Приложение 6.1.5. Оценка острой токсичности при ингаляционном поступлении с определением класса острой токсичности

Приложение 6.1.5

Оценка острой токсичности при ингаляционном поступлении с определением класса острой токсичности

Идентичен международному документу OECD TG N 436 "Acute Inhalation Toxicity - Acute Toxic Class Method" (ОЭСР Руководство N 436 "Оценка острой токсичности при ингаляционном поступлении с определением класса острой токсичности"). Принят 7 сентября 2009 года. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает требования к исследованию острой токсичности при ингаляционном поступлении в организм.

1.2. Метод обеспечивает получение информации об острой токсичности вещества при вдыхании и позволяет классифицировать его в соответствии с требованиями Глобальной гармонизированной системы классификации и маркировки химических веществ (GHS) ООН относительно классификации веществ, вызывающих острую токсичность [9]. При необходимости точечной оценки значений или определения зависимости концентрация-эффект следует использовать рекомендации по оценке острой токсичности при ингаляционном поступлении (ОЭСР 403).

1.3. Настоящий метод не предназначен для испытания наноматериалов.

2. Общие положения

2.1. В настоящее время одним из основных путей поступления загрязнителей в организм является ингаляционный. Поэтому в комплексе исследований по воздействию химической продукции на организм человека изучение острой токсичности при вдыхании является ведущим.

2.2. Особенностью метода является получение информации об острой ингаляционной токсичности и последующей классификации испытуемого вещества при 4-часовом периоде введения на основе поэтапной процедуры. В особых нормативно определенных целях могут применяться другие продолжительности введения. На каждом этапе воздействия исследуются по 3 особи каждого пола. В зависимости от смертности и/или агонального состояния животных для оценки острой токсичности испытуемого вещества может потребоваться не более 2 этапов. При наличии данных о том, что особи одного пола более восприимчивы к испытуемому веществу, исследование может продолжаться с использованием особей только этого пола. По результатам предыдущего этапа определяется следующий, то есть:

a) отсутствие необходимости в дальнейшем испытании,

b) испытание на 3 особях каждого пола,

c) испытание на 6 животных более восприимчивого пола, т.е. определение нижнего порога для соответствующего класса токсичности должно быть основано на исследовании группы из 6 животных для каждой концентрации.

2.3. Определение класса острой ингаляционной токсичности позволяет использовать поэтапное введение серии фиксированных целевых концентраций для классификации токсичности испытуемого образца.

2.4. В качестве ключевой конечной точки применяется летальность. Однако животные, испытывающие сильную боль или дистресс, страдающие или находящиеся в предсмертном состоянии, подлежат гуманному умерщвлению для минимизации страданий.

3. Описание тестового метода

3.1. Принципы

3.1.1. Для повышения качества исследования и минимизации количества привлеченных животных вся имеющаяся информация об исследуемом препарате должна находиться в распоряжении экспериментальной лаборатории до начала эксперимента. Информация, которая может помочь при выборе необходимых для испытания концентраций, включает тождественность, химическую структуру и физико-химические свойства испытываемого вещества; результаты опытов на токсичность in vivo или in vitro; предполагаемую область применения и вероятность воздействия на человека; если имеются, то данные (Q)SAR и сведения о токсичности структурно родственных препаратов.

3.1.2. При изучении коррозионных и/или раздражающих продуктов необходимо избегать концентрации, которые могут вызвать сильную боль и страдания.

3.1.3. Коррозионный/раздражающий потенциал должен быть оценен при экспертизе имеющейся информации о воздействии на человека, экспериментальных животных, имеющихся данных в опытах in vitro, величине pH, информации о близких по структуре веществ или любых других данных с целью изучения целесообразности дальнейшего тестирования или его отмены.

3.1.4. При воздействии на животных целевые концентрации должны быть достаточно низкими с тем, чтобы не вызвать боль или нарушения, и достаточно высокими с тем, чтобы расширить кривую концентрация-ответ до уровней, которые соответствуют нормативным и научным целям исследования. Данные концентрации должны быть выбраны отдельно в каждом случае; выбор концентрации должен быть обоснован.

3.1.5. Испытания призваны обеспечить получение информации об острой токсичности исследуемого препарата и его последующую классификацию при 4-часовом периоде введения на основе поэтапной процедуры.

3.1.6. Агонизирующие животные или животные, очевидно испытывающие боль или демонстрирующие признаки страдания и истощения, должны быть гуманно умерщвлены, если нет веских оснований для другого (такие причины должны быть отражены в отчете по исследованию). Агонизирующие животные рассматриваются как животные, погибшие во время испытания.

3.2. Животные

Выбор вида

3.2.1. Необходимо использовать молодых здоровых особей из обычно используемых лабораторных линий. Предпочтительно использовать крыс. В случае использования других видов необходимо привести обоснование.

Подготовка

3.2.2. Самки должны быть нерожавшими и небеременными. На день экспозиции испытываемого препарата животные должны быть в возрасте от 8 до 12 недель, диапазон колебания массы животных для каждого пола не должен превышать от средней массы животных, участвовавших в предыдущем испытании, в такой же отрезок времени. Животные отбираются в случайном порядке и маркируются, что позволит идентифицировать каждое из них. Животных следует содержать в клетках в течение не менее 5 дней до начала испытания, чтобы позволить им адаптироваться к лабораторным условиям. Животным также необходимо дать короткое время приспособиться к исследуемому прибору до начала испытания с целью уменьшить стресс от попадания в новую среду.

Содержание

3.2.3. Температура в помещении, где содержатся экспериментальные животные, должна составлять , оптимальный уровень относительной влажности - 30-70%. В исследовании одного уровня концентрации животных можно поместить в одну камеру, но число животных в камере не должно затруднять возможность наблюдать за каждым из них, а также должно сократить вероятность потерь из-за каннибализма и борьбы. Свойства исследуемого препарата или токсичность (способность вызывать заболевание, возбуждать ЦНС) могут указывать на необходимость содержания животного в индивидуальной камере, чтобы предотвратить каннибализм. Допустимо использование стандартных лабораторных режимов питания, за исключением периода экспозиции испытываемого препарата, во время которого для животного необходимо обеспечить неограниченное потребление питьевой воды. Освещение должно быть искусственным в режиме: 12 часов при свете/12 часов в темноте.

3.3. Ингаляционные камеры

3.3.1. При выборе ингаляционной камеры необходимо учитывать природу исследуемого препарата и нормативные требования. По умолчанию используется интраназальная модель экспозиции (данный термин включает в себя воздействие только через голову, только через нос и только через мордочку). Экспозиция только через нос предпочтительна для изучения аэрозолей жидких и твердых и для паров, которые могут конденсироваться в форме аэрозолей. При этом для решения отдельных задач исследования целесообразно применять воздействие через все тело. Использование другой модели экспозиции помимо той, что применяется по умолчанию, должно быть обусловлено целями исследования и обосновано в отчете.

3.3.2. Для обеспечения атмосферы стабильности при использовании камеры объем, занимаемый телами тестируемых животных, не должен превышать 5% объема камеры.

3.4. Условия экспозиции

Введение концентраций

3.4.1. Рекомендуется использовать фиксированную продолжительность введения, равную 4 часам, включая время уравновешивания. Если требуется более длительный период экспозиции, необходимо привести обоснования. Животных, которые подвергаются воздействию препарата в камерах на все тело, следует содержать по отдельности, чтобы предотвратить проглатывание исследуемого препарата соседями по камере во время чистки. Пища во время экспозиции не дается. Воду можно давать в течение всего времени экспозиции на все тело.

3.4.2. Животные могут подвергаться воздействию исследуемого препарата в виде газа, паров, аэрозоля или их смеси. Исследуемое физическое состояние зависит от физико-химических свойств тестируемого препарата, выбранной концентрации и/или физической формы, которые наиболее приближены к реальным условиям использования изучаемого продукта. Гигроскопичный и химически реактивный препарат следует тестировать в условиях минимальной влажности, в отсутствии паров воды. Особое внимание следует уделять тому, чтобы не создавать взрывоопасные концентрации.

Гранулометрический состав

3.4.3. Определение размера частиц необходимо для всех аэрозолей и всех паров, которые могут конденсироваться и превращаться в аэрозоль. Чтобы обеспечить воздействие на все важные области дыхательных путей, рекомендуется использование аэрозоля с массовым средним аэродинамическим диаметром (MMAD) в диапазоне от 1 до 4 мкм с геометрическим стандартным отклонением в диапазоне от 1,5 до 3,0. В случае, если данное требование невозможно соблюсти, необходимо предоставить экспертную оценку. Например, металлические частицы в воздухе могут быть меньшего размера, чем стандартные, также заряженные частицы, волокна и гигроскопичные материалы (которые увеличиваются в размерах во влажной среде в респираторном тракте) могут превышать размер стандартных.

3.4.4. Для создания необходимой концентрации и размера частиц исследуемого препарата в камере используется растворитель. В качестве растворителя предпочтительней использовать воду. Зернистый материал может быть подвергнут механическим процессам, чтобы добиться требуемого гранулометрического состава, при этом необходимо позаботиться о том, чтобы состав исследуемого препарата не разложился и не изменился. Если есть опасение, что в результате механических процессов состав тестируемого препарата претерпит изменения (например, чрезмерно высокая температура в процессе сильного дробления вследствие трения), то состав тестируемого препарата необходимо проверить при помощи анализа. При этом необходимо проследить, чтобы не занести в препарат загрязняющие вещества.

Контрольные животные

3.4.5. В параллельном использовании отрицательных (воздухом) контрольных групп необходимости нет. В случае, если для получения нужной концентрации испытываемого вещества в воздухе используется какой-либо растворитель, помимо воды, то контрольную группу следует использовать только в случае отсутствия справочных данных о токсичности растворителя при ингаляционном воздействии. Если исследование токсичности препарата, содержащего растворитель, показывает отрицательный результат, то из этого следует, что растворитель нетоксичен при исследуемых концентрациях; следовательно, в испытании растворителя нет нужды.

Воздушные потоки в камере

3.4.6. Воздушные потоки, проходящие через камеру, необходимо тщательно контролировать, непрерывно наблюдать и фиксировать по меньшей мере раз в час на протяжении всего периода выдержки. Наблюдение за концентрацией исследуемого вещества в газовой среде (или устойчивостью) представляет собой интегральное вычисление всех динамических параметров и обеспечивает косвенные способы контроля всех значимых параметров для формирования динамической атмосферы. Необходимо избегать возвратного дыхания в камерах, предназначенных для воздействия через нос в случаях, когда воздушные потоки через установку экспонирования недостаточны для динамических потоков исследуемого вещества в газовой среде. Существуют методы, при помощи которых можно установить, что возвратное дыхание при данных условиях эксперимента не имеет места. Концентрация кислорода должна составлять не менее 19%, концентрация углекислого газа - не менее 1%. Если есть основание полагать, что эти требования не удовлетворяются, концентрации кислорода и углекислого газа необходимо измерить.

Температура и относительная влажность в камере

3.4.7. Температура в камере должна составлять . Относительную влажность в зоне дыхания животных, находящихся в камерах, предназначенных как для воздействия только через нос, так и через все тело, необходимо наблюдать и фиксировать не менее трех раз в течение периода выдержки. Идеальная относительная влажность составляет 30-70%, но в определенных случаях (например, тестирование препарата на водной основе) данный уровень может быть неприменим или неизмеряем вследствие взаимовлияния исследуемого препарата и метода исследования.

3.5. Исследуемый препарат

Номинальная концентрация

3.5.1. По возможности следует наблюдать и фиксировать номинальную концентрацию при экспозиции в клетке. Номинальная концентрация - это масса сгенерированного исследуемого вещества, разбавленная общим объемом воздуха, проходящего через систему клетки. Номинальная концентрация не используется при описании экспозиции на животных, но сравнение номинальной и фактической концентраций позволит судить об эффективности генератора в испытательной системе и позволит вовремя выявить проблемы в нем.

Фактическая концентрация

3.5.2. Фактическая концентрация - это концентрация исследуемого препарата в зоне дыхания животных в ингаляционной камере. Фактическая концентрация может быть получена специальными методами (например, методом непосредственного выбора, адсорбционным методом или методом химической реактивности и последующим анализом) или неспециальными методами, например, гравиметрический капельный анализ. Использование гравиметрического анализа допустимо только для однокомпонентных порошкообразных веществ в аэрозольной упаковке или для жидких аэрозолей с невысокой летучестью и должно быть подкреплено предварительно полученными соответствующими специальными характеристиками исследуемого препарата. Концентрацию аэрозоля с многокомпонентным порошком можно также определить с помощью метода гравиметрического анализа. В этом случае потребуются данные анализа, подтверждающие, что состав аэрозольного препарата схож с составом исходного материала. Если подобная информация не имеется, может потребоваться повторный анализ исследуемого вещества (в воздухе) в определенные временные интервалы в течение исследования. Для аэрозольных агентов, которые могут испаряться или сублимироваться, необходимо указать, что для сбора всех этапов был использован выбранный метод. Цели, номинальная и фактическая концентрации должны быть указаны в отчете исследования, но в статистическом анализе для подсчета значения смертельной концентрации используется только фактическая концентрация.

3.5.3. Необходимо использовать только один препарат для тестирования, если это возможно, и исследуемый образец должен храниться в условиях, которые позволят сохранить его чистоту, однородность и стабильность. Перед началом исследования необходимо располагать описанием препарата, включая степень его чистоты, и, если это технически возможно, указать и количество выявленных в нем примесей. Такие сведения можно наглядно показать с помощью следующих, но не ограничиваясь ими, данных: время удержания и относительная площадь пика, молекулярная масса, полученная методом масс-спектроскопии или газовой хроматографии и т.п. Хотя определение тестовых образцов не входит в обязанности испытательной лаборатории, возможно, целесообразно подтвердить поддерживающие характеристики, по крайней мере, в ограниченном виде (цвет, физическая природа и т.д.).

3.5.4. Воздушную среду нужно поддерживать максимально постоянной и проверять непрерывно и/или регулярно в зависимости от метода анализа. При регулярном контроле образцы проб воздуха в камере нужно забирать не реже двух раз за четыре часа во время исследования. Если это невозможно вследствие ограниченных воздушных потоков или низкой концентрации, за все время проведения исследования допускается отбор одной пробы. Если образцы демонстрируют разные показатели, для следующих исследуемых концентраций нужно забирать четыре образца/экспозицию. Образцы концентрации для каждой камеры не должны отклоняться от средней концентрации более чем на для газов и паров или для жидких и твердых аэрозолей. Время для достижения равновесного состояния и перехода к распаду нужно измерить и зафиксировать. Период воздействия охватывает время генерации исследуемого вещества. При этом учитывается время, необходимое для достижения равновесного состояния в камере и перехода к распаду.

3.5.5. Сложные смеси из газов/паров и аэрозолей (атмосфера горения и тестируемый препарат, выталкиваемые из программного изделия/прибора конечного пользователя) на каждом этапе могут демонстрировать разное поведение в ингаляционной камере, поэтому по меньшей мере одна индикаторная субстанция (аналит), как правило, основная активная в исследуемом препарате, должна быть выбрана на всех этапах (газ/пар или аэрозоль). Когда тестируемый препарат является смесью (по составу), аналитическая концентрация должна быть описана для общего состава, а не только для активного ингредиента или компонента (вещества, определяемого при анализе).

3.5.6. Гранулометрической состав аэрозолей должен определяться не менее двух раз за 4 часа выдержки при помощи каскадного импактора (пробоотборник частиц) или альтернативным инструментом (например, аэродинамическим спектрометром /APS/). Гравиметрический фильтр или импинджер (прибор для измерения запыленности и загазованности) нужно использовать для подтверждения эффективности работы основного прибора, используемого для определения гранулометрического состава исследуемого вещества. Массовая концентрация, полученная ситовым анализом, должна находиться в разумных пределах массовой концентрации, полученной в результате анализа работы фильтров. Если удастся показать равнозначность результатов, полученных каскадным импактором и альтернативным инструментом, то допускается использование альтернативного инструмента в исследовании. Размеры частиц должны быть определены для паров, если есть вероятность, что их конденсация приведет к образованию аэрозоля, или если в парах обнаружены частицы с потенциалом смешанных фаз.

4. Процедура исследования

4.1. Основное исследование

4.1.1. На каждом этапе используются по три животных каждого пола или шесть животных наиболее чувствительного пола. Уровень начальной дозы, соответствующий одному из четырех определенных значений, должен с максимальной вероятностью вызывать проявления токсичности у некоторых из подвергающихся воздействию животных. Схемы испытания для газов и паров, приведенные в приложениях 2-4, описывают процедуру испытания с граничными значениями для категорий согласно CUC для паров (определенных как категории 1-4) газов (100, 500, 2500, 20 000 частей на миллион) (прилож. 6.1.5.1), паров (0,5, 2, 10, 20 mg/L/4 h) (прилож. 6.1.5.2), а также пылей и туманов (0,05, 0,5, 1, 5 мг/л/4 ч) (прилож. 6.1.5.3). К категории 5 относятся концентрации выше соответствующего предела. Для каждой начальной концентрации применима соответствующая схема испытания. В зависимости от количества умерших либо подвергшихся эвтаназии животных испытание проводится в указанном на схеме стрелками порядке, вплоть до возможности категоризации.

4.1.2. В основной части исследования, как правило, используются 5 мужских и 5 женских особей (или 5 особей чувствительного пола, если таковой известен) на каждый уровень концентрации, как минимум, при трех уровнях концентрации. Следует использовать уровни концентрации, достаточные для проведения надежного статистического анализа. Временные интервалы между введениями различным группам определяются, исходя из времени наступления, продолжительности и интенсивности проявлений токсичности. Введение следующего уровня концентрации должно производиться только при достаточной уверенности в том, что животные предыдущей подопытной группы остались в живых. Таким образом, руководитель исследования получает возможность скорректировать целевую концентрацию для следующей подопытной группы. В случае ингаляционных исследований это не всегда может быть целесообразным в связи с зависимостью проведения испытания от сложных технологий, поэтому решение о введении животным следующего уровня концентрации должно основываться на предыдущем опыте и научном суждении. Испытание смесей следует проводить в соответствии с [5].

4.2. Исследование на предельное содержание

4.2.1. Испытание на предельное содержание проводится, если обнаруживается или ожидается, что испытуемое вещество является практически нетоксичным, т.е. демонстрирующим токсическое действие только при уровне концентрации, превышающем нормативный предел. Информация о токсичности испытуемого вещества может быть получена исходя из данных об аналогичных испытуемых составах, смесях или продуктах с учетом характера и процентного содержания токсикологически значимых компонентов. При недостатке или отсутствии информации о токсичности испытуемого вещества или при подозрении на токсичность должно проводиться основное испытание.

4.2.2. При использовании обычной процедуры по три животных каждого пола или шесть животных наиболее чувствительного пола подвергаются воздействию концентраций, равных 20 000 частей на миллион для газов, 20 мг/л для паров и 5 мг/л для пылей/туманов соответственно (если достижимо), что является испытанием на предельное содержание в рамках данного Руководства. При исследовании аэрозолей основной задачей является достижение респирабельного размера частиц (MMAD 1-4 мкм). Это возможно для большинства веществ в концентрации 2 мг/л. Исследование аэрозолей в концентрациях более 2 мг/л должно предприниматься только при респирабельном размере частиц [5]. Согласно системе GHS испытание концентраций, превышающих предельные, не рекомендуется из соображений благополучия животных. Предельная концентрация должна превышаться только при наличии веских оснований, таких как прямое отношение к защите здоровья человека, с обязательным указанием данных оснований в протоколе исследования. При использовании потенциально взрывоопасных испытуемых веществ следует предотвратить возможность создания благоприятных условий для взрыва. Для предотвращения использования чрезмерного количества животных перед проведением испытания на предельное содержание следует провести пробный запуск для проверки создания в камере условий, необходимых для проведения испытания на предельное содержание.

4.3. Наблюдения

4.3.1. Во время экспозиции животные систематически должны подвергаться клиническому осмотру. После экспозиции клинические наблюдения необходимо проводить не менее 2 раз и чаще в день экспозиции при наличии реакции у животных на воздействие, и в последующие 14 дней не реже одного раза в день. Продолжительность периода наблюдения не фиксирована, но определяется природой и временем появления клинических признаков, а также периодом восстановления. Важность представляет время появления и исчезновения признаков интоксикации, особенно если в появлении признаков интоксикации наблюдается тенденция к запаздыванию. Все наблюдения систематически фиксируются для каждого животного индивидуально. Помимо случаев, когда существуют веские причины поступать иначе, животные в состоянии агонии, а также испытывающие сильную боль и/или устойчивые признаки сильного поражения, должны быть умерщвлены гуманным способом без промедления. Принципы и критерии по определению гуманной конечной точки должны быть учтены. Время умерщвления животного по гуманным соображениям или время, когда оно было найдено мертвым, нужно зафиксировать максимально точно.

4.3.2. При наблюдении за животными в клетке должны фиксировать изменения в коже и шерсти, глазах и слизистых, а также в респираторной, кровеносной, вегетативной и центральной нервной системах, в соматомоторной активности и поведении. По возможности нужно отмечать различие между локальными и системными эффектами. Внимание должно фокусироваться на явлениях тремора, конвульсий, слюноотделения, диареи, летаргии, сна и комы. Измерение ректальной температуры позволит удостовериться в рефлекторном брадипноэ или гипо/гипертермии, связанной с лечением или обездвиженностью.

Масса тела

4.3.3. Индивидуальную массу тела каждого животного следует зафиксировать один раз во время акклиматизационного периода, в день экспозиции перед экспозицией (день 0), в 1-й, 3-й и 7-й дни и затем еженедельно, а также в день гибели или умерщвления, если они наступают после 1 дня. Масса тела является важным индикатором интоксикации, поэтому необходимо внимательно наблюдать животных, которые непрерывно теряют >20% по сравнению с показателями на начало исследования. Выжившие животные должны быть взвешены и умерщвлены гуманным способом по истечении постэкспозиционного периода.

Патология

4.3.4. Все подопытные животные, включая тех, кто погиб во время исследования или был удален из него по гуманным соображениям, должны быть подвергнуты общему вскрытию. Если вскрытие нельзя осуществить сразу после обнаружения мертвого животного, его следует охладить (не заморозить) при температуре достаточно низкой, чтобы не допустить аутолиза. Вскрытие следует осуществлять как можно скорее, как правило, в течение одного-двух дней. Все большие патологические изменения следует зафиксировать для каждого животного, обращая особое внимание на любые изменения в респираторном тракте.

4.3.5. Дополнительные осмотры могут повысить значимость полученных в ходе исследования результатов, например, измерение массы легкого у выжившей крысы и/или обнаружение раздражения в дыхательных путях вследствие микроскопического анализа. Среди осмотренных органов могут быть органы с симптомами выраженных патологических изменений у животных, выживших в течение 24 или более часов, или органы, которые очевидно или предположительно поражены. Микроскопическое исследование всего респираторного тракта позволит получить полезную информацию об исследуемых препаратах, реагирующих с водой, таких как кислоты и гигроскопические исследуемые препараты.

5. Данные и отчеты

5.1. Данные об исследовании

5.1.1. Необходимо предоставить данные о массе тела и результаты вскрытия по каждому животному индивидуально. Данные клинического осмотра должны быть сведены в таблицу, отражающую количество животных в каждой подопытной группе, количество животных со специфическими признаками интоксикации, количество животных, найденных мертвыми или умерщвленных по гуманным причинам, время смерти каждого животного, описание и динамику появления признаков токсичности и их обратимость, а также данные вскрытия.

5.2. Отчет

Отчет об исследовании должен включать следующие данные.

Подопытные животные и их содержание:

- описание условий содержания в клетке, включая: количество (или изменения в количестве) животных в клетке, материал подстилки, температура окружающей среды и относительная влажность, световой период и обозначение диеты;

- используемые виды/линии и обоснование для использования других видов, кроме крыс;

- количество, возраст и пол животных;

- метод рандомизации;

- подробности о качестве пищи и воды (включая тип/источник диеты, источник воды);

- описание условий содержания перед началом испытания, включая диету, карантин и лечение от болезни.

Исследуемый препарат:

- физическая природа, наличие примесей и, если значимо, физико-химические свойства (включая изомеризацию);

- идентификационные данные и регистрационный номер в Реферативной службе по химии (CAS), если таковой имеется.

Растворитель:

- обоснования для использования растворителя и обоснование для выбора растворителя (если это иное, чем вода);

- справочные или совпадающие данные, подтверждающие, что растворитель не влияет на результаты исследования.

Ингаляционная камера:

- описание ингаляционной камеры, включая размеры и объем;

- описание и поставщик оборудования, используемого для экспозиции животных, а также генерация воздуха;

- оборудование для измерения температуры, относительной влажности, размера частиц и фактической концентрации;

- источник поступления воздуха, обработка поступившего/извлеченного воздуха и система кондиционирования;

- методы, используемые для поверки оборудования с целью обеспечения гомогенности в тестируемом воздухе;

- перепады давления (положительные или отрицательные);

- отверстия для экспозиции в камере (только через нос); размещение животных в системе (воздействие через все тело);

- временная гомогенность/стабильность тестируемого воздуха;

- место размещения датчиков, определяющих температуру и относительную влажность, отбор образцов тестируемого воздуха в клетке;

- скорость потоков воздуха, скорость потока воздуха/отверстия для экспозиции (только через нос) или нагрузка животных/клетку (для воздействия через все тело);

- время, рекомендуемое для достижения равновесия в ингаляционной камере ;

- количество изменений объема в час;

- приборы, снимающие показания (если применены).

Данные экспозиции:

- обоснование для выбора целевой концентрации в основном исследовании;

- номинальные концентрации (общая масса исследуемого препарата, сгенерированного в ингаляционной камере, разделенная на объем воздуха, проходящего через камеру);

- фактическая концентрация тестируемого препарата, собранная из зоны дыхания животных; для исследуемых смесей, которые продуцируют гетерогенные физические формы (газы, пары, аэрозоли), каждая форма может быть проанализирована отдельно;

- все воздушные концентрации должны быть указаны в отчете в единицах массы (например, мг/л, и т.д.); в скобках допускается указание их в единицах объема (например, промилле, часть на млрд и т.д.);

- гранулометрический состав, средний аэродинамический диаметр (MMAD) и геометрическое стандартное отклонение , включая методы из вычисления. Индивидуальный гранулометрический анализ должен быть изложен в отчете.

Условия проведения испытания:

- подробные сведения о приготовлении тестируемого препарата, включая данные о мероприятиях по уменьшению размера частиц для твердых материалов или по приготовлению растворов исследуемого препарата. В случае, когда есть вероятность, что механические процессы изменят состав исследуемого вещества, необходимо включить результаты анализов для подтверждения состава тестируемого вещества;

- описание оборудования (предпочтительно с диаграммой), используемого для генерации исследуемого воздуха и для экспозиции им животных;

- подробные сведения об оборудовании, используемом для наблюдения за температурой в камере, относительной влажностью, воздушными потоками;

- подробные сведения об оборудовании, используемом для забора образцов для вычисления концентрации в камере и гранулометрического состава;

- подробные сведения об используемом химико-аналитическом методе и проверке достоверности метода (включая эффективность восстановления тестируемого препарата из питательной среды, в которую были помещены образцы;

- метод случайной выборки животных для включения в испытательную и контрольную группы;

- обоснование для выбора исследуемой концентрации.

Результаты:

- сведение в таблицу данных о температуре в камере, уровне влажности и воздушном потоке;

- сведение в таблицу данных о номинальной и фактической концентрации;

- сведение в таблицу данных о размере частиц, включая собранные сведения об аналитических образцах, распределение размеров частиц, подсчеты ММАД и ;

- сведение в таблицу данных о реакции и уровне концентрации для каждого животного (т.е. признаки токсического отравления у животного, включая агонию, характер, тяжесть, время появления и продолжительность эффектов);

- индивидуальная масса тела животных, полученная в дни проведения эксперимента; дата и время смерти, если предшествовали умерщвлению, динамика появления признаков токсичности и были ли они обратимы для каждого животного;

- данные вскрытия и гистопатологические данные для каждого животного, если имеются;

- классификация категории согласно GHS и граничное значение .

Обсуждение и интерпретация результатов:

- особое внимание необходимо уделить описанию методов, используемых в целях удовлетворения требованиям Руководства по проведению испытаний, например, таким как к предельно допустимой концентрации или размерам частиц;

- пригодность частиц для вдыхания, принимая во внимание общие данные, должна быть адресной, особенно если требования к размерам частиц не соблюдены;

- если на основании критериев по определению гуманной конечной точки была необходимость в гуманном умерщвлении животного, испытывающего боль или проявляющего признаки страдания, нужно привести объяснения;

- последовательность методов, используемых для определения номинальной и фактической концентрации, а также зависимость фактической концентрации от номинальной должна быть включена в общую оценку исследования;

- вероятная причина смерти и доминирующий образ действий (оказывающий общее или локальное влияние на организм) должны быть адресными.