Приложение 6.8.12. Метод оценки хромосомных аберраций в сперматогониях млекопитающих

Приложение 6.8.12

Метод оценки хромосомных аберраций в сперматогониях млекопитающих

Идентичен международному документу OECD TG N 483 "Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Test" (ОЭСР Руководство N 483 "Метод оценки хромосомных аберраций в сперматогониях млекопитающих"). Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Метод по оценке хромосомных аберраций в сперматогониях млекопитающих описывает методику для выявления веществ, которые индуцируют структурные аберрации хромосом в сперматогониях млекопитающих. Имеется два типа аберраций хромосом: хроматидные и хромосомные. Подавляющее большинство химических мутагенов индуцирует аберрации хроматидного типа. В то же время возможно появление аберраций хромосомного типа. Хромосомные мутации и связанные с ними события являются причиной многих генетических болезней человека. Данный документ не рассматривает учет численных нарушений хромосом, а данный метод обычно не используется для этой цели.

1.2. Этот тест оценивает хромосомные нарушения в сперматогониях и относится к тестам, которые выявляют наследуемые мутации в половых клетках.

2. Общие положения

2.1. Опыты обычно проводят на грызунах. В цитогенетическом тесте in vivo выявляют хромосомные аберрации в сперматогониях на стадии митоза. Другие типы клеток не являются предметом рассмотрения в данном документе.

2.2. Для выявления аберраций хроматидного типа в сперматогониях необходимо исследовать клетки, находящиеся в первом митозе после воздействия веществом, т.к. эти аберрации могут элиминироваться при последующих делениях. Дополнительную информацию по эффектам в сперматогониях можно получить при проведении анализа аберраций хромосомного типа в мейотических хромосомах на стадии диакинез-метафаза I, когда клетки становятся сперматоцитами.

2.3. Данный тест in vivo направлен на получение информации об активности мутагенов, выявленных в исследованиях на соматических клетках, для половых клеток. Данный метод особенно подходит при оценке опасности мутагенов, т.к. опыт in vivo позволяет учесть такие факторы, как метаболизм, фармакокинетика и процессы репарации ДНК.

2.4. В тестикулах имеется ряд генераций сперматогоний с разной чувствительностью к действию химического вещества. Таким образом, уровень аберраций представляется совокупным ответом всех подвергнутых воздействию популяций сперматогониальных клеток, среди которых преобладают более многочисленные дифференцированные сперматогониальные клетки. В зависимости от расположения в тестикулах различные популяции сперматогоний могут или не могут быть экспонированы веществом из общей циркуляции вещества в связи с наличием физиологического барьера клеток Сертоли и гематотестикулярного барьера.

2.5. Если известно, что вещество или активный метаболит не достигают ткани мишени, этот тест не подходит для оценки мутагенности.

3. Принцип метода

3.1. Животных подвергают воздействию исследуемого соединения при соответствующем пути введения и забивают через определенное время после введения. Перед забоем животным вводят вещество, блокирующее митоз на стадии метафазы (т.е. колхицин или колцемид). Затем готовят препараты половых клеток, окрашивают и анализируют хромосомные аберрации в метафазах.

4. Описание метода

4.1. Материалы

Выбор животных

4.1.1. Обычно опыты проводят на китайских хомячках и мышах, хотя возможно использование самцов других видов млекопитающих. Наиболее часто опыты проводят на молодых, здоровых взрослых животных лабораторных линий. В начале эксперимента колебания массы животных должны быть минимальны, не превышая средней массы животных каждого пола.

Условия содержания и кормления

4.1.2. Температура в экспериментальных комнатах вивария должна быть . Относительная влажность должна быть не ниже 30% и не превышать 70% во время уборки, оптимально 50-60%. Освещение искусственное. Световой режим: 12 часов освещение, 12 часов темнота. Может быть использована стандартная лабораторная диета без ограничения питьевой воды. На выбор диеты может влиять необходимость приготовления особой смеси корма при введении вещества с кормом. Животных содержат в клетках индивидуально или небольшими группами.

Подготовка животных

4.1.3. Методом случайного отбора формируют контрольные и экспериментальные группы молодых взрослых самцов. Клетки располагают таким образом, чтобы минимизировать возможные эффекты вследствие перемещения клеток. Каждое животное идентифицируют. Животных акклиматизируют к лабораторным условиям, по крайней мере, в течение 5 дней.

Приготовление исследуемых соединений

4.1.4. Твердые соединения растворяют или суспендируют в соответствующем растворителе и разводят, если необходимо, перед введением животным. Жидкие вещества можно вводить прямо или разводить перед введением. Пока стабильность растворов исследуемого вещества при соответствующем хранении не будет показана, следует использовать свежие растворы.

4.2. Условия испытания

Растворитель/разбавитель

4.2.1. Растворитель/разбавитель не должен вызывать токсические эффекты при использованных уровнях доз и не должен вступать в реакцию с исследуемым веществом. Если используется малоизвестный растворитель, его включение должно быть обосновано данными, указывающими на совместимость с исследуемым веществом. По возможности рекомендуется использовать водные растворы.

Контроли

4.2.2. Соответствующие положительные и отрицательные (растворитель/разбавитель) контроли должны быть в каждом опыте. Исключая обработку животных исследуемым веществом, животные контрольных групп должны находиться в тех же условиях, что и животные экспериментальных групп.

4.2.3. Соединения положительного контроля при выбранных уровнях экспозиции должны индуцировать значимое повышение уровня хромосомных аберраций в сперматогониях in vivo над контролем. Дозы положительного контроля следует подбирать так, чтобы был четкий эффект, но в то же время его уровень не позволял исследователю определить зашифрованный препарат группы положительного контроля. Допускается введение положительного контроля путем, отличающимся от введения исследуемого вещества, и использование одного времени введения. Дополнительно, когда необходимо, в качестве положительного контроля можно использовать вещество, по химическому классу сходное с веществом положительного контроля. Примеры веществ положительного контроля приведены ниже.

Вещество и номер CAS

Циклофосфамид (моногидрат) [номер CAS 50-18-0 (номер CAS 6055-19-2)]

Циклогексиламин [номер CAS 108-91-8]

Митомицин С [номер CAS 50-07-7]

Мономер акриламида [номер CAS 79-06-1]

Триэтиленмеламин [номер CAS 51-18-3]

4.2.4. Пока приемлемая вариабельность между животными частоты клеток с аберрациями хромосом не будет показана по данным исторического контроля, в группе отрицательного контроля (контроль с растворителем/разбавителем) обработка животных проводится тем же путем и в том же режиме, что и обработка экспериментальных групп животных. Дополнительно следует также формировать контрольную группу без обработки, пока исторические или опубликованные данные не покажут, что выбранный растворитель не индуцирует вредного или мутагенного эффектов.

4.3. Проведение эксперимента

Число и пол животных

4.3.1. В каждой экспериментальной и контрольной группе должно быть как минимум 5 самцов, пригодных для анализа.

Схема введения

4.3.2. Применяется преимущественно однократная или двукратная схема введения вещества. Исследуемое вещество может быть введено в дробных дозах, т.е. 2 введения в тот же день, разделенные не больше, чем несколько часов, чтобы ввести большой объем материала. Другие дозовые режимы должны быть научно обоснованы.

4.3.3. В группе животных с максимальной дозой вещества проводят забой в 2 срока после введения. Поскольку исследуемое вещество может менять кинетику клеточного цикла, то используют раннее и позднее время забоя после введения вещества, приблизительно через 24 и 48 часов соответственно. Для других доз рекомендуется время забоя после введения вещества 24 часа или 1,5 продолжительности клеточного цикла, если нет данных для использования другого, более оптимального времени забоя [6].

4.3.4. Дополнительно может быть использовано другое время забоя животных. Например, в случае соединения, которое может индуцировать отставание хромосом, или может давать S-независимый эффект, более подходит раннее время забоя.

4.3.5. Необходимость использования режима повторных введений должна определяться в каждом конкретном случае. При таком режиме введения вещества животных следует забивать через 24 часа (1,5 продолжительности клеточного цикла) после последнего введения. При необходимости возможно использовать дополнительное время забоя животных.

4.3.6. Перед забоем животным вводят внутрибрюшинно соответствующую дозу вещества, блокирующую митоз на стадии метафазы (т.е. колцемид или колхицин). Через определенный интервал времени животных забивают. Для мышей этот интервал составляет 3-5 часов, для китайских хомячков - 4-5 часов.

Уровни доз

4.3.7. Если проводят ряд исследований и отсутствуют подходящие данные, то эксперимент должен быть проведен в той же лаборатории, используя те же виды, линии, пол, режим обработки, которые были в основном исследовании. Если выявлена токсичность, то при первом сроке забоя исследуют 3 дозы. Диапазон доз должен быть в пределах от максимальной до минимальной токсичности или отсутствия токсичности. При более поздних сроках забоя необходимо использовать лишь максимальную дозу. Наибольшая доза определяется как доза, вызывающая такие признаки токсичности, которые при повышении уровня доз при том же режиме затравки могут вызвать летальный эффект. Вещества со специфической биологической активностью при низких нетоксических дозах (такие, как гормоны и митогены) могут быть исключением для критериев установления дозы и дозы следует устанавливать для каждого конкретного случая. Наибольшая доза может также быть определена как доза, вызывающая ряд признаков токсичности в сперматогониях (т.е. снижение величины отношения митозов в популяции сперматогоний к количеству мейотических метафаз I и II; это снижение не должно превышать 50%).

Ограничения теста

4.3.8. Если опыт с дозой около 2 000 мг/кг массы тела, используя однократный режим воздействия или 2 введения в один день, не вызывает токсического эффекта, и если генотоксичность не предполагается по результатам исследований со структурно связанными соединениями, тогда полная схема исследований с использованием 3 уровней доз может не проводиться. Ожидаемая экспозиция для человека может указывать на необходимость использования более высоких доз в опытах установления лимитов.

Введение вещества

4.3.9. Исследуемое вещество обычно вводят внутрижелудочно, используя желудочный зонд или подходящую интубационную канюлю, или внутрибрюшинно. Возможно применение других способов введения при их обосновании. Максимальный объем жидкости, который вводят внутрижелудочно или путем инъекции, зависит от размеров экспериментальных животных. Объем не должен превышать 2 мл на 100 г массы тела. Использование больших объемов должно быть обосновано. Исключение составляют раздражающие и разъедающие вещества, которые вызывают раздражающий эффект в высоких концентрациях. Вариации вводимых объемов должны быть минимизированы путем приготовления концентраций растворов, позволяющих вводить постоянный объем для всех 3 уровней доз.

Приготовление препаратов метафазных хромосом

4.3.10. Сразу после забоя готовят клеточную суспензию из обоих тестикул, проводят гипотоническую обработку клеток и фиксацию. Затем клетки раскапывают на стекла и окрашивают.

Анализ

4.3.11. На каждое животное анализируют по крайней мере 100 хорошо разбросанных метафаз (т. е. минимум 500 метафаз на группу). Число клеток может быть уменьшено, если наблюдается высокое число аберраций. Все стекла, включая положительный и отрицательный контроль, перед микроскопическим анализом должны быть зашифрованы. При приготовлении препаратов часто возможна потеря хромосом. Поэтому анализируемые метафазы должны содержать число центромер в пределах .

5. Результаты и отчет

5.1. Обработка результатов

5.1.1. Данные по каждому животному следует представлять в табличной форме. Экспериментальной единицей является животное. По каждому животному приводится число клеток со структурными хромосомными аберрациями и число аберраций на клетку. Должны быть указаны число и частоты разных типов структурных аберраций хромосом для опытных и контрольных групп. Пробелы регистрируют отдельно и их не включают в общую частоту аберраций.

5.1.2. Если анализируют как митозы, так и мейоз, то, как мера цитотоксичности, оценивают отношение митозов в популяции сперматогоний к количеству мейотических метафаз I и II у всех животных опытных и контрольных групп при анализе 100 делящихся клеток на животное.

Оценка и интерпретация результатов

5.1.3. Имеется несколько критериев определения положительного результата: зависимое от дозы повышение числа клеток с аберрациями хромосом или четкое повышение числа клеток с аберрациями хромосом в одной дозовой группе при одном временном варианте эксперимента. Биологическая обоснованность результата должна приниматься во внимание в первую очередь. Для оценки результатов следует использовать статистические методы. Статистическая значимость не является единственным критерием для доказательства положительного ответа. Сомнительные (противоречивые) результаты должны проверяться при дальнейшем тестировании, используя преимущественно модификацию экспериментальных условий.

5.1.4. Вещество, результаты исследования которого не соответствуют приведенным выше критериям, считают не мутагеном в данном тесте.

5.1.5. Хотя в большинстве экспериментов получают четко положительные или отрицательные результаты, в редких случаях полученные данные не позволяют сделать однозначное заключение об активности исследуемого вещества. Результаты могут оставаться противоречивыми или сомнительными независимо от числа проведенных повторов.

5.1.6. Положительные результаты в тесте на хромосомные аберрации в сперматогониях in vivo показывают, что вещество индуцирует аберрации хромосом в половых клетках исследуемого вида животных. Отрицательные результаты указывают, что при данных условиях эксперимента вещество не индуцирует хромосомные аберрации в половых клетках исследованного вида животных.

5.1.7. Должна быть обсуждена вероятность, что исследуемое вещество или его метаболиты попадают в организм или в ткани мишени.

5.2. Отчет

Отчет должен включать следующую информацию.

Исследуемое соединение:

- идентификационные данные и номер CAS, если известен;

- физическая природа и чистота;

- физико-химические параметры, имеющие значение для данного исследования;

- стабильность веществ.

Растворитель/разбавитель:

- обоснование выбора растворителя;

- растворимость и стабильность исследуемого вещества в растворителе/разбавителе, если известны.

Животные:

- вид и линии животных;

- число животных, возраст и пол;

- откуда получены животные, условия содержания и кормления и т.д.;

- масса каждого животного на начало опыта, включая для каждой группы колебания массы тела, среднее и стандартное отклонение.

Условия эксперимента:

- данные эксперимента по выбору доз, если проводили;

- обоснование выбора доз;

- обоснование пути введения вещества;

- детальное описание приготовления вещества;

- детальное описание введения вещества;

- обоснование времени забоя животных;

- пересчет концентрации исследуемого вещества в питьевой воде или пище в дозу вещества (мг/кг массы тела в день) (если это проводили);

- детальное описание качества пищи или воды;

- детальное описание схемы обработки и забора материала;

- методы оценки токсичности;

- вещество, используемое для блокады метафаз, его концентрация и длительность экспозиции;

- метод приготовления препаратов метафазных хромосом;

- критерии анализа аберраций хромосом;

- число анализируемых клеток на животное;

- критерии учета вещества как позитивное, негативное или сомнительное.

Результаты:

- признаки токсичности;

- митотический индекс;

- отношения митозов в популяции сперматогоний к количеству мейотических метафаз I и II;

- типы и число аберраций, отдельно по каждому животному;

- общее число аберраций хромосом на группу;

- число клеток с аберрациями хромосом на группу;

- оценка зависимости эффекта от дозы, где это возможно;

- статистический анализ, если проводили;

- данные по отрицательному контролю;

- исторические данные по отрицательному контролю с колебаниями показателя среднего значения и стандартному отклонению;

- данные по положительному контролю;

- изменения плоидности, если учитывали.

Обсуждение результатов.

Заключение.