Приложение 6.8.13. Генетическая токсикология: Спот-тест на мышах

Приложение 6.8.13

Генетическая токсикология: Спот-тест на мышах

Идентичен международному документу OECD TG N 484 "Genetic Toxicology: Mouse Spot Test" (ОЭСР Руководство N 484 "Генетическая токсикология: Спот-тест на мышах"). Международный документ разработан Организацией Экономического Сотрудничества и Развития (ОЭСР/OECD), принят 23 октября 1986 г. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает порядок проведения испытания химических веществ методом оценки предполагаемых соматических мутаций в клетках плода после трансплацентарного воздействия исследуемого вещества.

2. Общие положения

2.1. По изучаемому соединению представляют следующие данные:

- твердое, жидкое, пары или газообразное вещество;

- химическая идентификация вещества;

- чистота (примеси) вещества;

- растворимость;

- температура плавления/кипения вещества;

- рН (где необходимо);

- давление паров (если имеются данные).

3. Принцип метода

3.1. Тест проводится на мышах in vivo, воздействию вещества подвергается развивающийся эмбрион. В развивающемся эмбрионе клетками-мишенями являются меланобласты, а генами-мишенями - гены, которые контролируют пигментацию волос шкурки. Развивающиеся эмбрионы - гетерозиготы по ряду генов окраски шкурки. Мутации в таком доминантном гене или потеря этого гена в меланобластах приводит к экспрессии рецессивного фенотипа у потомков этих клеток, формируя пятна с измененной окраской на шкурке мышей. Частота таких пятен в опытных группах животных сравнивается с частотой таких пятен в контрольной группе.

4. Описание метода

4.1. Материалы

Тестируемое вещество

4.1.1. Если возможно, исследуемое вещество растворяют или суспендируют в изотоническом солевом растворе. Вещество, не растворимое в воде, растворяют или суспендируют в соответствующем растворителе. Используемый растворитель не должен взаимодействовать с исследуемым веществом или вызывать токсические эффекты.

Экспериментальные животные

4.1.2. Мышей линии Т (nonagouti, а/а; chinchilla, pink eye, ; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald spotting, s/s) скрещивают или с HT линией (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, In fz/ln fz; pearl ре/ре), или с C57/B1 (nonagouti, a/a). Возможны другие варианты скрещивания, например между NMRI (nonagouti, а/а; albino, с/с) и DBA (nonagouti, а/а; brown, b/b; dilute, d/d), при условии, что они дают мышей nonagouti.

Число и пол животных

4.1.3. Выборка беременных самок, которым вводят вещество, должна обеспечить необходимое число выживших животных в группах с каждым уровнем дозы вещества. Необходимый размер выборки определяется числом пятен в опытных группах мышей и количеством пятен в контроле.

4.2. Условия испытания

Путь введения

4.2.1. Обычно используют внутрижелудочное или внутрибрюшинное введение вещества беременным самкам. Может быть использован ингаляционный и другие пути введения. Внутрибрюшинное введение, возможно, наиболее подходит для выявления мутаций. Максимально адекватным для оценки риска является путь введения, соответствующий экспозиции человека.

Уровни доз

4.2.2. Тестируют, по крайней мере, 2 дозы, включая одну, при которой имеются признаки токсичности или снижение размера помета. Относительно нетоксичные вещества следует тестировать в дозе до 1 г/кг, или, если это не получается, в максимально достижимой дозе.

Контроли

4.2.3. Должна быть контрольная группа мышей, получающая только растворитель (отрицательный контроль). Дополнительно можно использовать данные исторического контроля лаборатории при условии их гомогенности. Если имеются данные положительных контролей в недавно проведенных в лаборатории экспериментах (в пределах последних 12 месяцев), их можно использовать, не проводя соответствующий положительный контроль.

4.3. Проведение эксперимента

4.3.1. Однократное введение проводят в норме на 8-, 9- или 10-й день беременности, считая первым днем беременности день, когда обнаружена вагинальная пробка. Эти сроки соответствуют 7,25, 8,25 или 9,25 дню после зачатия. Могут быть также использованы введения на больших сроках беременности.

4.3.2. Мышей шифруют и проводят подсчет пятен в возрасте от 3 до 4 недель после рождения. Различают три класса пятен:

а) белые пятна в пределах 5 мм от средне-брюшной линии, которые являются предположительно результатом гибели клеток (WMVS);

б) желтые, агутиподобные пятна, расположенные в районе молочных желез, гениталий, горла, в подмышечных и паховых областях и середине лба, которые предположительно являются результатом мисдифференцировки (MDS);

в) пигментированные и белые пятна, случайно расположенные на шкурке, которые предположительно являются результатом соматических мутаций (RS).

4.3.3. Подсчитывают все три класса пятен, но только последние (RS) относятся к генетическим событиям. Проблема различий между MDS и RS может быть решена при флуоресцентной микроскопии образцов волос.

5. Результаты и отчет

5.1. Обработка результатов

5.1.1. Данные следует представлять в виде таблиц. Приводят общее число проанализированных мышей и число пятен, предполагаемых как результат соматических мутаций. Также должны быть представлены результаты на помет.

5.1.2. Данные обрабатывают соответствующими статистическими методами.

Оценка результатов

5.1.3. Имеются разные критерии определения позитивного результата. Один из них - статистически значимое повышение частоты генетически индуцированных пятен с увеличением дозы вещества. Другой критерий основан на выявлении статистически значимого позитивного ответа, выявленного хотя бы в одной экспериментальной точке.

5.1.4. Вещество, не вызывающее ни статистически значимого повышения частоты генетически индуцированных пятен на любой экспериментальной точке, ни статистически значимого возрастания частоты генетически индуцированных пятен с увеличением дозы, считается не мутагеном в данной тест-системе.

5.2. Отчет

Отчет должен содержать следующую информацию:

- линии мышей, используемых в скрещивании;

- число беременных самок в экспериментальных и контрольных группах;

- средний размер помета в экспериментальных и контрольных группах при рождении и в возрасте отъема от груди;

- уровни доз вещества;

- используемый растворитель;

- день беременности, на котором вводили вещество;

- путь введения вещества;

- общее число мышей, у которых проводился анализ пятен; число WMVS, MDS и RS в экспериментальных и контрольных группах;

- общее число проанализированных пометов; число WMVS, MDS и RS в экспериментальных и контрольных группах;

- грубые морфологические аномалии, если отмечены;

- зависимость RS от дозы вещества, если возможно;

- данные статистической обработки;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.