Приложение 6.4.1. Метод мембранного барьера для тестирования коррозии кожи in vitro

Приложение 6.4.1

Метод мембранного барьера для тестирования коррозии кожи in vitro

Идентичен международному документу OECD TG N 435 "In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion" (ОЭСР Руководство 435 "Метод мембранного барьера для тестирования коррозии кожи in vitro"). Принят 19 июля 2006 г. Перевод с английского (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования обеспечивает получение информации о коррозийном (разъедающем) действии веществ при их тестирование in vitro и позволяют оценить и классифицировать вещество в соответствии с Согласованной на глобальном уровне системой классификации и маркировки (СГС) по данному виду воздействия.

1.2. Данный экспериментальный метод был разработан для получения информации о коррозии кожи под действием тестированного исследуемого вещества методом мембранного барьера in vitro. Этот метод основан на использовании искусственной мембраны, которая реагирует на коррозионные вещества так же, как и кожа животных in situ. Предлагаемое исследование может проводиться в сочетании с исследованием коррозионного действия in vivo по руководству OECD (метод in vivo), или отдельно.

2. Общие положения

2.1. Коррозия (разъедание) кожи подразумевает необратимые повреждения кожи, проявляющиеся как видимый некроз эпидермиса и дермы после нанесения тестируемого материала, согласно определению Согласованной на глобальном уровне системы классификации опасности и маркировки химической продукции ООН (GHS). В настоящем методе описывается один из возможных методов in vitro, который позволяет проводить оценку коррозионных свойств тестируемых химических соединений без использования живых животных.

2.2. В качестве альтернативы стандартной процедуре проведения исследований на кроликах in vivo (OECD TG 404), применяемой для определения коррозионных веществ, был предложен ряд методов тестирования in vitro. В частности, в настоящем документе описывается метод тестирования in vitro с использованием мембранного барьера, который может применен для выявления коррозионных веществ. Этот метод основан на использовании искусственной мембраны, которая реагирует на коррозионные вещества так же, как и кожа животных in situ.

2.3. Традиционно разъедание кожи оценивалось путем нанесения исследуемого вещества на кожу живых животных и оценки степени разъедания ткани по истечении установленного периода. Поэтапное тестирование и стратегия оценки GHS ООН, применяемые для оценки и классификации разъедания кожи, позволяют использовать прошедшие процедуру валидации и утвержденные методы тестирования in vitro). При использовании такой поэтапной стратегии положительные результаты, полученные методами тестирования in vitro, могут использоваться для классификации вещества как коррозионного без проведения исследований на животных, что, таким образом, способствует сокращению использования животных при проведении исследований. Вещества, показавшие отрицательные результаты, проходят дополнительное тестирование в соответствии с поэтапной стратегией тестирования), (смотрите приложение к руководству по тестированию 404). Соответственно, применение методов выявления коррозионных веществ in vitro помогает избежать боли и стресса, которые могут иметь место при использовании для этих целей животных.

2.4. Валидация описываемого в данном руководстве метода мембранного барьера проводилась с использованием коммерческих тест-наборов. Поскольку сама тест-система уже имела разрешение на использование в лабораторных условиях, данный валидированный стандартный метод был рекомендован для использования в качестве одного из этапов поэтапной стратегии оценки потенциальной коррозионной опасности химических веществ для кожи. До того, как оценку коррозии кожи с нормативно-правовой регламентирующей целью можно будет проводить другими модификациями метода мембранного барьера in vitro, необходимо будет проверить их надежность, соответствие (точность) и ограничения по их предполагаемому использованию, дабы удостовериться, что они сопоставимы с аналогичными характеристиками валидированного стандартного метода тестирования, основанного на тест-системах .

2.5. Ограничение валидированного стандартного метода тестирования, являющегося базисом для настоящего метода, заключается в следующем: согласно результатам предварительного теста на совместимость тестируемого вещества и данного метода, многие некоррозионные химические вещества и их смеси, равно как и некоторые коррозионные вещества и их смеси, не могут быть оценены с помощью данного теста. В частности, водные растворы веществ с pH в диапазоне от 4,5 до 8,5 зачастую не подходят для проведения тестирования - правда, известно, что около 85% химических веществ, растворы которых имеют такие значения pH, не обладают коррозионными свойствами в опытах на животных. Методы тестирования in vitro с использованием мембранного барьера могут использоваться для исследования твердых веществ (как растворимых, так и нерастворимых в воде), жидкостей (смешанных или не смешанных с водой) и эмульсий. Однако химические вещества и их смеси, не вызывающие видимых изменений цвета использующегося в данной системе цветного индикатора (CDS), не могут быть исследованы методом мембранного барьера и должны тестироваться другими методами. В качестве образцов могут использоваться как чистые химические вещества, так и их растворы, сложные коммерческие препараты или отходы. При этом не требуется проводить предварительную обработку образца.

2.6. В настоящем документе по исследованию описывается третий метод in vitro, применяемый при исследованиях коррозионной активности. В ранее выпущенных документах описаны другие методы исследования in vitro, основанные на использовании реконструированной кожи человека (OECD TG 431) и изолированной кожи крысы (OECD TG 430). Кроме того, настоящей метод исследования содержит классификацию коррозионных веществ с делением их на три подкатегории коррозионной активности по классификации GHS и на три группы транспортной упаковки по классификации ООН в зависимости от уровня коррозионной опасности.

3. Принцип метода

3.1. Исследование, описываемое в данном методе, позволяет идентифицировать коррозионные химические вещества и их смеси и проводить их классификацию с делением на подкатегории согласно GHS (табл. 6.4.1.1). Кроме того, данный метод может использоваться для принятия решений относительно коррозионности или некоррозионности отдельных классов химических веществ (например, органических и неорганических кислот, промышленных продуктов, в синтезе которых используются кислоты 1) с использованием этих решений при организации транспортирования веществ данных классов. В данном документе по исследованию описывается общая процедура, сопоставимая с процедурой валидированного стандартного метода тестирования.

3.2. Система тестирования состоит из двух компонентов: синтетического макромолекулярного биобарьера и химической системы детекции (Chemical Detection System, CDS). Метод основан на оценке степени повреждения мембраны после нанесения коррозионного вещества на поверхность искусственного мембранного барьера. При этом предполагается, что механизм повреждения искусственной мембраны сходен с тем, который имеет место при повреждении кожи живых существ.

Таблица 6.4.1.1

Категории и подкатегории коррозионных веществ в соответствии с Согласованной на глобальном уровне системой классификации рисков и маркировки химической продукции ООН (GHS)

Категория коррозионных веществ (категория 1) (применяется ведомствами, не использующими подкатегории)	Подкатегории веществ, которые потенциально могут вызвать коррозию кожи (применяются только некоторыми ведомствами)	Вещества, вызывающие коррозию кожи у из 3 животных
		Экспозиция	Наблюдение
Коррозионные	Подкатегория коррозии 1А	минуты	час
	Подкатегория коррозии 1В	>3 минуты/ час	дней
	Подкатегория коррозии 1C	>1 час/ часов	дней

3.3. Факт проникновения вещества в мембранный барьер (или проба барьера) можно измерять несколькими способами - например, по изменению цвета pH-индикатора или по изменению некоторых других характеристик индикаторного раствора, расположенного под барьером.

3.4. Каждый новый вид мембранного барьера перед использованием в данном методе должен пройти процедуру валидации на надежность и соответствие требованиям метода. В частности, при этом необходимо удостовериться, что данный вид барьера совместим с тестированием разных видов препаратов - например, способен быть барьером для некоррозионных веществ и позволяет классифицировать коррозионные вещества по различным подкатегориям коррозионной активности. Данная классификация основана на измерении времени, необходимого для проникновения вещества через мембранный барьер к индикаторному раствору.

4. Описание метода

4.1. Процедура

4.1.1. Общее описание.

Приводится общее описание компонентов и процедур метода тестирования с использованием искусственного мембранного барьера, применяемого для оценки коррозионной активности. Мембранный барьер, раствор совместимости/индикаторный раствор и растворы для классификации по категориям могут быть созданы самостоятельно, модифицированы на основе существующих или приобретены на коммерческих условиях, как, например, (см. рис. 6.4.1.1). Протокол тестирования образцов для валидированного стандартного метода тестирования можно получить по следующей ссылке [http://iccvam.niehs.nih.gov]. Тестирование должно проводиться при комнатной температуре 17-25°С, и компоненты должны соответствовать условиям, указанным ниже.

4.1.2. Тест на совместимость тестируемых веществ с данным методом.

До проведения тестирования вещества методом мембранного барьера выполняется тест на совместимость, позволяющий определить, может ли данное тестируемое вещество оцениваться при помощи данной системы CDS. Если система CDS не выявляет тестируемое вещество, то метод тестирования с помощью мембранного барьера не подходит для оценки потенциальной коррозионной активности данного тестируемого вещества, и, соответственно, необходимо использовать другой метод тестирования. Система CDS и условия экспозиции, применяемые в тесте на совместимость, должны соответствовать экспозициям в основном тесте.

Тест классификации тестируемого вещества по категориям с учетом шкалы времени

Если требуется классифицировать тестируемое вещество по категориям коррозийности, то после прохождения теста на совместимость используют вариант постановки данного метода с оценкой временных параметров прохождения вещества через барьер, позволяющий различить слабые и сильные кислоты и щелочи. Например, в валидированном стандартном методе тестирования имеется тест классификации веществ по категориям с учетом временных параметров, который позволяет определить, какую из двух временных шкал необходимо использовать в зависимости от буферной емкости препарата.

4.1.3. Компоненты метода тестирования с использованием мембранного барьера.

4.1.3.1. Мембранный барьер.

Мембранный барьер должен состоять из двух компонентов: белкового макромолекулярного водного геля и проницаемой поддерживающей мембраны. Белковый гель должен быть исходно не проницаем для жидкостей и твердых веществ и становиться проницаемым только после повреждения путем коррозии. Полностью собранный мембранный барьер должен храниться при соблюдении заранее выявленных условий, предотвращающих повреждение геля, а именно: высыхание, рост микроорганизмов, смещение и образование трещин, которые могут стать причиной ухудшения функциональных характеристик геля. Необходимо заранее определить приемлемый период хранения используемых мембранных барьеров и не использовать их после истечения этого срока.

Проницаемая поддерживающая мембрана обеспечивает механическую поддержку для белкового геля во время процесса гелеобразования и воздействия на него тестируемого вещества. Поддерживающая мембрана должна предотвращать прогиб и смещение геля и быть легко проницаемой для всех тестируемых веществ.

Мишенью для тестируемого вещества является белковый гель, приготовленный из таких белков, как кератин, коллаген или смеси белков, образующих гелевую матрицу. Раствор белка наносится на поверхность поддерживающей мембраны, где он полимеризуется, после чего образующийся мембранный барьер помещают над индикаторным раствором. Толщина и плотность белкового геля должны быть равномерны по всей его площади; кроме того, гель не должен содержать воздушных пузырьков или дефектов, которые могли бы снизить его функциональную целость.

4.1.3.2. Система химической детекции (CDS).

Индикаторный раствор, который представляет собой такой же раствор, как и при проведении теста на совместимость, реагирует на присутствие тестируемого вещества. Разрешается использовать любые pH-индикаторные красители или их смеси, например, крезоловый красный или метиловый оранжевый, которые будут реагировать изменением цвета на попадание в раствор тестируемых веществ; также могут использоваться другие виды химических или электрохимических реакций. Система измерения эффекта может быть визуальной или электронной.

Необходимо оценить соответствие и надежность систем детекции, разрабатываемых для определения прохождения тестируемого вещества через барьерную мембрану, путем подтверждения их способности определять вещества, которые могут быть выявлены данным методом, и оценки чувствительности детекции.

4.2. Выполнение теста

4.2.1. Сборка компонентов для проведения тестирования.

Мембранный барьер размещается в флаконе, содержащем индикаторный раствор, таким образом, чтобы поддерживающая мембрана вступила в полный контакт с индикаторным раствором без наличия воздушных пузырьков. Необходимо убедиться, что мембранный барьер сохранил свою целость.

4.2.2. Нанесение тестируемого вещества.

Подходящее количество тестируемого вещества - например, 500 мкл жидкости или 500 мг тонкоизмельченных твердых веществ - осторожно выкладывается слоем на верхнюю поверхность мембранного барьера и равномерно распределяется. Для каждого тестируемого вещества и соответствующих контролей готовится нужное количество параллельных проб - например, четыре. Время нанесения тестируемого вещества на мембранный барьер регистрируется. Для точного соблюдения коротких отрезков времени экспозиции внесение тестируемого вещества в параллельные пробы проводится с определенным фиксированным сдвигом.

4.2.3. Оценка проникновения вещества через мембранный барьер.

За каждым флаконом ведется соответствующее наблюдение и записывается время, по истечении которого появляются первые признаки изменения цвета индикаторного раствора, свидетельствующие о прохождении вещества через барьер. После этого определяется время между нанесением вещества на гель и его проникновением через мембранный барьер.

4.2.4. Контрольные пробы.

Растворитель или наполнитель, использующийся для нанесения тестируемого вещества, должны быть совместимы с использующейся системой мембранного барьера, а именно - они не должны влиять на целость мембранного барьера и коррозионную активность тестируемого вещества. При наличии возможности, тестирование растворителя или наполнителя должно проводиться параллельно с тестированием данного вещества для доказательства совместимости растворителя с данным мембранным барьером.

Для оценки эффективности тест-системы, параллельно с тестируемым веществом должен проводиться и позитивный контроль с использованием эталонного вещества, имеющего среднюю коррозионную активность, например гидроксид натрия (GHS подкатегория коррозии 1В). Полезным является также использование второго положительного контроля, выбранного из веществ того же химического класса. Не следует использовать в качестве позитивного контроля высоко коррозионные вещества подкатегории 1А. Рекомендуется выбирать эталонные вещества среди химических соединений с промежуточной коррозионной активностью (GHS подкатегория коррозии 1 В), чтобы скорость их прохождения через мембранный барьер не была слишком быстрой или слишком медленной. Это обеспечит удобный контроль для тестирования веществ как с очень быстрой, так и с очень медленной скоростью пробоя мембранного барьера. Вещество со слабой коррозионной активностью (GHS подкатегория 1C) может использоваться как положительный контроль для оценки способности метода тестирования к разграничению слабокоррозионных и некоррозионных веществ. Независимо от применяемого подхода, должны быть установлены приемлемые границы диапазона реакции тест-системы на данное стандартное вещество, выбранное для использования в качестве положительного контроля; для этого усредняются полученные с ним времена пробоя барьера и оцениваются границы диапазона в виде среднего значения величины стандартного отклонения. В каждом исследовании необходимо измерять точное время пробоя для положительного контроля, для того чтобы можно было определять отклонения, выходящие за пределы приемлемого диапазона.

Химические вещества отрицательного контроля, не вызывающие коррозии, как, например, 10%-я лимонная кислота, 6%-я пропионовая кислота, также должны использоваться параллельно с тестируемым веществом как дополнительная мера контроля качества для подтверждения функциональной целости мембранного барьера.

4.2.5. Критерии приемлемости теста.

Согласно временным параметрам, установленным для каждой подкатегории веществ, в классификации GHS, время (в минутах), которое прошло с момента нанесения тестируемого вещества на мембранный барьер и до момента его проникновения через барьер, используется для оценки разъедающего потенциала тестируемого вещества. Для того чтобы исследование можно было рассматривать как приемлемое, параллельно поставленный положительный контроль должен вызвать пробой мембранного барьера в ожидаемом промежутке времени, отрицательный контроль не должен вызывать коррозии мембраны, и при условии включения в тестирование контроля на растворитель последний не должен оказывать коррозионного действия или изменять коррозионный потенциал исследуемого вещества. До начала рутинного использования метода тестирования, описанного в настоящем документе, лаборатории имеют возможность отработать технику проведения исследования, используя двенадцать рекомендованных химических веществ, перечисленных в табл. 6.4.1.2. Для новых разработанных модификаций данного метода, имеющих структурное и функциональное сходство с утвержденным стандартным протоколом, следует использовать стандарты соответствия, описываемые в прилож. 6.4.1.1, для подтверждения надежности и точности нового протокола тестирования до его применения для нормативных целей.

Таблица 6.4.1.2

Химические вещества с установленной коррозионной активностью

Химические вещества	Номер CAS	Класс химических веществ	Подкатегория GHS ООН*
Азотная кислота	7697-37-2	Неорганические кислоты	1А
Пятихлористый фосфор	10026-13-8	Неорганические кислоты - прекурсоры	1А
Селеновая кислота	7783-08-6	Неорганические кислоты	1А
Хлорангидрид валериановой кислоты	638-29-9	Хлорангидриды кислот	1В
Гидроксид натрия	1310-73-2	Неорганические основания	1В
1-(2-Аминоэтил) пиперазин	140-31-8	Алифатические амины	1В
Бензолсульфонил хлорид	98-09-9	Хлорангидриды кислот	1C
Гидроксиламин сульфат	10039-54-0	Органические аммониевые соли	1C
Т етраэтиленпентамин	112-57-2	Алифатические амины	1C
Эвгенол	97-53-0	Фенолы	н/к**
Нонил акрилат	2664-55-3	Акрилаты/Метакрилаты	н/к
Бикарбонат натрия	144-55-8	Неорганические соли	н/к
* Группы требований к упаковке ООН -I, II и III для подкатегорий коррозионности ООН GHS 1А, 1В и 1C соответственно. ** не обладает коррозионными свойствами

Вышеприведенный список из двенадцати химических веществ содержит по три вещества из каждой подкатегории коррозионных веществ согласно классификации GHS и три некоррозионных вещества. Эти вещества были взяты из списка, состоящего из 40 стандартных химических веществ, включенных в минимальный список химических веществ, прошедших оценку коррозионности методами с установленной точностью и надежностью и имеющих структурное и функциональное сходство с валидированным стандартным методом тестирования (см. прилож. 6.4.1.1). Эти химические вещества можно легко приобрести у коммерческих поставщиков, а сама классификация GHS ООН основана на результатах высококачественных тестов in vivo.

5. Данные, интерпретация и отчет

5.1. Данные.

Значения времени (в минутах), прошедшего с момента нанесения тестируемого и эталонного веществ и до момента их проникновения через мембранный барьер, должно быть указано в отчете в виде таблицы, включая данные параллельных проб и средние значения стандартное отклонение для каждой концентрации вещества.

5.2. Интерпретация результатов и классификация тестируемых веществ по степени коррозионности.

Время (в минутах), которое прошло с момента нанесения тестируемого вещества на мембранный барьер и до момента его проникновения через барьер, используется для классификации исследуемых веществ по субкатегориям коррозионности, и при необходимости по субкатегориям требований ООН к их транспортированию. Для каждого предлагаемого метода тестирования устанавливаются критические диапазоны временных значений пробоя мембраны для каждой из трех подкатегорий коррозионной способности веществ. Устанавливая границы диапазонов между подклассами коррозионных веществ, следует минимизировать риск занижения коррозионной опасности веществ (то есть риск возникновения ложноотрицательных результатов).

5.3. Отчет по результатам тестирования.

Отчет по результатам тестирования должен включать следующую информацию.

Исследуемые и контрольные вещества:

- идентификационные данные и регистрационный номер Химической реферативной службы (CAS), если он известен;

- физические свойства и степень чистоты препарата (с указанием основных примесей);

- физико-химические характеристики, имеющие отношение к проведению исследования;

- детали подготовки тестируемых/контрольных образцов до проведения исследования (например, нагревание, измельчение);

- стабильность, при наличии таких данных.

Обоснование используемой модели мембранного барьера и используемого протокола, включая доказательства точности и надежности.

Условия проведения теста:

- описание используемой аппаратуры и подготовительных процедур;

- источник и состав используемого мембранного барьера in vitro;

- состав и характеристики индикаторного раствора;

- метод оценки эффекта;

- количество тестируемого и эталонного веществ;

- количество параллельных проб;

- описание и обоснование классификации по субкатегориям с учетом шкалы времени;

- метод нанесения вещества;

- время наблюдений.

Результаты:

- сведение в таблицы исходных данных по каждому тестируемому и контрольному образцу, включая данные параллельных проб;

- описание иных наблюдавшихся эффектов;

- описание критериев оценки и классификации.

Обсуждение результатов.

Выводы.