Приложение 6.2.1. Изучение пероральной токсичности при повторном воздействии в 90-дневных опытах на грызунах

Приложение 6.2.1

Изучение пероральной токсичности при повторном воздействии в 90-дневных опытах на грызунах

Идентичен международному документу OECD TG N 408 "Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Rodents" (ОЭСР Руководство N 408 "Изучение пероральной токсичности при повторном воздействии в 90-дневных опытах на грызунах". Международный документ разработан Организацией Экономического Сотрудничества и Развития (ОЭСР/OECD) 21 сентября 1998 г. Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования по изучению пероральной токсичности при повторном воздействии в 90-дневных опытах на грызунах предназначен для получения информации о возможном вреде для здоровья при повторном пероральном введении химического вещества и продукции на его основе в течение длительного периода времени.

2. Общие положения

2.1. При изучении и оценке токсикологических характеристик химического вещества определение субхронической пероральной токсичности с использованием повторного введения может выполняться после того, как получена первичная информация о токсичности в условиях острого опыта и 28-дневного опыта с изучением токсичности при повторном введении вещества. 90-дневное исследование дает информацию о возможном вреде для здоровья, связанном с повторным воздействием вещества в течение продолжительного периода времени, включая период после прекращения материнского вскармливания, рост и взросление. В этом исследовании можно получить информацию об основных токсических эффектах, выявить критические органы и способность вещества к аккумуляции. Могут быть также получены данные по оценке уровня, при котором не наблюдаются неблагоприятные эффекты вещества (NOAEL), который может использоваться при выборе доз для проведения хронических опытов и установления критериев безвредности воздействия вещества на человека.

2.2. Метод исследования особое внимание уделяет нейрологическим показателям и дает представление об иммунологических и репродуктивных эффектах. В нём также подчеркивается необходимость тщательных клинических наблюдений за состоянием животных для получения как можно большего объема информации. При 90-дневном изучении токсичности должна создаваться возможность для выявления способности химических веществ вызывать нейротоксический, иммунотоксический эффекты, а также воздействовать на репродуктивные органы, что может служить основанием для дальнейших углубленных исследований.

3. Описание метода

3.1. Принцип метода

Изучаемое вещество вводят ежедневно перорально в градуированных дозах нескольким группам экспериментальных животных в одном дозовом уровне на группу в течение 90 дней. В течение периода введения вещества тщательно наблюдают за животными для выявления признаков интоксикации. Погибших или умерщвленных во время эксперимента животных вскрывают, в конце эксперимента выживших животных также умерщвляют для вскрытия.

3.2. Животные

3.2.1. Выбор вида животных

Предпочтительный вид животных - крыса, но могут использоваться и другие виды грызунов, например, мыши. Должны использоваться молодые здоровые взрослые животные широко распространенных лабораторных линий. Самки должны быть нерожавшими и небеременными. Введение вещества должно начинаться как можно скорее после прекращения материнского вскармливания, и, в любом случае, до того, как животные достигнут 9-недельного возраста. В начале исследования вариации массы тела используемых животных должны быть минимальными и не превышать от средней массы особей каждого пола. Если исследование проводится как предварительное к длительному хроническому опыту, в обоих экспериментах должны использоваться животные одной и той же линии.

3.2.2. Содержание и кормление

Температура в экспериментальной комнате для животных должна быть 22°С . Относительная влажность воздуха должна быть не менее 30% и, желательно, не выше 70% (за исключением времени уборки помещения), оптимальный диапазон - 50-60%. Освещение должно быть искусственным с последовательным чередованием: 12 ч света и 12 ч темноты. Для кормления может использоваться обычная лабораторная диета с неограниченным потреблением питьевой воды. На выбор диеты может повлиять необходимость обеспечить хорошее смешивание изучаемого вещества, если оно вводится с кормом. Животные могут содержаться индивидуально или размещаться небольшими группами одного пола.

3.2.3. Подготовка животных

Должны использоваться здоровые животные, акклиматизированные к лабораторным условиям, по крайней мере в течение 5 дней, и ранее не подвергавшиеся экспериментальным процедурам. Животные должны быть охарактеризованы по виду, линии, полу, массе и/или возрасту. Животные произвольно распределяются в контрольную и экспериментальные группы. Клетки должны быть расставлены так, чтобы свести к минимуму возможные эффекты, связанные с размещением клеток. Каждое животное должно получить индивидуальный идентификационный номер.

3.3. Подготовка вводимых доз

3.3.1. Изучаемое вещество вводят желудочным зондом, через диету или с питьевой водой. Метод перорального введения зависит от целей исследования и физических/химических/токсико-кинетических свойств изучаемого вещества.

3.3.2. Если необходимо изучаемое вещество растворяют или суспензируют в подходящем растворителе. Предпочтительным в качестве растворителя является вода; следующим из рекомендуемых следует рассматривать использование водного раствора/суспензии, затем - использование раствора/эмульсии в масле (например, в кукурузном масле) и только потом - возможное растворение в других растворителях. Для растворителей, отличных от воды, должны быть известны токсикологические характеристики. Должна быть определена стабильность изучаемого вещества в условиях его введения животным.

3.4. Процедура испытания

3.4.1. Количество и пол животных

В каждой дозе должны быть использованы, по крайней мере, 20 животных (десять самцов и десять самок). Если планируется умерщвление животных в течение эксперимента, общее число животных должно быть увеличено на то их количество, которое предназначается к умерщвлению до завершения исследования. На основе имеющихся данных о веществе или его близком аналоге должна быть рассмотрена целесообразность включения дополнительной сателлитной группы из 10 животных (по пять каждого пола) в контрольную группу и группу, получающую максимальную дозу вещества, для наблюдения после прекращения воздействия вещества за обратимостью и устойчивостью токсических эффектов.

3.4.2. Дозировка

Должны использоваться, по крайней мере, три уровня доз и контроль, если только не проводится изучение вещества в сокращенном объеме. Уровни доз могут быть основаны на результатах экспериментов с повторным введением вещества или исследований по поиску диапазона доз. При этом должны приниматься во внимание любые известные токсикологические и токсикокинетические данные, имеющиеся для изучаемого вещества или родственных веществ. Если нет ограничений, обусловленных физико-химической природой или биологическими эффектами изучаемого вещества, наивысшая доза должна быть выбрана с учетом возможности вызвать токсическое действие, но не гибель или сильные страдания животных. Последовательность снижения дозовых уровней должна выбираться с перспективой обнаружения любых дозо-зависимых реакций и так, чтобы уровень, при котором не наблюдаются неблагоприятные эффекты вещества (NOAEL), соответствовал наименьшей из использованных доз. Двух- или четырехкратные интервалы обычно оптимальны для установления убывающих дозовых уровней, а добавление четвертой опытной группы животных часто предпочтительнее использования очень больших интервалов (например, более чем 6-10-кратных) между дозами.

3.4.3. Контрольная группа остается интактной или получает растворитель, если он используется для введения изучаемого вещества. За исключением воздействия изучаемым веществом, условия содержания контрольных и опытных животных должны быть идентичными. Если применяется растворитель, контрольная группа должна получать его в наибольшем из используемых объемов. Если изучаемое вещество вводится с диетой и вызывает снижение потребления пищи, может быть полезным использование второй контрольной группы для того, чтобы отличить снижение аппетита животных от токсикологических изменений экспериментальной модели.

3.4.4. При необходимости должны быть приняты во внимание следующие характеристики растворителя или других добавок: эффекты, оказывающие влияние на абсорбцию, распределение, метаболизм или накопление изучаемого вещества; эффекты, влияющие на химические свойства изучаемого вещества, которые могут изменять характеристики его токсичности; эффекты, влияющие на потребление пищи и воды или пищевой статус животных.

3.5. Исследование в сокращенном объеме

Если исследование одной дозы, эквивалентной как минимум 1 000 мг/кг массы тела/день, с использованием процедур, предусмотренных для 90-дневного изучения токсичности, не выявляет токсических эффектов, и если токсичность не ожидается исходя из данных о структурно родственных веществах, тогда полное исследование с тремя уровнями доз может рассматриваться как необязательное. В этих случаях проводят исследование вещества в сокращенном объеме, если только воздействие на людей не свидетельствует о необходимости тестирования более высокой дозы.

3.6. Введение доз

3.6.1. Животные должны получать изучаемое вещество ежедневно семь дней в неделю в течение 90 дней. Любой другой режим введения вещества, например, пять дней в неделю, нуждается в обосновании. Если изучаемое вещество вводят животным внутрижелудочно, вся доза должна быть введена в один прием с помощью желудочного зонда или подходящей интубационной канюли.

3.6.2. Максимальный объем жидкости, который может быть введен за один раз, зависит от размера экспериментальных животных. Вводимый объем не должен превышать 1 мл/100 г массы тела, за исключением водных растворов, которые допустимо вводить в объеме 2 мл/100 г массы тела.

3.6.3. Для изучаемых веществ, за исключением едких и раздражающих, у которых обычно при увеличении концентрации раздражающие эффекты усугубляются, вариабельность объема должна быть минимизирована подбором концентраций так, чтобы все дозы вводили в одном и том же объеме.

3.6.4. Для веществ, вводимых с диетой или питьевой водой, важно убедиться, что используемые количества изучаемого вещества не нарушают нормальное питание или водный баланс. Если изучаемое вещество вводят с диетой, может использоваться либо постоянная концентрация (ppm), либо постоянный уровень доз в переводе на вес тела животного. Выбор должен быть точно определен.

3.6.5. Для веществ, вводимых с помощью зонда, доза вещества должна вводиться каждый день в одно и то же время и устанавливаться в соответствии с необходимостью поддерживать постоянный уровень дозы в пересчете на массу тела животного. Если 90-дневное исследование проводится как предварительное к долговременному хроническому исследованию, в обоих исследованиях должны использоваться одинаковые диеты.

3.7. Наблюдение

3.7.1. Период наблюдения должен составлять 90 дней. Животные сателлитной группы, предназначенные для последующих наблюдений, должны содержаться в течение соответствующего периода без воздействия вещества для выявления отсроченного действия, длительности сохранения токсических эффектов или их исчезновения.

3.7.2. Общие клинические наблюдения должны проводиться, по крайней мере, один раз в день, желательно в одно и то же время, принимая во внимание период максимального проявления ожидаемых эффектов после введения вещества. Состояние животных должно быть зафиксировано. Не менее двух раз в день, обычно в начале и конце каждого дня, животных осматривают для выявления клинических симптомов или гибели.

3.7.3. По крайней мере, один раз перед первым введением вещества (для возможности внутригрупповых сравнений) и один раз в неделю после начала воздействия вещества должны быть проведены детальные клинические наблюдения всех животных. Наблюдения должны проводиться вне клетки, предпочтительно на стандартном месте и в одно и то же время дня.

3.7.4. Наблюдения должны быть тщательно зарегистрированы, предпочтительно с использованием систем оценок, четко оговоренных исследовательской лабораторией. Должны быть приняты меры для обеспечения минимальности различий в условиях наблюдения. Замеченные симптомы должны включать (не ограничиваясь этим): изменения кожи, шерсти, глаз, слизистых оболочек, наличие секреции и экскреции и автономной активности (например, слезотечение, пилоэрекция, размер зрачка, необычные типы дыхания); изменения в походке, позе, груммингу; наличие клонических или тонических движений, стереотипия (например, слишком интенсивный грумминг, повторяющиеся круговые движения) или странное поведение (например, самоповреждение, движение задом наперед).

3.7.5. Офтальмологическое исследование с использованием офтальмоскопа или соответствующего эквивалентного оборудования должно проводиться до начала введения изучаемого вещества и в конце эксперимента, предпочтительно у всех животных или, по крайней мере, в группе с наивысшей дозой и контрольной группе. Если в глазах обнаруживаются изменения, исследование должно быть проведено у всех животных.

3.7.6. К концу периода воздействия вещества, но в любом случае не ранее 11-й недели, должна быть изучена реакция животных на различные внешние стимулы (например, слуховые, зрительные и проприоцептивные), оценена мышечная сила и моторная активность. Описание процедур, которые могут проводиться, могут быть получены из соответствующих литературных источников. Вместе с тем могут также использоваться альтернативные процедуры, не приведенные в этих литературных источниках.

3.7.7. Функциональные исследования в конце эксперимента могут не проводиться, если данные о таких функциональных исследованиях известны из других экспериментов, а ежедневные клинические наблюдения не выявили каких-либо функциональных нарушений.

3.7.8. Как исключение, функциональные наблюдения могут также не проводиться в группах животных, в которых проявляются другие признаки токсичности вещества, причем степень их выраженности может существенно повлиять на проведение функциональных исследований.

3.8. Масса тела и потребление пищи/воды

3.8.1. Все животные должны быть взвешены не менее одного раза в неделю.

3.8.2. Измерения потребления пищи должны проводиться не менее одного раза в неделю. Если изучаемое вещество вводится с питьевой водой, потребление воды должно также измеряться, по крайней мере, еженедельно. Потребление воды может также учитываться в тех экспериментах с введением вещества с диетой или с помощью зонда, в которых может изменяться питьевая активность животных.

3.9. Гематология и клиническая биохимия

3.9.1. Образцы крови должны быть отобраны в запланированные периоды эксперимента, при необходимости сохраняться в соответствующих условиях. В конце исследования образцы крови отбирают непосредственно перед умерщвлением или как часть процедуры умерщвления животных.

3.9.2. Должны быть проведены следующие гематологические исследования крови, отобранной в конце или в течение эксперимента: гематокрит, концентрация гемоглобина, количество эритроцитов, общий лейкоцитоз и лейкоцитарная формула, количество тромбоцитов и время/потенциал свертываемости крови.

3.9.3. Клинические биохимические исследования для выявления основных токсических эффектов в тканях и, особенно, действие на почки и печень, должны проводиться в образцах крови, взятых у всех животных непосредственно перед умерщвлением или как часть процедуры умерщвления животных (за исключением животных, найденных агонизирующими и/или умерщвленных до завершения эксперимента). В течение эксперимента могут быть отобраны пробы крови для биохимических исследований, аналогично тому, как это делается для гематологических исследований.

3.9.4. Рекомендуется, чтобы животные голодали в течение ночи перед умерщвлением*. Анализы плазмы или сыворотки должны включать определение натрия, калия, глюкозы, общего холестерина, мочевины, креатинина, общего белка, альбумина и не менее двух ферментов - индикаторов гепатоцеллюлярных эффектов (таких как аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (ACT), щелочная фосфатаза, гамма-глютамилтранспептидаза и сорбитолдегидрогеназа). Измерения других ферментов (печеночного и иного происхождения) и желчных кислот, которые, при определенных обстоятельствах, могут дать полезную информацию, могут также быть включены в исследование. Определение дополнительных ферментов (печеночного или другого происхождения) и билирубина при определенных обстоятельствах может дать полезную информацию.

3.9.5. Дополнительно на последней неделе эксперимента могут быть проведены анализы мочи с использованием спланированных во времени сбора объемов мочи и определения таких ее показателей, как внешний вид, объем, осмотическое давление, удельный вес, pH, белок, глюкоза, кровь и клетки крови.

3.9.6. Кроме того, должны быть предусматрены исследования для выявления сывороточных маркеров общего повреждения тканей. Другие измерения, которые должны быть проведены, если известные свойства изучаемого вещества могут, или предположительно могут, изменить соответствующие метаболические профили, включают кальций, фосфаты, триглицериды натощак, специфические гормоны, метгемоглобин и холинэстеразу. Они могут определяться для химических веществ соответствующих классов или в каждом отдельном случае. Необходим гибкий подход, зависящий от вида животного и наблюдаемого/или ожидаемого эффекта того или иного соединения.

3.9.7. Если исходные ретроспективные данные недостаточны, должна быть рассмотрена необходимость определения вариабельности результатов гематологических и клинических биохимических исследований до начала введения животным изучаемого вещества; как правило, не рекомендуется, чтобы такие данные были получены до начала воздействия вещества.

3.10. Патология

Некропсия

3.10.1. Все экспериментальные животные должны быть подвергнуты полной, детальной некропсии, которая включает тщательное исследование наружной поверхности тела, всех отверстий и черепных, грудных, абдоминальных полостей и их содержимого. Печень, почки, надпочечники, семенники, эпидидимис, матка, яичники, тимус, селезенка, головной мозг и сердце всех животных (за исключением животных, найденных агонизирующими и/или умерщвленных до завершения эксперимента) должны быть соответствующим образом освобождены от прилежащих тканей, и их масса определена как можно скорее после диссекции для предупреждения высыхания.

3.10.2. Следующие ткани должны быть фиксированы в наиболее подходящей для обоих типов тканей фиксирующей среде и подвергнуты последующему гистопатологическому исследованию: все явные повреждения, головной мозг (репрезентативные области, включая большой мозг, мозжечок и продолговатый мозг/варолиев мост), спинной мозг (все три уровня: шейный, среднегрудной и поясничный), гипофиз, щитовидная железа, паращитовидные железы, тимус, пищевод, слюнные железы, желудок, тонкий и толстый кишечник (включая Пейеровы бляшки), печень, поджелудочная железа, почки, надпочечники, селезенка, сердце, трахея и легкие (консервированные вдуванием воздуха с фиксатором и затем иммерсией), аорта, гонады, матка, вспомогательные половые органы, молочные железы самок, простата, мочевой пузырь, желчный пузырь (мыши) лимфатические узлы (желательно один лимфатический узел вблизи пути введения вещества и еще один лимфатический узел, удаленный от пути введения вещества, для выявления системных эффектов), периферический нерв (седалищный или большеберцовый) желательно в непосредственной близости к мышце, срез костного мозга (и/или свежий пунктат костного мозга), кожа и глаза (если наблюдались изменения при офтальмологических исследованиях). Клинические и другие данные могут дать основание для изучения дополнительных тканей. Кроме того, должны быть фиксированы любые органы, которые могут оказаться критическими исходя из известных свойств изучаемого вещества.

Гистопатология

3.10.3. Полное гистопатологическое исследование должно быть проведено с фиксированными органами и тканями всех животных контрольной группы и всех животных, получавших максимальную дозу вещества. Исследование должно быть распространено и на всех животных, получавших вещество в других дозах, если у животных, получавших максимальную дозу, выявлены изменения, обусловленные воздействием изучаемого вещества.

3.10.4. Все макроскопические патологические изменения должны быть изучены.

3.10.5. Если использовалась сателлитная группа, гистопатологические исследования должны проводиться с тканями и органами, в которых выявлены изменения, вызванные воздействием изучаемого вещества.

4. Данные и отчет

4.1. Данные

4.1.1. Данные должны быть представлены для животных индивидуально. Дополнительно все данные обобщаются в табличной форме, где для каждой экспериментальной группы приводят число животных в начале исследования, число животных, найденных погибшими в течение эксперимента или умерщвленных из гуманных соображений с указанием времени гибели или умерщвления, число животных с выявленными признаками токсичности, описание наблюдавшихся признаков токсичности, включая время появления, продолжительность и тяжесть каждого токсического эффекта, число животных с выявленными патологическими изменениями, типы этих изменений и процент животных, у которых наблюдался каждый из типов патологических изменений.

4.1.2. Если возможно, количественные результаты должны быть оценены соответствующим и в целом приемлемым статистическим методом. Статистические методы и анализируемые данные должны выбираться при планировании эксперимента.

4.2. Отчет

Отчет о проведенных исследованиях должен включать следующую информацию.

Изучаемое вещество:

- физическая природа, чистота и физико-химические свойства;

- идентификационные данные.

Растворитель (если применялся):

- обоснование выбора растворителя, если это не вода.

Экспериментальные животные:

- вид и линия, использованные в эксперименте;

- число, возраст и пол животных;

- источник, условия содержания, диета и т.д.;

- индивидуальная масса животных в начале эксперимента.

Условия эксперимента:

- обоснование выбора уровней доз;

- детали технологии подготовки изучаемого вещества/приготовление диеты, полученные концентрации, стабильность и гомогенность препарата;

- детали введения изучаемого вещества;

- фактическая доза вещества (мг/кг массы/день), коэффициент пересчета концентраций изучаемого вещества в корме/питьевой воде (ppm) на фактическую дозу (мг/кг массы/день), если требуется;

- детали качества корма и воды.

Необязательные для изучения показатели:

- перечень изученных необязательных показателей.

Результаты:

- масса тела и изменения массы тела;

- потребление пищи и потребление воды, если требуется;

- данные о токсических реакциях в зависимости от пола и дозовых уровней, включая признаки токсичности;

- природа, тяжесть и длительность клинических проявлений (обратимых или необратимых);

- результаты офтальмологических исследований;

- сенсорная активность, оценка силы схвата и моторной активности (если требуется);

- гематологические исследования с соответствующими исходными уровнями;

- клинические биохимические исследования с соответствующими исходными уровнями;

- масса тела при умерщвлении, масса внутренних органов и относительная масса внутренних органов;

- данные некропсии;

- детальное описание всех гистопатологических изменений;

- данные абсорбции, если имеются;

- статистическая обработка результатов, при необходимости.

Обсуждение результатов.

Выводы.