещества, может быть достаточно анализа суммарной радиоактивности. В таком случае, суммарную радиоактивность определяют в цельной крови и плазме или в плазме и эритроцитах, чтобы вычислить отношение кровь/плазма. В определенных случаях могут потребоваться более глубокие исследования, требующие идентификации исходного вещества и/или его метаболитов или оценки взаимодействия с белками.

3.4.2. Кинетика вещества в других тканях.

Цель этих исследований состоит в получении информации об изменении параметров во времени с тем, чтобы определив уровни тестируемого вещества в различных тканях, ответить на такие вопросы, как способ токсичного действия, биоаккумулирования и биоперсистенция. Выбор тканей и количества рассматриваемых временных точек определяется постановкой проблемы и имеющимися данными по токсикологии химического вещества. При планировании дополнительных исследований по кинетике в тканях следует учитывать данные, собранные в соответствии с п. 3.3.4 "Распределение в тканях". Эти исследования могут включать однократное или повторное введение тестируемого вещества. Необходимо привести подробное объяснение используемого подхода.

Причиной для проведения исследований кинетики в других тканях могут являться:

- увеличенный период полувыведения из крови, что предполагает накопление тестируемого вещества в различных тканях; или

- желание проверить достигнут ли равновесный уровень тестируемого вещества в определенных тканях (например, в исследованиях с повторным введением вещества, даже если наблюдаемый равновесный уровень тестируемого вещества в крови достигнут, может потребоваться проверить, что равновесный уровень достигнут также и в тканях-мишенях).

При исследовании динамики, выбранную дозу вещества вводят животным перорально и отслеживают динамику распределения вещества в исследуемых тканях. Для каждой временной точки исследуемой дозы используют группу как минимум из четырех животных одного пола. Следует использовать животных одного пола, если только не наблюдается выборочная токсичность по отношению к одному из полов. Постановка проблемы определяет, какой параметр анализируют: суммарную радиоактивность исходного вещества и/или его метаболитов. Оценка распределения вещества в тканях проводится с использованием соответствующих методов.

3.4.3. Индукция/ингибирование ферментов.

Исследования возможного влияния индукции/ингибирования ферментов или биотрансформации тестируемого вещества могут потребоваться в одном или нескольких из следующих случаев:

1. Имеющиеся данные указывают на связь между биотрансформацией тестируемого вещества и повышенной токсичностью;

2. Имеющиеся данные по токсичности указывают на нелинейные отношения между дозой и метаболизмом;

3. В работах по идентификации метаболитов выявлен потенциально токсичный метаболит, который, возможно, был произведен цепочкой ферментативных реакций, активированной тестируемым веществом;

4. При объяснении воздействия, предположительно связанного с индукцией фермента;

5. Если наблюдаются токсикологически значимые изменения в метаболическом профиле тестируемого вещества в in vitro или in vivo экспериментах с различными животными или условиями, то может потребоваться охарактеризовать вовлеченные ферменты. Например, ферменты Фазы I (например, изоферменты системы цитохром Р450-зависимой монооксигеназы) и ферменты Фазы II (например, изоферменты сульфотрансферазы или уридиндифосфатгюкуронозилтрансфераза, или другие ферменты). Эту информацию можно использовать, чтобы оценить возможность экстраполяции результатов между различными видами организмов.

Для оценки изменений ТК, связанных с тестируемым веществом, используют соответствующие проверенные и обоснованные протоколы исследования. Приводимые в качестве примера планы исследований включают повторное введение немеченого тестируемого вещества с последующим введением единственной радиоактивно меченой дозы на 14-й день либо повторное введение радиоактивно меченого тестируемого вещества и забора материала на 1-й, 7-й и 14-й день для определения метаболитов. Повторное введение радиоактивно меченого тестируемого вещества может также быть информативным в плане биоаккумулирования.

4. Дополнительные подходы

Дополнительные подходы, помимо экспериментов in vivo, описанных в данном методе исследования, могут дать полезную информацию о поглощении, распределении, метаболизме или выведении химиката у определенных видов животных.

4.1. Использование информации, полученной при исследовании in vitro

Ответы на определенные вопросы относительно метаболизма химического вещества, можно получить при исследованиях in vitro с использованием соответствующих экспериментальных систем. Свежевыделенные или культивированные гепатоциты и субклеточные фракции печени (например, микросомы, цитозоль или фракция S9) можно использовать для изучения предполагаемых метаболитов. Изучение метаболизма вещества в исследуемом органе (например, в легком) может быть информативным для оценки риска. Для этих целей можно использовать микросомальные фракции исследуемых тканей. Исследования на микросомах применимы для выявления возрастных и половых различий, для определения параметров активности фермента (Km и Vmax), которые помогают оценить уровень дозы, определяемой метаболизмом вещества, при различных уровнях экспозиции. Кроме того микросомы можно использовать для идентификации конкретных микросомальных ферментов, вовлеченных в метаболизм вещества, что может найти применение в экстраполяции данных на другие виды организмов. Возможность индукции реакций биотрансформации можно исследовать с помощью субклеточных фракций печени (например, микросом и цитозоля) на животных, предварительно обработанных тестируемым веществом, либо in vitro, исследуя индукцию гепатоцитов или определенные клеточные линии, экспрессирующие соответствующие ферменты. В определенных случаях и при надлежащих условиях, субклеточные фракции, выделенные из человеческих тканей, могут быть использованы для выявления потенциальных межвидовых различий реакций биотрансформации. Результаты исследований in vitro могут также найти применение в построении моделей ТК, основанных на физиологии.

Исследования по поступлению вещества через кожу, проводимые in vitro, позволяют получить дополнительную информацию по абсорбции.

Первичные культуры клеток печени и свежеприготовленные срезы ткани можно использовать для исследования аналогичных вопросов, что и с применением препаратов микросом печени. В определенных случаях можно исследовать конкретные вопросы, используя клеточные линии с охарактеризованной экспрессией соответствующего фермента, или специально созданные клеточные линии. В определенных случаях может быть полезным исследовать in vitro ингибирование и индукцию конкретных изоферментов цитохрома Р450 (например, CYP1A1, 2Е1, 1А2, и др.) и/или ферментов фазы II, вызываемые исходным тестируемым веществом. Полученная информация может быть полезна для исследования химических веществ, имеющих сходную структуру.

4.2. Использование данных токсикокинетических исследований в качестве дополнительной информации

Анализы образцов крови, тканей и/или выделений, полученных при проведении других исследований токсичности, могут позволить получить данные по бионакоплению, динамике вещества в плазме (AUC, Сmах), по возможной биоаккумуляции, скорости выведения вещества, а также о возрастных и половых различиях метаболизма и кинетики.

Планирование исследования может предусматривать поиск ответов на следующие вопросы: насыщение уровня абсорбции, биотрансформации или путей выведения при более высоких дозах тестируемого вещества; функционирование других метаболических путей при более высоких дозах и лимитирование токсичных метаболитов при более высоких используемых дозах.

Другие соображения оценки опасности могут включать:

- возрастную чувствительность, в результате изменений в состоянии гематоэнцефалического барьера, почек и/или способности к детоксификации;

- субпопуляционную чувствительность, в результате различий в способности к биотрансформации или других различий ТК;

- уровень воздействия на плод в результате трансплацентарного переноса химикатов или воздействия на новорожденного при грудном вскармливании.

4.3. Применение токсикокинетического (ТК) моделирования

ТК-модели могут использоваться для различных аспектов оценки опасности и уровня риска, например, для предсказания системного воздействия и величины дозы во внутренних тканях.

Кроме того, они позволяют исследовать конкретные вопросы относительно способа действия вещества, различных путях экспозиции, схем дозировки. Подобные модели могут служить основанием для межвидовой экстраполяции результатов и оценки риска для людей. Данные, пригодные для разработки ТК-моделей воздействия вещества на животных данного вида, включают следующие параметры: 1) коэффициенты разделения, 2) биохимические константы и физиологические параметры, 3) параметры абсорбции для каждого способа поступления вещества, 4) in vivo данные по кинетике для оценки модели (например, параметры выведения вещества для значимых (>10%) путей выделения, Km и Vmax - для метаболических путей). Экспериментальные данные, использованные при разработке моделей, должны быть получены с использованием адекватных надежных научных методов, а результаты, полученные на основании модели, должны быть валидизированы. Для облегчения разработки некомпартментализированных моделей или физиологических моделей часто определяют параметры, характеристические для конкретных химических веществ и конкретных видов животных (например, скорость абсорбции, распределение между кровью и тканями, константы скоростей процессов метаболизма).

4.4. Альтернативные пути поступления

4.4.1. Накожный.

В данный раздел представлена определенная информация по проведению ТК-исследования тестируемого вещества при поступлении через кожу. В случае абсорбции через кожу надлежит следовать OECD TG-427 ("Поступление через кожу: метод in vivo"). Для других целей, таких как изучение распределения и метаболизма вещества, можно использовать данный метод исследования. При воздействии на кожу должен использоваться один уровень дозы тестируемого вещества или более. Тестируемая композиция (например, мазь, раствор или смесь, содержащая тестируемое вещество и наносимая на кожу) должна быть той же самой (или правдоподобной заменой), т.е. такой, воздействию которой могли бы подвергаться люди или другие виды животных. Уровень дозы должен быть выбран в соответствии с п. 3.1.4 "Выбор дозы".

При выборе дозы для введения через кожу учитывают ожидаемую длительность воздействия на человеческий организм и/или уровень дозы, при которой токсичность наблюдалась в других исследованиях кожной токсичности. При необходимости, кожную дозу растворяют в подходящем носителе и наносят в соответствующем объеме. Незадолго до эксперимента состригают мех со спины подопытных животных. Мех можно сбрить, но это необходимо сделать приблизительно за 24 ч перед тестом. При стрижке или бритье меха недопустимо повреждение кожи, т.к. это изменит ее проницаемость. Для нанесения тестируемого вещества освобождают приблизительно 10% поверхности тела. При использовании очень токсичных веществ площадь поверхности может составлять менее 10%, но как можно большая часть поверхности должна быть покрыта тонким и однородным слоем исследуемой композиции. Во всех группах проводимого кожного теста площадь воздействия на кожу остается одинаковой. Все участки для нанесения вещества защищают надежно зафиксированным защитным покрытием. Животных размещают отдельно.

Необходимо провести анализ смыва с кожи, чтобы оценить количество исследуемого вещества, которое может быть удалено с поверхности кожи путем мытья обработанного участка кожи водой с мягким мылом. Этот анализ также может использоваться при определении баланса масс, если введение вещества осуществляется кожным путем. Данное исследование смыва с кожи проводят на двух животных, для каждого используют одну дозу исследуемого вещества. Выбор уровня дозы осуществляется в соответствии с п. 3.1.4 "Выбор дозы" (также см. ниже, обсуждение времени контакта с кожей). Для оценки эффективности удаления тестируемого вещества с помощью процедуры смыва должно быть определено количество смытого исследуемого вещества.

Если тестируемое вещество не является агрессивным, его наносят на кожу и выдерживают в течение минимум 6 ч. Затем удаляют изолирующее покрытие, и отработанную область моют в соответствии с процедурой, описанной в исследовании смыва с кожи (см. выше). И покрытие, и смыв должны быть исследованы на наличие оставшегося тестируемого вещества. По завершении исследований каждое животное должно быть гуманно умерщвлено в соответствии с [45], а кожа подвергшаяся воздействию - удалена. Фрагмент подвергшейся воздействию кожи анализируют для определения остаточных количеств тестируемого вещества (по радиоактивности).

Для ТК-оценки фармацевтических препаратов может потребоваться применение иных процедур в соответствии с решением соответствующих регламентирующих инстанций.

4.4.2. Ингаляционный.

Тестируемое вещество используют в одной концентрации (или в нескольких, если необходимо). Концентрацию выбирают в соответствии с п. 3.1.4 "Выбор дозы". Введение вещества путем ингаляции проводят с использованием "носового конуса" или устройства, изолирующего всю голову, чтобы предотвратить поглощение вещества через другие пути воздействия. При использовании других условий ингаляции необходимо представить обоснование произведенных модификаций. Указывают продолжительность ингаляции; типичная экспозиция составляет 4-6 ч.

5. Подготовка отчета

Отчет должен содержать оглавление.

Отчет должен включать информацию, соответствующую этому методу исследования, разделенную на разделы и параграфы следующим образом.

5.1. Резюме

Включает краткое описание планирования эксперимента и описание используемых методов. Оно должно содержать, прежде всего, ключевые результаты по тестируемому веществу: баланс масс, вид и количество образующихся метаболитов, остаток вещества в тканях, скорости выведения, уровень биоаккумулирования, половые различия и т.д. Резюме должно быть достаточно развернутым, чтобы позволить оценить полученные результаты.

5.2. Введение

Включает цели исследования, обоснование исследования и планирование эксперимента, а также содержит обзор состояния вопроса и необходимые ссылки.

5.3. Материалы и методы

Включает подробное описания всей надлежащей информации, в том числе:

5.3.1. Тестируемое вещество.

Включает идентификационные данные тестируемого вещества: химическое название, молекулярную структуру, качественное и количественное определение его химического состава, химическую чистоту и, если известно, тип и количество любых примесей. Также дают информацию о его физических/химических свойствах, включая физическое состояние, цвет, общую растворимость и/или коэффициент разделения, стабильность, агрессивность. Представляют информацию об изомерах, если имеются. Для радиоактивно меченого вещества в этот раздел включают информацию о типе радионуклида, положении метки, удельной активности и радиохимической чистоте.

Указывают тип или описание каждого носителя, растворителей, компонентов смеси, эмульгаторов или других материалов, используемых при администрировании тестируемого вещества.

5.3.2. Подопытные животные.

Содержит информацию о подопытных животных, включая обоснование выбора вида и линии животного, возраст на момент исследования, пол, массу тела, состояние здоровья и условия содержания.

5.3.3. Методы.

Содержит детали планирования эксперимента и используемых методов. Он должен включать:

1) обоснование любой применявшейся модификации способа введения вещества и условий экспозиции;

2) обоснование выбора уровня дозы;

3) описание предварительных исследований, использованных при планировании эксперимента. Должны быть включены использовавшиеся результаты предварительного эксперимента;

4) процедура приготовления раствора для введения, тип растворителя или носителя, если таковые использовались;

5) число групп животных и число животных в группе;

6) количественная характеристика дозы и ее объем (и удельная активность дозы, при использовании радиоактивности);

7) путь/пути и способы введения вещества;

8) частота введения;

9) период поста (если используется);

10) суммарная радиоактивность на одно животное;

11) уход за животными;

12) сбор и подготовка образцов;

13) аналитические методы, используемые для разделения, идентификации и количественного определения метаболитов;

14) предел обнаружения для используемых методов;

15) другие применявшиеся экспериментальные измерения и процедуры (включая валидизацию методов анализа метаболита).

5.3.4. Статистический анализ данных.

При использовании статистического анализа результатов исследования должна быть включена достаточная информация о методе анализа и используемой компьютерной программе для того, чтобы независимый рецензент/специалист по статистике мог проверить и реконструировать проведенный анализ.

В случае моделирования систем (таких, как ТК, базирующаяся на физиологии) должно быть представлено полное описание модели, позволяющее воспроизвести независимую реконструкцию и валидизацию модели.

5.4. Результаты

Все данные должны быть проанализированы, сведены в таблицу с соответствующей статистической оценкой и описаны в тексте этого раздела. Данные о подсчете радиоактивности должны быть сведены вместе и представлены в соответствующем виде, как правило, микрограмм или миллиграмм-эквиваленты относительно массы образца, хотя могут использоваться и другие единицы. Этот раздел должен включать графические иллюстрации результатов, воспроизводить существенные данные по хроматографическому и спектрометрическому анализу, данные по идентификации/количественному анализу, предложенным метаболическим путям, в том числе и молекулярную структуру метаболитов.

Кроме того следующая информация должна быть включена в этот раздел, если это применимо:

1) количество и процент радиоактивности, выведенной с мочой, фекалиями, выдыхаемым воздухом, в смыве мочи и фекалий с клетки.

Для кожных исследований также включаются данные по извлечению вещества из обработанной кожи, из смыва с кожи, остаточной радиоактивности на устройстве, покрывающем кожу, в метаболической ячейке и результаты мытья кожи. Дальнейшее обсуждение в п. 4.4 "Альтернативные пути поступления".

Для исследований с вдыханием исследуемого вещества также включаются данные по извлечению исследуемого вещества из легких и тканей носа;

2) распределение вещества в различных тканях, представленное как процент от введенной дозы, в виде концентрации (микрограммы или эквиваленты микрограмма на грамм ткани) и в виде соотношения содержания ткань/кровь или ткань/плазма;

3) баланс веществ, определенный в каждом исследовании в результате изучения тканей тела и выделений;

4) концентрация в плазме и токсикокинетические параметры (биодоступность, AUC, Сmах, Тmах, клиренс, время полужизни), определенные после введения исследуемого вещества соответствующим способом;

5) скорость и степень абсорбции тестируемого вещества после его введения соответствующим способом;

6) количество тестируемого вещества и метаболитов, собранных в выделениях (в процентном отношении от введенной дозы);

7) ссылка на приложение, содержащее данные по каждому отдельному животному для всех измеряемых параметров (например, введенная доза вещества, процент выделения вещества, концентрации, ТК-параметры и т.д.);

8) изображение с предложенными метаболическими путями и молекулярными структурами метаболитов.

5.5. Обсуждение результатов и заключение

В этом разделе автор(ы) должен:

1) предложить предполагаемый метаболический путь на основании результатов анализа метаболизма и мест локализации тестируемого вещества;

2) обсудить любые потенциальные межвидовые и межполовые различия относительно локализации и/или путей биотрансформации тестируемого вещества;

3) свести в таблицу и написать обсуждение по идентификации и количественному определению метаболитов, скорости выведения, биоаккумулированию и уровню исходного вещества, и/или его метаболита(ов), а также о возможных, зависимых от дозы, изменениях в ТК-параметрах, если применимо;

4) свести в этот раздел любые надлежащие данные по ТК, полученные в ходе проведения исследований токсичности;

5) сделать краткое заключение, основывающееся на результатах исследования;

6) добавить другие разделы (если необходимо).

Дополнительные разделы используют, чтобы включить соответствующую библиографическую информацию, таблицы, изображения, приложения и т.д.