Приложение 6.8.14. Генетическая токсикология: Метод оценки наследуемых транслокаций у мышей

Приложение 6.8.14

Генетическая токсикология: Метод оценки наследуемых транслокаций у мышей

Идентичен международному документу OECD TG N 485 "Genetic Toxicology: Mouse Heritable Translocation Assay" (ОЭСР Руководство N 485 "Генетическая токсикология: Метод оценки наследуемых транслокаций у мышей"). Принят 23 октября 1986 года. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает порядок проведения испытания химических веществ методом оценки наследуемых транслокаций у мышей. Транслокационный тест на мышах выявляет структурные и численные нарушения хромосом в половых клетках, которые проявляются в потомстве 1 поколения.

2. Общие положения

2.1. По изучаемому соединению представляют следующие данные:

- твердое, жидкое, пары или газообразное вещество;

- химическая идентификация вещества;

- чистота (примеси) вещества;

- растворимость;

- температура плавления/кипения вещества;

- рН (где необходимо);

- давление паров (если имеются данные).

3. Принцип метода

3.1. В данном тесте определяют типы хромосомных нарушений - реципрокные транслокации и, если включено потомство самок, - потерю Х-хромосомы. У носителей транслокаций и самок ХО выявляется снижение фертильности, что используется для отбора потомков для проведения цитогенетического анализа. Транслокации выявляют цитогенетически в мейотических клетках на стадии диакинез-метафаза I или у самцов , или у самцов потомства самок . Самок ХО определяют цитогенетически по наличию 39 хромосом в клетках костного мозга в митозе.

4. Описание метода

4.1. Материалы

Тестируемое вещество

4.1.1. Если возможно, исследуемое вещество растворяют или суспендируют в изотоническом солевом растворе. Вещество, не растворимое в воде, растворяют или суспендируют в соответствующем растворителе. Используемый растворитель не должен взаимодействовать с исследуемым веществом или вызывать токсические эффекты.

Экспериментальные животные

4.1.2. Эксперименты проводят на мышах, так как они более удобны в отношении легкости скрещивания и цитологической верификации. Не требуется специфической линии мышей. Однако средняя величина помета у линии должна быть больше 8 и быть относительно стабильной. Используются половозрелые животные.

Количество животных

4.1.3. Необходимое количество животных зависит от спонтанного уровня транслокаций и минимального уровня индуцируемого эффекта, требуемого для доказательства позитивного результата. Требуется большое количество животных, порядка 500 самцов на дозу.

4.2. Условия испытания

Контроли

4.2.1. Должны быть адекватные данные как в контроле опыта, так и в историческом контроле. Если в ряде экспериментов, выполненных в данной лаборатории, получены приемлемые результаты позитивного контроля, их можно использовать в опыте вместо проведения соответствующего позитивного контроля.

Уровни доз

4.2.2. Тестируется одна доза. Обычно это максимальная доза, вызывающая минимальный токсический эффект, не связанный с нарушением репродуктивного поведения и выживаемости. Для установления зависимости доза-эффект необходимы две дополнительные более низкие дозы. Для нетоксичных соединений максимальная доза должна быть до 5 мг/кг при однократном введении или до 2 мг/кг при дозовом режиме с повторными введениями. Если введение этих доз практически невозможно, вводится максимально достижимая доза.

Путь введения

4.2.3. Обычно используют внутрижелудочное или внутрибрюшинное введение. Могут быть использованы другие пути введения. Максимально адекватным для оценки риска является путь введения, соответствующий экспозиции человека.

4.3. Проведение эксперимента

Воздействие и скрещивание

4.3.1. Приемлемы два протокола экспозиции. Наиболее часто используют однократное введение исследуемого вещества. Также может быть использован протокол с введением вещества 7 дней в неделю в течение 35 дней. Число скрещиваний после воздействия определяется протоколом экспозиции и должно быть таковым, чтобы все стадии половых клеток были протестированы. Сразу после родов следует запротоколировать дату, размер помета и пол потомства. Все самцы помета должны быть отсажены, а все самки помета отбрасываются, если они не включены в эксперимент.

Оценка гетерозиготности по транслокации

4.3.2. Возможно использование 2 методов.

- Исследование фертильности потомства и последующая верификация на возможное носительство транслокации цитогенетическим методом.

- Цитогенетический анализ всех самцов потомства без первичного отбора по фертильности.

А. Анализ фертильности

4.3.3. Снижение фертильности самцов можно установить либо по анализу величины помета и/или по исследованию матки самок, с которыми спаривают изучаемых самцов.

4.3.4. Критерии определения нормальной или сниженной фертильности должны быть установлены для используемой линии мышей.

Определение размера помета

4.3.5. Каждого исследуемого самца подсаживают индивидуально к самкам либо из того же эксперимента, либо из той же колонии. Животных контролируют ежедневно, начиная с 18 дня после спаривания. Размер помета и пол потомства фиксируют при рождении и после помет отбрасывается. Если исследуют самок потомства , то потомство небольших пометов сохраняется для дальнейшего тестирования. Самки-носители транслокаций верифицируются при цитогенетическом анализе транслокаций у любого самца их потомства. ХО-самки выявляются при изменении соотношения полов в их потомстве от 1:1 к 1:2 (самцы:самки). В последующей процедуре нормальные животные исключаются из дальнейшего исследования, если величина помета достигает или превышает установленную нормальную величину. В других случаях анализируют второй и третий помет. Если животные не могут быть классифицированы как нормальные после учета до трех пометов, то далее анализируют либо живых и мертвых эмбрионов в матках скрещиваемых самок, либо проводят цитогенетический анализ.

Анализ живых и мертвых эмбрионов в матке

4.3.6. Снижение размера помета у носителей транслокации - следствие гибели эмбрионов. Таким образом, высокое количество мертвых эмбрионов указывает на присутствие транслокаций у животного. Каждого исследуемого самца скрещивают с 2-3 самками. Зачатие устанавливают, проверяя ежедневно утром наличие вагинальной пробки. Самок умерщвляют на 14-16 день беременности и в матке подсчитывают число живых и мертвых эмбрионов.

Б. Цитогенетический анализ

4.3.7. Препараты готовят с использованием суховоздушной методики. Носителей транслокаций идентифицируют по присутствию мультивалентных фигур в первичных сперматоцитах на стадии диакинез-метафаза I. Для отнесения исследуемого животного к носителям транслокаций необходимо выявление, по крайней мере, 2 клеток с мультивалентными ассоциациями.

4.3.8. Если не предусмотрен этап скрещивания, всех самцов исследуют цитогенетически. У каждого самца под микроскопом анализируют не менее 25 клеток на стадии диакинезметафаза I. Дополнительно у самцов с небольшими яичками и мейотическими нарушениями или у самок с подозрением на ХО проводят исследование метафаз сперматогоний или клеток костного мозга. Наличие необычных длинных и/или коротких хромосом в каждой из 10 клеток указывает на транслокацию, ответственную за стерильность самцов (c/t тип). Некоторые транслокации Х-аутосома, которые могут вызывать стерильность самцов, могут быть выявлены только при дифференциальной окраске митотических хромосом. Наличие 39 хромосом во всех 10 метафазах указывает на кариотип ХО у самок.

5. Результаты и отчет

5.1. Обработка результатов

5.1.1. Данные представляют в виде таблиц.

5.1.2. Для каждого периода скрещивания регистрируют средний размер помета, соотношение полов при рождении и время прекращения грудного кормления.

5.1.3. При оценке фертильности животных указывают средний размер помета всех нормальных скрещиваний и индивидуальный размер помета носителей транслокаций. При анализе матки регистрируют среднее число живых и мертвых эмбрионов при нормальных скрещиваниях и число живых и мертвых эмбрионов в каждом скрещивании носителей транслокаций.

5.1.4. При проведении цитогенетического анализа сперматоцитов на стадии диакинезметафаза I регистрируют число и тип мультивалентных фигур и общее число проанализированных клеток у каждого носителя транслокаций.

5.1.5. У стерильных животных учитывают общее число скрещиваний, длительность периода скрещиваний. Указывают вес тестикул и данные цитогенетического анализа.

5.1.6. У самок ХО регистрируют средний размер помета, соотношение полов у потомства, результаты цитогенетического анализа. По возможности носители транслокаций предварительно отбираются с использованием теста на фертильность. Таблица должна включать информацию о числе подтвержденных среди них гетерозигот по транслокации.

5.1.7. Данные обрабатываются соответствующими статистическими методами.

Оценка результатов

5.1.8. Существуют разные критерии определения позитивного результата. Один из них - статистически значимое повышение числа транслокаций, выявленное хотя бы в одной экспериментальной точке, над контролем. Другой критерий основан на выявлении статистически значимого повышения числа транслокаций с увеличением дозы вещества.

5.1.9. Вещество, не вызывающее ни статистически значимого повышения числа транслокаций на любой экспериментальной точке, ни статистически значимого возрастания числа транслокаций с увеличением дозы, считается не мутагеном в данной тест-системе.

5.2. Отчет

Отчет должен содержать следующую информацию:

- линия мышей, возраст животных, масса животных;

- количество животных каждого пола родительского поколения в экспериментальных и контрольных группах;

- соответствующий исторический контроль, если используется и/или если имеется;

- условия тестирования, детальное описание затравки, уровни доз, растворители;

- протокол скрещивания;

- количество и пол потомков на каждую самку, количество и пол потомков, выбранных для анализа транслокаций;

- время и критерии оценки транслокаций;

- количество и детальное описание носителей транслокаций, включая данные скрещиваний, если требуется; содержимое матки;

- методика цитогенетического анализа, детальное описание цитогенетических результатов, желательно с зарисовкой (или фотографией) фигур;

- данные статистической обработки;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.