Приложение 6.8.15. Генетическая токсикология: Метод оценки внепланового синтеза ДНК (ВСД) в клетках печени млекопитающих in vivo

Приложение 6.8.15

Генетическая токсикология: Метод оценки внепланового синтеза ДНК (ВСД) в клетках печени млекопитающих in vivo

Идентичен международному документу OECD TG N 486 "Genetic Toxicology: Unscheduled DNA Synthesis (UDS) Test with Mammalian Liver Cells In Vivo" (ОЭСР Руководство N 486 "Генетическая токсикология: Метод оценки внепланового синтеза ДНК (ВСД) в клетках печени млекопитающих in vivo"). Принят 21 июля 1997 года. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает порядок проведения испытания химических веществ методом оценки внепланового синтеза ДНК (ВСД) в клетках печени млекопитающих in vivo с целью выявления веществ, которые индуцируют репарацию ДНК в клетках печени экспериментальных животных (1-4).

1.2. Тест направлен на оценку генотоксических эффектов химических веществ в печени in vivo. Анализируемые события - повреждения ДНК и их последующая репарация в клетках печени. Печень - основное место метаболизма абсорбированных соединений, поэтому она наиболее подходит для оценки повреждений ДНК in vivo.

2. Общие положения

2.1. По изучаемому соединению представляют следующие данные:

- твердое, жидкое, пары или газообразное вещество;

- химическая идентификация вещества;

- чистота (примеси) вещества;

- растворимость;

- температура плавления/кипения вещества;

- рН (где необходимо);

- давление паров (если имеются данные).

2.2. Если имеются данные, что исследуемое вещество не достигает органа-мишени, использовать данный тест не следует.

2.3. ВСД оценивают, определяя включение меченых нуклеозидов в клетку, в которой в данный момент не проходит плановый (в S-фазе) синтез ДНК. Наиболее широко применяется авторадиографическая методика оценки включения меченного тритием тимидина . Предпочтительно использовать для анализа ВСД печень крыс. Помимо печени можно исследовать другие ткани, но это не является предметом рассмотрения данного документа.

2.4. Выявление ВСД зависит от числа вырезанных и замененных оснований ДНК в точке повреждения. В связи с этим тест ВСД особенно подходит для оценки веществ, индуцирующих "longpatch repair" (20-30 оснований). Для "shortpatch repair" (1-3 основания) этот тест имеет значительно меньшую чувствительность. Некоторые мутагенные события могут быть нерепарируемы, вызывать ошибочную репарацию или ошибочную репликацию ДНК-повреждений. Степень ответа ВСД не указывает на точность процесса репарации. К тому же, возможно, мутаген реагирует с ДНК, но повреждения ДНК не репарируются путем эксцизионной репарации. Отсутствие специфической информации о мутагенной активности при проведении ВСД-теста компенсируется потенциальной чувствительностью этого события при оценке целого генома.

3. Принцип метода

3.1. Метод оценки ВСД в клетках печени млекопитающих in vivo выявляет репаративный синтез ДНК после вырезания и удаления части ДНК в участке индуцированным химическим веществом или физическим фактором повреждения. Наиболее часто тест основан на включении в ДНК клеток печени, которая характеризуется низкой долей клеток в S-фазе клеточного цикла. Включение 3Н-тимидина обычно выявляют авторадиогафически, поскольку эта техника менее чувствительна к помехам, создаваемым клетками в S-фазе, по сравнению с методикой жидкостно-сцинтилляционного подсчета.

4. Описание метода

4.1. Материалы

Животные

4.1.1. Обычно используют крыс, хотя можно использовать другие виды млекопитающих. Наиболее часто опыты проводят на молодых, здоровых взрослых животных лабораторных штаммов. В начале эксперимента колебания массы животных должны быть минимальны, не превышая средней массы животных каждого пола.

Условия содержания и кормления

4.1.2. Температура в экспериментальных комнатах вивария должна быть . Относительная влажность должна быть не ниже 30% и не превышать 70% во время уборки, оптимально 50-60%. Освещение искусственное. Световой режим: 12 часов освещение, 12 часов темнота. Может быть использована стандартная лабораторная диета без ограничения питьевой воды. На выбор диеты может влиять необходимость приготовления особой смеси корма при введении вещества с кормом. Животных содержат в клетках индивидуально или небольшими группами.

Подготовка животных

4.1.3. Методом случайного отбора формируют контрольные и экспериментальные группы молодых взрослых животных. Клетки располагают таким образом, чтобы минимизировать возможные эффекты вследствие перемещения клеток. Каждое животное идентифицируют и содержат в клетках, по крайней мере, в течение 5 дней до начала опыта для акклиматизации к лабораторным условиям.

Приготовление исследуемых соединений

4.1.4. Твердые соединения растворяют или суспендируют в соответствующем растворителе и разводят, если необходимо, перед введением животным. Жидкие вещества можно вводить прямо или разводить перед введением. Пока стабильность растворов исследуемого вещества при соответствующем хранении не будет показана, следует использовать свежие растворы.

4.2. Условия испытания

Растворитель

4.2.1. Растворитель не должен вызывать токсические эффекты при использованных уровнях доз и не должен вступать в реакцию с исследуемым веществом. Если используется малоизвестный растворитель, его включение должно быть обосновано данными, указывающими на совместимость с исследуемым веществом. По возможности рекомендуется использовать водные растворы.

Контроли

4.2.2. Соответствующие положительные и отрицательные (растворитель) контроли должны быть включены в каждую независимую часть опыта. Исключая обработку животных тестируемым веществом, животные контрольных групп должны находиться в тех же условиях, что и животные экспериментальных групп.

4.2.3. В качестве положительного контроля следует брать вещества, которые индуцируют ВСД, вызывая в используемых дозах значимое повышение эффекта над контролем. Положительные контроли, нуждающиеся в метаболической активации, следует использовать в дозах, дающих умеренный эффект [4]. Дозы положительного контроля следует подбирать так, чтобы был четкий эффект, но в то же время его уровень не позволял исследователю определить зашифрованный препарат группы положительного контроля. Примеры веществ положительного контроля приведены ниже.

Время забоя	Вещество и номер CAS
Раннее время забоя (2-4 часа)	N-нитрозодиметиламин [номер CAS 62-75-9]
Позднее время забоя (12-16 часов)	N-2-флуоренфцетамид (2-ААФ) [номер CAS 62-75-9] [номер CAS 53-96-3]

4.3. Проведение эксперимента

Число и пол животных

4.3.1. Следует использовать адекватное число животных, принимая во внимание биологические вариации в ответе. Должно быть, по крайней мере, 3 пригодных для анализа животных на группу. При наличии достаточного числа полученных ранее исторических данных, 1-2 животных можно брать для групп отрицательного и положительного контролей.

4.3.2. Если к моменту проведения эксперимента имеются данные исследований, проведенных на том же виде животных и при том же пути введения вещества, которые показывают отсутствие существенных различий в токсичности между животными разного пола, то достаточно проведение опыта на животных одного пола, предпочтительно на самцах.

Схема введения

4.3.3. Преимущественно используется однократное введение вещества.

Уровни доз

4.3.4. Обычно используют, по крайней мере, два уровня доз. Наибольшая доза определяется как доза, вызывающая такие признаки токсичности, которые при повышении уровня доз при том же режиме затравки указывают на возможность летального эффекта. Обычно низкая доза составляет от 50 до 25% от высокой дозы. Вещества со специфической биологической активностью при низких нетоксических дозах (такие, как гормоны и митогены) могут быть исключением для критериев установления дозы, и дозы должны устанавливаться для каждого конкретного случая. Если при отсутствии подходящих данных проводится исследование по определению уровня доз, то оно должно быть проведено в той же лаборатории, на животных того же вида, пола и возраста и в том же режиме воздействия, которое будет использовано в основном эксперименте.

4.3.5. Максимальная доза может быть также определена как доза, вызывающая некоторые проявления токсичности в печени (например, пикнотические ядра).

Ограничения теста

4.3.6. Если в опыте с дозой около 2 г/кг массы тела при однократном режиме воздействия или при 2 введениях в один день не выявлено токсическое действие, и если генотоксичность не предполагается по результатам исследований сходных по структуре соединений, тогда полное исследование можно не проводить. Ожидаемая экспозиция для человека может указывать на необходимость использования более высоких доз в опытах по установлению лимитов.

Введение вещества

4.3.7. Исследуемое вещество обычно вводят внутрижелудочно, используя желудочный зонд или подходящую интубационную канюлю. Возможно применение других способов введения при их обосновании. Однако внутрибрюшинный путь введения не рекомендуется, так как исследуемое вещество может прямо воздействовать на печень, а не через систему циркуляции. Максимальный объем жидкости, который вводят внутрижелудочно или путем инъекции зависит от размеров экспериментальных животных. Объем не должен превышать 2 мл на 100 г массы тела. Использование больших объемов должно быть обосновано. Исключение составляют раздражающие и разъедающие вещества, которые вызывают раздражающий эффект в высоких концентрациях. Вариации вводимых объемов должны быть минимизированы путем приготовления концентраций растворов, позволяющих вводить постоянный объем для всех 3 уровней доз.

Приготовление препаратов клеток печени

4.3.8. В норме препараты клеток печени готовят через 12-16 часов после введения вещества животным. Если нет четкого положительного ответа при умерщвлении через 12-16 часов, необходимо дополнительное более раннее время забоя (обычно 2-4 часа после введения вещества). Можно использовать другие интервалы времени забоя животных после введения вещества, если имеется обоснование на основе данных по токсикокинетике.

4.3.9. Краткосрочные культуры клеток печени млекопитающих обычно готовят, проводя перфузию печени in situ коллагеназой и давая диссоциированным клеткам печени прикрепиться к поверхности. Клетки печени животных группы отрицательного контроля должны иметь выживаемость, по крайней мере, 50% [5].

Определение ВСД

4.3.10. Свежеизолированные клетки печени млекопитающих обычно инкубируют в среде, содержащей в течение определенного интервала времени, т.е. 3-8 часов. По окончании времени инкубации среду удаляют, а клетки инкубируют со средой, содержащей избыток немеченого тимидина, чтобы снизить неинкорпорированную радиоактивность ("холодная замена"). При более длительном времени инкубации "холодная замена" не является необходимой. Затем клетки отмывают, фиксируют и высушивают. Стекла погружают в радиоактивную эмульсию, экспонируют в темноте (охлажденные в течение 7-14 дней), проявляют, окрашивают и подсчитывают число гранул серебра. На каждое животное делают 2-3 стекла.

Анализ

4.3.11. Препараты должны содержать достаточное количество клеток нормальной морфологии, чтобы провести корректный анализ ВСД. Препараты анализируют под микроскопом для учета показателей цитотоксичности (пикноз, сниженный уровень радиоактивной метки).

4.3.12. Перед учетом гранул все стекла должны быть зашифрованы. Обычно на животное подсчитывают 100 клеток, по крайней мере, на 2 стеклах. Подсчет менее 100 клеток на животное должен быть обоснован. Гранулы не подсчитывают над ядрами в S-фазе, однако доля клеток в S-фазе может быть учтена.

4.3.13. Применяя соответствующие методы, следует определить количество инкорпорированного в ядра и цитоплазму морфологически нормальных клеток, используя в качестве показателя гранулы серебра.

4.3.14. Гранулы серебра определяют над ядром (ядерные гранулы, ЯГ) и над районами цитоплазмы (цитоплазматические гранулы, ЦГ). Количество ЦГ подсчитывается либо в наиболее нагруженных метками участках цитоплазмы, либо как среднее из 2-3 случайных цитоплазматических участков, прилегающих к ядру. Возможно применение других методик подсчета (например, подсчет во всей клетке), если этот способ обоснован [6].

5. Результаты и отчет

5.1. Обработка результатов

5.1.1. Следует привести данные по каждому стеклу и животному. Все данные необходимо суммировать в табличной форме. Для каждой клетки, каждого животного, каждой дозовой группы и времени воздействия рассчитывается количество (net) ядерных гранул репарации (ЯГР), вычитая из количества ЯГ количество ЦГ (ЯГР = ЯГ - ЦГ). Если учитывают "клетки в состоянии репарации", критерий определения "клетки в состоянии репарации" должен быть обоснован и сопоставлен с историческими данными или соответствующими результатами отрицательного контроля.

Оценка и интерпретация результатов

5.1.2. Примеры критериев отнесения результатов к положительному или отрицательному ответу:

положительный	1	величина ЯГР выше ранее установленного порога, который установлен на основе исторических данных лаборатории
	2	величина ЯГР значимо выше, чем данные в контроле опыта
отрицательный	1	величина ЯГР в пределах или ниже ранее известного порога, который установлен на основе исторических данных лаборатории
	2	величина ЯГР незначимо выше, чем данные в контроле опыта

5.1.3. Следует учитывать биологическую значимость результата, т.е. принимать во внимание такие параметры, как вариацию показателя между животными, зависимость эффекта от дозы, цитотоксичность. Статистическая значимость не является единственным критерием для доказательства положительного ответа.

5.1.4. Хотя в большинстве экспериментов получаются четко положительные или отрицательные результаты, в редких случаях полученные данные не позволяют сделать однозначное заключение об активности исследуемого вещества. Результаты могут оставаться противоречивыми или сомнительными независимо от числа проведенных повторов.

5.1.5. Положительные результаты в тесте ВСД в клетках печени млекопитающих in vivo, показывают, что вещество индуцирует повреждения ДНК в клетках печени млекопитающих in vivo, которые могут быть репарированы путем внепланового синтеза ДНК in vitro. Отрицательные результаты указывают, что в условиях эксперимента вещество не индуцирует ДНК-повреждения, которые выявляются в данном тесте.

5.1.6. Должна быть обсуждена вероятность того, что исследуемое вещество попадает в общую систему циркуляции организма или в специфические ткани мишени (т.е. системная токсичность).

5.2. Отчет

Отчет должен включать следующую информацию.

Исследуемое соединение:

- идентификационные данные и номер CAS, если известен;

- физическая природа и чистота;

- физико-химические параметры, имеющие значение для данного исследования;

- стабильность.

Растворитель:

- обоснование выбора растворителя;

- растворимость и стабильность исследуемого вещества в растворителе, если известно.

Животные:

- вид и линии животных;

- количество животных, возраст и пол;

- откуда получены животные, условия содержания и кормления и т.д.;

- масса каждого животного на начало опыта, включая для каждой группы колебания массы тела, среднее и стандартное отклонение.

Условия эксперимента:

- положительные и отрицательные (растворитель) контроли;

- данные эксперимента для подбора дозы, если проводился;

- обоснование выбора доз;

- детальное описание приготовления вещества;

- детальное описание введения вещества;

- обоснование пути введения вещества;

- методы контроля того, что вещество попало в общую систему циркуляции или в орган-мишень, если проводили;

- пересчет концентрации исследуемого вещества в питьевой воде или пище в дозу вещества (мг/кг массы тела в день) (если это проводили);

- детальное описание схемы обработки и забора материала;

- методы оценки токсичности;

- методы приготовления препаратов клеток печени и культур;

- использованная методика авторадиографии;

- число приготовленных стекол и число проанализированных клеток;

- критерии оценки;

- число анализируемых клеток на животное;

- критерии учета результата как позитивный, негативный или сомнительный.

Результаты:

- среднее значение ядерных гранул, цитоплазматических гранул и ядерных гранул репарации по отдельным стеклам, животному и группе;

- оценка зависимости эффекта от дозы, где это возможно;

- статистический анализ, если проводили;

- признаки токсичности;

- данные по отрицательному (растворитель) и положительному контролю;

- исторические данные по отрицательному (растворитель) и положительному контролю с колебаниями показателя, среднему значению и стандартному отклонению;

- число "клеток в состоянии репарации", если определяли;

- число клеток в S-фазе, если определяли;

- выживаемость клеток.

Обсуждение результатов.

Заключение.